Генетичните технологии, които навлязоха в човешкия живот в края на миналия век, промениха света ни до такава степен, че той вече е немислим без тях. Тези технологии успяха да навлязат и в криминалистиката; от десетилетия генетичната идентификация се използва като бърз и сравнително евтин метод, който позволява намирането на престъпници и разкриването на техните деяния, без да се напуска лабораторията. Като фармаколог по образование, аз се интересувам много от генетиката и нямам търпение да изуча тази област в различните ѝ аспекти. В тази публикация ще ви запозная с класическите генетични подходи в областта на криминалистиката.
Малко история или какво общо има тя с рицарите?
Преди 150 години Йоханес Фридрих Мишер открива нуклеиновите киселини - концепция, която в крайна сметка преобръща света с главата надолу [1]. Към средата на ХХ век става ясно, че ДНК и РНК са носители на наследствена информация; след това е описана структурата им, а малко по-късно се появяват множество методи, които позволяват тези молекули да бъдат "рязани" in vitro с помощта на клетъчни ензими - рестриктази [2]; да бъдат амплифицирани с помощта на PCR [3]; и дори да бъде разчетена последователността на конкретни гени и геноми с помощта на множество методи за секвениране [4].
Първоначално работата с генетичен материал се извършваше буквално "в кухнята" и невинаги можеше да бъде възпроизведена дори в съседната научна лаборатория. Но времето минаваше, подходите се променяха, а методите се стандартизираха до такава степен, че постепенно бяха въведени в приложните изследвания и дори в биотехнологичното производство.
През 1984 г. научната общност беше развълнувана от новината, че учените са успели да изолират и разчетат фрагмент от ДНК на зебрата на Бърчел, която е изчезнала и оцелява само в музейни колекции [5]. Година по-късно шведският генетик Сванте Пябо потвърждава възможността за използване на музеен и археологически материал за фундаментални научни изследвания, след като пръв анализира генетичния материал на египетски мумии. Години по-късно се оказва, че анализираните от него проби са били замърсени със съвременен генетичен материал [6], но развитието на методите за секвениране все пак дава възможност да се работи дори с минимални количества лошо запазена ДНК.
Криминалистите също проявяват интерес към новите техники за анализ на генетичния материал. Факт е, че методите на класическата дактилоскопия и анализ на кръвните групи, които бяха обичайни по това време, имаха своите ограничения, а в някои случаи се оказваха погрешни.
През 1984 г. британският учен сър Алек Джон Джефрис (фиг. 3) разработи и представи метод за идентифициране на човек с помощта на неговия генетичен материал. По-късно този подход е наречен ДНК идентификация и печели любовта и уважението на криминолозите по цял свят. За работата си Джефрис е посветен в рицарство.
Малко история или какво общо има тя с рицарите?
Преди 150 години Йоханес Фридрих Мишер открива нуклеиновите киселини - концепция, която в крайна сметка преобръща света с главата надолу [1]. Към средата на ХХ век става ясно, че ДНК и РНК са носители на наследствена информация; след това е описана структурата им, а малко по-късно се появяват множество методи, които позволяват тези молекули да бъдат "рязани" in vitro с помощта на клетъчни ензими - рестриктази [2]; да бъдат амплифицирани с помощта на PCR [3]; и дори да бъде разчетена последователността на конкретни гени и геноми с помощта на множество методи за секвениране [4].
Първоначално работата с генетичен материал се извършваше буквално "в кухнята" и невинаги можеше да бъде възпроизведена дори в съседната научна лаборатория. Но времето минаваше, подходите се променяха, а методите се стандартизираха до такава степен, че постепенно бяха въведени в приложните изследвания и дори в биотехнологичното производство.
През 1984 г. научната общност беше развълнувана от новината, че учените са успели да изолират и разчетат фрагмент от ДНК на зебрата на Бърчел, която е изчезнала и оцелява само в музейни колекции [5]. Година по-късно шведският генетик Сванте Пябо потвърждава възможността за използване на музеен и археологически материал за фундаментални научни изследвания, след като пръв анализира генетичния материал на египетски мумии. Години по-късно се оказва, че анализираните от него проби са били замърсени със съвременен генетичен материал [6], но развитието на методите за секвениране все пак дава възможност да се работи дори с минимални количества лошо запазена ДНК.
Криминалистите също проявяват интерес към новите техники за анализ на генетичния материал. Факт е, че методите на класическата дактилоскопия и анализ на кръвните групи, които бяха обичайни по това време, имаха своите ограничения, а в някои случаи се оказваха погрешни.
През 1984 г. британският учен сър Алек Джон Джефрис (фиг. 3) разработи и представи метод за идентифициране на човек с помощта на неговия генетичен материал. По-късно този подход е наречен ДНК идентификация и печели любовта и уважението на криминолозите по цял свят. За работата си Джефрис е посветен в рицарство.
ДНК дактилоскопия: предимства и недостатъци
Генетичният анализ на биологични проби, получени на местопрестъплението, значително улесни работата на разследващите. Сега те разполагат с надежден инструмент за идентифициране на извършителя или жертвата, за получаване на неопровержими доказателства и за разкриване на престъпления.
Основните предимства на генетичния дактилоскопичен анализ са възможността за работа дори с малки количества биологичен материал и високата точност, която позволява идентифицирането на даден индивид - ако са спазени всички изисквания за анализ, неговата надеждност надхвърля 99%. Този подход се е превърнал в един от най-важните при разследването на престъпления [7].
Важно е да се отбележи, че класическите методи за ДНК дактилоскопия не позволяват идентифицирането на еднояйчни близнаци, чийто генетичен профил е еднакъв, тъй като те са образувани от една и съща оплодена яйцеклетка.
За ДНК анализ е необходим преди всичко самият ДНК, но далеч не винаги е възможно да се извлече висококачествен генетичен материал от биологични проби, които са били изложени на химични и термични фактори. Веднъж попаднала в околната среда, тази молекула влиза в химични реакции, разрушава се (фрагментира се) и се модифицира, въпреки че при благоприятни условия може да се запази в продължение на хиляди години [8].
Известно е, че най-древният генетичен материал на човешките предци е извлечен от костните останки на нашите хуманоидни роднини, които са живели на територията на Иберийския полуостров (Сиера де Атапуерка) преди около 430 хил. години [9]. Специфичният микроклимат на някои пещери с ниски стойности на влажността и температурата значително увеличава живота на генетичния материал. Въпреки това ДНК в пробите, намерени на местопрестъплението, често е представена в минимални количества и, както и в археологическите проби, е силно деградирала.
В Европа и Съединените щати се обръща внимание на друг недостатък на генетичното дактилоскопиране, свързан с намесата в личния живот на човека и нарушаването на неприкосновеността на личния живот.
Защитниците на човешките права се опасяват, че генетичната информация на престъпници и заподозрени в престъпления може да попадне в ръцете на трети лица и след това да бъде използвана неправомерно [10]. Например вече са известни случаи на използване на генетична информация за контрол над мюсюлманските малцинства в китайската провинция Синдзян.
САЩ също планират систематично да събират ДНК профили на имигранти, намиращи се под федерален арест [11]. Очевидно е, че опасенията на правозащитниците не са безпочвени и имат реални основания.
Основните предимства на генетичния дактилоскопичен анализ са възможността за работа дори с малки количества биологичен материал и високата точност, която позволява идентифицирането на даден индивид - ако са спазени всички изисквания за анализ, неговата надеждност надхвърля 99%. Този подход се е превърнал в един от най-важните при разследването на престъпления [7].
Важно е да се отбележи, че класическите методи за ДНК дактилоскопия не позволяват идентифицирането на еднояйчни близнаци, чийто генетичен профил е еднакъв, тъй като те са образувани от една и съща оплодена яйцеклетка.
За ДНК анализ е необходим преди всичко самият ДНК, но далеч не винаги е възможно да се извлече висококачествен генетичен материал от биологични проби, които са били изложени на химични и термични фактори. Веднъж попаднала в околната среда, тази молекула влиза в химични реакции, разрушава се (фрагментира се) и се модифицира, въпреки че при благоприятни условия може да се запази в продължение на хиляди години [8].
Известно е, че най-древният генетичен материал на човешките предци е извлечен от костните останки на нашите хуманоидни роднини, които са живели на територията на Иберийския полуостров (Сиера де Атапуерка) преди около 430 хил. години [9]. Специфичният микроклимат на някои пещери с ниски стойности на влажността и температурата значително увеличава живота на генетичния материал. Въпреки това ДНК в пробите, намерени на местопрестъплението, често е представена в минимални количества и, както и в археологическите проби, е силно деградирала.
В Европа и Съединените щати се обръща внимание на друг недостатък на генетичното дактилоскопиране, свързан с намесата в личния живот на човека и нарушаването на неприкосновеността на личния живот.
Защитниците на човешките права се опасяват, че генетичната информация на престъпници и заподозрени в престъпления може да попадне в ръцете на трети лица и след това да бъде използвана неправомерно [10]. Например вече са известни случаи на използване на генетична информация за контрол над мюсюлманските малцинства в китайската провинция Синдзян.
САЩ също планират систематично да събират ДНК профили на имигранти, намиращи се под федерален арест [11]. Очевидно е, че опасенията на правозащитниците не са безпочвени и имат реални основания.
Как работи това
Методите за ДНК дактилоскопия се основават на човешката генетична изменчивост. Нуклеотидните замени в ДНК (в зависимост от честотата им в популацията те се наричат още ДНК полиморфизми или мутации) ни правят индивидуално различни. И тези различия могат да бъдат открити както в ядрения, така и в митохондриалния геном - малки кръгови молекули ДНК, които регулират функционирането на митохондриите, енергийните "фабрики" на клетките.
Трябва да се отбележи, че ДНК полиморфизмите могат да бъдат открити в генома на всеки от нас - те се превръщат в нашия уникален ДНК баркод. Някои от тях могат да предизвикат сериозни заболявания [12], но в повечето случаи не оказват влияние върху жизнените ни функции.
Съвременните методи за ДНК дактилоскопия използват различни генетични варианти в различни области на генома. Например анализът на тандемните повторения - кратки повтарящи се геномни последователности, чийто брой се различава при двама случайно избрани индивиди [13]- позволява да се направи ясен тест за бащинство или да се намерят допълнителни доказателства срещу заподозрян в престъпление.
Y-хромозомните ДНК маркери могат да се използват за определяне на пола на дадено лице. Генетичните маркери предоставят информация за етническата принадлежност на роднините на дадено лице, цвета на очите или на косата.
Освен това епигенетичната информация (например метилиране на ДНК) дава възможност да се оцени биологичната възраст на отделни клетки, тъкани и на организма като цяло [14]. В тази статия ще разкажа повече за горепосочените методи за генетичен анализ. А използването на епигенетичните методи в бизнеса с лекарства ще бъде предмет на следващата ми публикация.
Y-хромозомните ДНК маркери могат да се използват за определяне на пола на дадено лице. Генетичните маркери предоставят информация за етническата принадлежност на роднините на дадено лице, цвета на очите или на косата.
Освен това епигенетичната информация (например метилиране на ДНК) дава възможност да се оцени биологичната възраст на отделни клетки, тъкани и на организма като цяло [14]. В тази статия ще разкажа повече за горепосочените методи за генетичен анализ. А използването на епигенетичните методи в бизнеса с лекарства ще бъде предмет на следващата ми публикация.
Събиране и изолиране на ДНК от биологичен материал
Извличането и анализът на ДНК от криминалистични проби на пръв поглед е сравнимо с изкуство. Понякога е невъзможно да си представим, че няколко капки кръв или парченце кожа под ноктите на жертвата могат да се превърнат в най-важното доказателство в едно криминално разследване.
Всъщност действията на специалистите по криминалистика на местопрестъплението са прецизирани и следват един-единствен сценарий, една от основните цели на който е да се намери биологичен материал, подходящ за извличане на ДНК. За тази цел могат да се използват всякакви биологични тъкани и човешки секрети .
- Костни останки
- Зъби
- космени фоликули
- Кръв
- Епителни клетки
- Пот
- Слюнка
- Проби от сперматозоиди
- Екскременти и др.
Биоматериалите в склада за доказателства могат да издържат десетилетия. Често експертът взема само част от материала за изследване, толкова, колкото му е необходимо за извличане на ДНК. Например, ако по ножа има следи от кръв, експертът не отмива цялата кръв, а прави малко изплакване непосредствено преди извличането на ДНК. По този начин върху ножа остават следи, които могат да се използват за извършване на повторно изследване няколко десетилетия по-късно.
В клетъчното ядро ДНК е в тесен контакт с множество органични молекули, необходими за ефективното ѝ функциониране. За генетичен анализ обаче от изследваната проба трябва да бъдат отстранени въглехидрати, липиди и протеини, което може да намали ефективността на използваните методи и съответно да повлияе на разтворимостта на престъпленията.Екстракцията на ДНК отнема малко време благодарение на разнообразието от търговски комплекти и системи, специално предназначени за екстракция на нуклеинови киселини (напр. системата за екстракция на ДНК AutoMate Express на Thermo Fisher Scientific). Освен това в големите криминалистични центрове с хиляди анализи на ден този процес е напълно автоматизиран и се извършва с участието на роботи под наблюдението на оператор.
Между другото, роботизираните системи се използват широко не само в криминалистичните лаборатории, но и в много медицински и биотехнологични центрове, като позволяват да се ускори процесът, да се намали цената на работата и значително да се намали вероятността от грешки.
След екстракцията ДНК се разтваря в специална смес, където при необходимост може да се съхранява с години (при -20°C или -80°C).
Генетичен анализ
Непосредствено след екстракцията на ДНК пред специалиста стои въпросът за по-нататъшните начини за нейния анализ. От въвеждането на ДНК идентификацията в криминалистиката техниките на молекулярната биология са се променили толкова много, че съществуват няколко възможни варианта. В по-нататъшния ни разказ ще обърнем внимание на различните техники за ДНК анализ, които криминалистите използват в своята практика.
Полиморфизъм с дължина на рестрикционния фрагмент (RFLP анализ)
В исторически план RFLP анализът е един от първите методи за ДНК идентификация. Той се основава на използването на специални клетъчни ензими - рестриктази. Рестрикционните ензими могат да разпознават определени места в молекулата на нуклеиновата киселина и да я режат през тези места. Досега са описани няколко хиляди такива ензими. След разрязване на молекулата на DnA с рестрикционни ензими дължините на получените фрагменти се оценяват с помощта на гел-електрофореза (фигура 9).
Непосредствено след екстракцията на ДНК пред специалиста стои въпросът за по-нататъшните начини за нейния анализ. От въвеждането на ДНК идентификацията в криминалистиката техниките на молекулярната биология са се променили толкова много, че съществуват няколко възможни варианта. В по-нататъшния ни разказ ще обърнем внимание на различните техники за ДНК анализ, които криминалистите използват в своята практика.
Полиморфизъм с дължина на рестрикционния фрагмент (RFLP анализ)
В исторически план RFLP анализът е един от първите методи за ДНК идентификация. Той се основава на използването на специални клетъчни ензими - рестриктази. Рестрикционните ензими могат да разпознават определени места в молекулата на нуклеиновата киселина и да я режат през тези места. Досега са описани няколко хиляди такива ензими. След разрязване на молекулата на DnA с рестрикционни ензими дължините на получените фрагменти се оценяват с помощта на гел-електрофореза (фигура 9).
Тъй като не съществуват напълно идентични човешки геноми (с изключение на еднояйчни близнаци), разликата или сходството в получените профили на дължината на ДНК фрагментите може да бъде добър маркер както за лична идентификация, така и за определяне на родството.
Този метод обаче включва фрагментиране на ДНК и следователно е чувствителен към качеството и количеството на оригиналния генетичен материал. Ето защо понастоящем RFLP анализът не се използва на практика - за разлика от други методи, които ще бъдат разгледани по-долу.
Анализ на броя на тандемните повтори в генома
Тандемните повтори са копия на една и съща къса DnA последователност, повторени едно след друго [15]. Повторенията, които представляват интерес за криминалистите, включват локуси с различен брой тандемни повторения (VNTR) и къси тандемни повторения (STR). Те се наричат още съответно минисателити и микросателити.
Същността на този метод е PCR амплификация на ДНК фрагменти, съдържащи тези къси повтарящи се последователности, чиято дължина е различна при две случайно взети лица. След амплификацията дължината на получените фрагменти се оценява с помощта на гел-електрофореза или капилярна електрофореза.
За тази цел могат да се използват комплектът за количествено определяне на ДНК Quantifiler и системата QuantStudio на Termo Fisher Scientific. QuantStudio е компактен настолен уред с широк набор от функции.
Както и при предишния метод, основният идентифициращ фактор на STR анализа е дължината на получените фрагменти, която е уникална за всеки индивид и зависи от броя на повторенията в анализирания участък. STR-анализът се характеризира с висока точност и бързина, както и с ниска цена. Качеството на генетичния материал е важно условие за анализа.
Този метод обаче включва фрагментиране на ДНК и следователно е чувствителен към качеството и количеството на оригиналния генетичен материал. Ето защо понастоящем RFLP анализът не се използва на практика - за разлика от други методи, които ще бъдат разгледани по-долу.
Анализ на броя на тандемните повтори в генома
Тандемните повтори са копия на една и съща къса DnA последователност, повторени едно след друго [15]. Повторенията, които представляват интерес за криминалистите, включват локуси с различен брой тандемни повторения (VNTR) и къси тандемни повторения (STR). Те се наричат още съответно минисателити и микросателити.
Същността на този метод е PCR амплификация на ДНК фрагменти, съдържащи тези къси повтарящи се последователности, чиято дължина е различна при две случайно взети лица. След амплификацията дължината на получените фрагменти се оценява с помощта на гел-електрофореза или капилярна електрофореза.
За тази цел могат да се използват комплектът за количествено определяне на ДНК Quantifiler и системата QuantStudio на Termo Fisher Scientific. QuantStudio е компактен настолен уред с широк набор от функции.
Както и при предишния метод, основният идентифициращ фактор на STR анализа е дължината на получените фрагменти, която е уникална за всеки индивид и зависи от броя на повторенията в анализирания участък. STR-анализът се характеризира с висока точност и бързина, както и с ниска цена. Качеството на генетичния материал е важно условие за анализа.
STR-анализът се появява в практическата криминалистика преди почти двадесет години, но и до днес остава основен метод за идентифициране на лица. Резултатите от ДНК анализа на заподозрени и престъпници - генетичните профили - се въвеждат от криминолозите в специални бази данни.
Следователно, когато на местопрестъпленията се открият биологични следи, от които може да се изолира ДНК, става възможно да се идентифицират всички хора, които вече са попаднали в полезрението на правоприлагащите органи. Същите маркери се използват за издирване на изчезнали лица и за установяване на бащинство.
Следователно, когато на местопрестъпленията се открият биологични следи, от които може да се изолира ДНК, става възможно да се идентифицират всички хора, които вече са попаднали в полезрението на правоприлагащите органи. Същите маркери се използват за издирване на изчезнали лица и за установяване на бащинство.
По правило системите, предназначени за идентифициране на индивиди, позволяват анализ на няколко геномни локуса (10-24) едновременно, включително гена на протеина амелогенин, чрез който се определя полът. Генът на амелогенина се намира както на Х, така и на Y хромозомата, но се различава по размер, което позволява да се определи полът на човека.
Благодарение на използването на технологиите за секвениране с висока производителност криминалистиката получи ефективен инструмент, който откри нови възможности за едновременен анализ на множество участъци (локуси) от ядрения и митохондриалния геном.
Важно предимство на тези методи е възможността за разграничаване дори на еднояйчни близнаци (по соматични мутации), което е невъзможно при RFLP- или STR-анализа.
Благодарение на използването на технологиите за секвениране с висока производителност криминалистиката получи ефективен инструмент, който откри нови възможности за едновременен анализ на множество участъци (локуси) от ядрения и митохондриалния геном.
Важно предимство на тези методи е възможността за разграничаване дори на еднояйчни близнаци (по соматични мутации), което е невъзможно при RFLP- или STR-анализа.
Във втората част на тази публикация ще бъде описано как описаните по-горе методи могат да се използват за идентифициране на нарколаборатории и наркодилъри и как можете да объркате криминалистите, като заличите следите си.
Прочетете ЧАСТ II
