Резюме.
Провеждането на изследване на провъзпалителните ефекти на мефедрона и идентифицирането на неговите етиологични характеристики са задължителен етап в изследването на 4-MMC, който се счита за едно от най-популярните психоактивни вещества по отношение на развлекателната употреба. Прилагането, транспортирането и концентрацията на мефедрон в прицелните му тъкани зависи не само от приложената доза, но и от редица други фактори - разпределението на веществото, степента и скоростта на абсорбция, пътя на метаболизма и екскрецията. По време на изследването е важно да се определи делът на веществото, разпределено в целевите тъкани или биологичните течности, с които то се пренася, за да може да се установи каква част от приложеното вещество се подлага на биотрансформация и каква част попада в системното кръвообращение непроменена. Също така, на етапа на предклиничното изпитване, в допълнение към изучаването на основните механизми на действие, има нужда от голям фенотипен скрининг, необходим за задълбочено разбиране на фармакодинамиката и страничните ефекти на веществото. Един от важните аспекти на такъв скрининг е изследването на психоактивните свойства на веществото.
Цели на изследването.
1. Определяне на когнитивно-мотивационните и поведенческите модели при плъхове, на които се прилага 4-метилметакатинон.
2. Да се изследва ендотелната функция чрез провеждане на съдови фармакологични тестове с използване на блокада на NO-синтеза под ултразвуков контрол на скоростта на кръвния поток в бедрената артерия на плъха и лазерно доплерово флоуметрично наблюдение на общата хемодинамика и скоростта на микроциркулацията в медиалния мускул.
3. Да се определят и оценят провъзпалителните и имунорегулаторните активности на 4-метилметакатинона, като се използва моделът на оток на лапата, предизвикан от формалин, и тестът NBT.
Материали и методи.
Изследването е проведено върху 40 мъжки плъхове от породата Wistar с тегло 180-200 g. Определени са 4 групи: 1) Контролна група (интактни плъхове); 2) Плъхове, на които е прилаган мефедрон интраперитонеално на всеки 48 часа в доза 5 mg/kg, разтворена в разтвор на NaCl 0,9 (0,5 ml). 3) Плъхове, на които е прилаган перорално (през тръба) мефедрон на всеки 48 часа в доза 5 mg/kg, разтворен в разтвор на NaCl 0,9 (0,5 ml). 4) Плъхове, на които е прилаган мефедрон интраперитонеално на всеки 48 часа в доза 5 mg/kg, разтворени в разтвор на NaCl 0,9 (0,5 ml), преди прилагане на формалин за модел на оток на лапата, предизвикан от формалин.
Описание и обсъждане на изследването.
Определяне на когнитивните мотивационни и поведенчески модели при плъхове, на които е прилаган 4-метилметакатинон. За постигането на тази цел бяха формулирани следните задачи: да се оцени влиянието на 4-метилметакатинона върху нивото на възбуда, тревожност и устойчивост към стрес при плъхове. За да определим психоемоционалното състояние на изследваните животни, използвахме усъвършенстван протокол на теста на Хол, който включва поставяне на предмет на стандартизирана арена и регистриране на показателите за активност с помощта на софтуерния и хардуерния комплекс PANLAB Harvard Apparatus. Като единици за оценка бяха избрани дискретни поведенчески актове, регистрирани с помощта на софтуерния и хардуерния комплекс.
Изследването е проведено върху 30 плъха (съответно група 1, 2 и 3). Преди експеримента животните бяха отглеждани в лабораторен вивариум от 10 индивида в клетка, при неконвертиран 12-часов режим, при стайна температура 22-24 °C и влажност 60 %, на стандартна диета. Експериментите бяха проведени през лятото. Получените резултати бяха проверени за нормалност на разпределението с помощта на критерия на Шапиро-Уилк и обработени с методите на вариационната статистика с помощта на t-теста на Стюдънт и компютърния софтуерен пакет STATISTICA. На фигурата схематично е показан планът на експеримента. За оценка на проучвателното поведение бяха записани хоризонталната активност, реакцията на обгрижване, активността на търсене, локомоторната активност, уринирането и дефекацията. Експериментът беше проведен в затъмнена стая, изолирана от външни шумове и слънчева светлина, в период от 10 до 14 часа. Откритото поле представляваше квадратна площ с размери 150x150 cm и височина на страните 30 cm. Температурата в помещението се е поддържала на 23 градуса по Целзий. След всяко животно откритото поле се дезинфекцира, за да се обезмириси. Преди изследването на всяка група в откритото поле се пускаше по едно нулево животно.
На 21-ия ден плъховете бяха отстранени от експеримента. След анестезията на плъховете се извършва изолиране на дясната каротидна артерия върху фиксирана платформа, оголва се медиалния бедрен мускул и се катетеризира лявата бедрена вена. Многокомпонентното изследване на хемодинамичните параметри беше изследвано по метода на специализирани провокационни тестове, включващи въвеждане на ацетилхолин и натриев нитропрусид (NO) във феморалния катетър. Параметрите (систолично кръвно налягане, диастолично кръвно налягане, сърдечна честота) бяха записани с помощта на сензор TDS. Сензорът беше инсталиран над средната трета на дясната бедрена артерия и бяха записани следните показатели: максимална систолна (VS) и диастолна (VD) скорост, средна (QAs) и обемна (QAM) скорост на кръвния поток, индекс на пулсация (PL, индекс на Гослинг) и индекс на съпротивление (RI, индекс на Пурсело). За измерване на скоростта на кръвоносните клетки в съдовете на микроциркулаторното легло е използвана сонда-сензор с форма на игла, която е поставена в долната трета на широкия медиален мускул на бедрото. Вазоактивните агенти (ацетилхолин - 40 mcg/kg, натриев нитропрусид - 30 mcg/ kg) бяха инжектирани през катетър, поставен в лявата бедрена вена, последователно през интервал от 15 минути. По този начин имаше възможност за паралелно проследяване на хемодинамичните и микроциркулационните параметри в тристепенна система (централно кръвообращение - еластична съдова система - периферна съдова система). Статистическата обработка на резултатите беше извършена с помощта на софтуера STATISTICA 10. След това беше изчислен коефициентът на ендотелна дисфункция (QED). Статистическият анализ беше извършен с помощта на ранговия тест на Спирман, а изчисляването на надеждността между групите беше извършено с помощта на параметричния t-тест на Стюдънт.
Представените диаграми показват, че влиянието на мефедрона върху поведението на животните съответства на основните му ефекти, свързани с известния му механизъм на действие. Така диаграма 1 илюстрира значително повишаване на хоризонталната двигателна активност в сравнение с контролната група. Диаграма 2 показва, че действията по груминг са значително намалени. Това явление се дължи на намаляване на мотивационното влияние по отношение на настоящата потребност. Диаграма 3 ясно визуализира увеличаването на актовете на дефекация и уриниране, което е един от честите ефекти от приема на 4-mmc. Увеличаването на хоризонталната активност може да показва анксиолитични, анксиогенни, възбуждащи ефекти или увеличаване на двигателната активност без емоционален компонент (двигателна възбуда). Реакциите на обгрижване също могат да се тълкуват нееднозначно, тъй като честотата на действията на обгрижване се увеличава както в стресова, така и в благоприятна среда. Проявите на изследователска активност, както и честотата на уриниране и дефекация, могат да бъдат интерпретирани най-недвусмислено. Използвайки този алгоритъм, може да се заключи, че фармакодинамичният ефект по отношение на по-високата нервна активност може да се интерпретира като двигателна възбуда с емоционален компонент.
Контролната група демонстрира същия тип отговори на въвеждането на АХ и NO, които се изразяват в понижаване на систоличното, диастоличното и средното кръвно налягане, намаляване на линейната скорост на микроциркулацията, както и на диастоличната скорост на движение на кръвта във феморалната артерия (наричана по-нататък ФА), (показатели на данните - Vd, Vad); 2) увеличаване на систоличната скорост на движение на кръвта във ФА (VS, Vas), на индексите на Purcello и Gosling. Параметрите се възстановяват до първоначалните си стойности в рамките на 2 минути.
Допълнителна статистическа обработка беше извършена при определяне на броя на стойностите във времето за всяка проба, които бяха изразени в проценти. Критерият на Спирман, който беше използван за статистически анализ, показа най-добро изразяване на необходимата разлика в статистически важните параметри. Най-голяма степен на корелация (p<0,05) беше определена между индекса на средното артериално налягане (наричано по-нататък МАД), линейната скорост на микроциркулацията, систоличната скорост и разликата между систоличната и диастоличната скорост във феморалната артерия. Другите сонографски параметри показаха ниска и по-малко надеждна корелация с динамиката на артериалното налягане и скоростта на микроциркулацията. Изследването на перорално приложен 4-mmc показа статистически значимо повишаване на показателите на SAD, DAD и коефициента на ендотелна дисфункция (QED) в сравнение с контролната група. Показателите на максималната систолна (VS) и максималната диастолна скорост (VD) са значително намалени по време на провокационните тестове при плъховете от група 3, при които перорално е приложен мефедрон.
Ефективността на ендотел-зависимите релаксиращи фактори, освободени и активирани от приложението на ацетилхолин, е количествено и качествено намалена. NO-медиираният ефект в отговор на АХ провокационния тест намалява, поради негативния ефект на 4-mmc върху продукцията и експресията както на този фактор, така и върху активността на гуанилатциклазата. Индуцираната от АХХ ендотелно-зависима релаксация на микроциркулаторните съдове, медиирана чрез мускариновите рецептори, също се нарушава поради дегенерация на рецепторната активност, а също и поради намаляване на плътността на рецепторите по повърхността на ендотелиоцитите. Вероятно механизмът на намаляване на АХ-зависимата реакция на ендотела в отговор на употребата на мефедрон се дължи на значителното увеличаване на образуването на свободни радикали (супероксидни и хидроксилни) в хипоксично състояние на клетката, които взаимодействат с NO2 и NO3.
Наблюдава се статистически значимо намаляване на метаболитната активност на неутрофилите с 38,4% (Me = 13,1 с интерквартилен диапазон от 10,3 до 15,9 с разлика от 5,3 при p=0,002; z = 3,008) в сравнение с показателите на контролната група. При изследването на капацитета за абсорбция на фагоцитоза с добавяне на латекс показателите се увеличават от 13,1 Me до 16,5 Me, като процентното увеличение е 18,2 % за група 3 (интраперитонеално приложение), но процентната разлика в сравнение с контролната група е 18,0 %, което е значително и статистически достоверно доказателство за имуносупресивно действие. Също така е установено статистически значимо намаляване на спонтанната фагоцитоза при Група 3, която е намаляла с 25,3% (при p>0,0001, z=2,84) в сравнение с интактните животни.
Провеждането на изследване на провъзпалителните ефекти на мефедрона и идентифицирането на неговите етиологични характеристики са задължителен етап в изследването на 4-MMC, който се счита за едно от най-популярните психоактивни вещества по отношение на развлекателната употреба. Прилагането, транспортирането и концентрацията на мефедрон в прицелните му тъкани зависи не само от приложената доза, но и от редица други фактори - разпределението на веществото, степента и скоростта на абсорбция, пътя на метаболизма и екскрецията. По време на изследването е важно да се определи делът на веществото, разпределено в целевите тъкани или биологичните течности, с които то се пренася, за да може да се установи каква част от приложеното вещество се подлага на биотрансформация и каква част попада в системното кръвообращение непроменена. Също така, на етапа на предклиничното изпитване, в допълнение към изучаването на основните механизми на действие, има нужда от голям фенотипен скрининг, необходим за задълбочено разбиране на фармакодинамиката и страничните ефекти на веществото. Един от важните аспекти на такъв скрининг е изследването на психоактивните свойства на веществото.
Цели на изследването.
1. Определяне на когнитивно-мотивационните и поведенческите модели при плъхове, на които се прилага 4-метилметакатинон.
2. Да се изследва ендотелната функция чрез провеждане на съдови фармакологични тестове с използване на блокада на NO-синтеза под ултразвуков контрол на скоростта на кръвния поток в бедрената артерия на плъха и лазерно доплерово флоуметрично наблюдение на общата хемодинамика и скоростта на микроциркулацията в медиалния мускул.
3. Да се определят и оценят провъзпалителните и имунорегулаторните активности на 4-метилметакатинона, като се използва моделът на оток на лапата, предизвикан от формалин, и тестът NBT.
Материали и методи.
Изследването е проведено върху 40 мъжки плъхове от породата Wistar с тегло 180-200 g. Определени са 4 групи: 1) Контролна група (интактни плъхове); 2) Плъхове, на които е прилаган мефедрон интраперитонеално на всеки 48 часа в доза 5 mg/kg, разтворена в разтвор на NaCl 0,9 (0,5 ml). 3) Плъхове, на които е прилаган перорално (през тръба) мефедрон на всеки 48 часа в доза 5 mg/kg, разтворен в разтвор на NaCl 0,9 (0,5 ml). 4) Плъхове, на които е прилаган мефедрон интраперитонеално на всеки 48 часа в доза 5 mg/kg, разтворени в разтвор на NaCl 0,9 (0,5 ml), преди прилагане на формалин за модел на оток на лапата, предизвикан от формалин.
Описание и обсъждане на изследването.
Определяне на когнитивните мотивационни и поведенчески модели при плъхове, на които е прилаган 4-метилметакатинон. За постигането на тази цел бяха формулирани следните задачи: да се оцени влиянието на 4-метилметакатинона върху нивото на възбуда, тревожност и устойчивост към стрес при плъхове. За да определим психоемоционалното състояние на изследваните животни, използвахме усъвършенстван протокол на теста на Хол, който включва поставяне на предмет на стандартизирана арена и регистриране на показателите за активност с помощта на софтуерния и хардуерния комплекс PANLAB Harvard Apparatus. Като единици за оценка бяха избрани дискретни поведенчески актове, регистрирани с помощта на софтуерния и хардуерния комплекс.
Изследването е проведено върху 30 плъха (съответно група 1, 2 и 3). Преди експеримента животните бяха отглеждани в лабораторен вивариум от 10 индивида в клетка, при неконвертиран 12-часов режим, при стайна температура 22-24 °C и влажност 60 %, на стандартна диета. Експериментите бяха проведени през лятото. Получените резултати бяха проверени за нормалност на разпределението с помощта на критерия на Шапиро-Уилк и обработени с методите на вариационната статистика с помощта на t-теста на Стюдънт и компютърния софтуерен пакет STATISTICA. На фигурата схематично е показан планът на експеримента. За оценка на проучвателното поведение бяха записани хоризонталната активност, реакцията на обгрижване, активността на търсене, локомоторната активност, уринирането и дефекацията. Експериментът беше проведен в затъмнена стая, изолирана от външни шумове и слънчева светлина, в период от 10 до 14 часа. Откритото поле представляваше квадратна площ с размери 150x150 cm и височина на страните 30 cm. Температурата в помещението се е поддържала на 23 градуса по Целзий. След всяко животно откритото поле се дезинфекцира, за да се обезмириси. Преди изследването на всяка група в откритото поле се пускаше по едно нулево животно.
На 21-ия ден плъховете бяха отстранени от експеримента. След анестезията на плъховете се извършва изолиране на дясната каротидна артерия върху фиксирана платформа, оголва се медиалния бедрен мускул и се катетеризира лявата бедрена вена. Многокомпонентното изследване на хемодинамичните параметри беше изследвано по метода на специализирани провокационни тестове, включващи въвеждане на ацетилхолин и натриев нитропрусид (NO) във феморалния катетър. Параметрите (систолично кръвно налягане, диастолично кръвно налягане, сърдечна честота) бяха записани с помощта на сензор TDS. Сензорът беше инсталиран над средната трета на дясната бедрена артерия и бяха записани следните показатели: максимална систолна (VS) и диастолна (VD) скорост, средна (QAs) и обемна (QAM) скорост на кръвния поток, индекс на пулсация (PL, индекс на Гослинг) и индекс на съпротивление (RI, индекс на Пурсело). За измерване на скоростта на кръвоносните клетки в съдовете на микроциркулаторното легло е използвана сонда-сензор с форма на игла, която е поставена в долната трета на широкия медиален мускул на бедрото. Вазоактивните агенти (ацетилхолин - 40 mcg/kg, натриев нитропрусид - 30 mcg/ kg) бяха инжектирани през катетър, поставен в лявата бедрена вена, последователно през интервал от 15 минути. По този начин имаше възможност за паралелно проследяване на хемодинамичните и микроциркулационните параметри в тристепенна система (централно кръвообращение - еластична съдова система - периферна съдова система). Статистическата обработка на резултатите беше извършена с помощта на софтуера STATISTICA 10. След това беше изчислен коефициентът на ендотелна дисфункция (QED). Статистическият анализ беше извършен с помощта на ранговия тест на Спирман, а изчисляването на надеждността между групите беше извършено с помощта на параметричния t-тест на Стюдънт.
Представените диаграми показват, че влиянието на мефедрона върху поведението на животните съответства на основните му ефекти, свързани с известния му механизъм на действие. Така диаграма 1 илюстрира значително повишаване на хоризонталната двигателна активност в сравнение с контролната група. Диаграма 2 показва, че действията по груминг са значително намалени. Това явление се дължи на намаляване на мотивационното влияние по отношение на настоящата потребност. Диаграма 3 ясно визуализира увеличаването на актовете на дефекация и уриниране, което е един от честите ефекти от приема на 4-mmc. Увеличаването на хоризонталната активност може да показва анксиолитични, анксиогенни, възбуждащи ефекти или увеличаване на двигателната активност без емоционален компонент (двигателна възбуда). Реакциите на обгрижване също могат да се тълкуват нееднозначно, тъй като честотата на действията на обгрижване се увеличава както в стресова, така и в благоприятна среда. Проявите на изследователска активност, както и честотата на уриниране и дефекация, могат да бъдат интерпретирани най-недвусмислено. Използвайки този алгоритъм, може да се заключи, че фармакодинамичният ефект по отношение на по-високата нервна активност може да се интерпретира като двигателна възбуда с емоционален компонент.
Контролната група демонстрира същия тип отговори на въвеждането на АХ и NO, които се изразяват в понижаване на систоличното, диастоличното и средното кръвно налягане, намаляване на линейната скорост на микроциркулацията, както и на диастоличната скорост на движение на кръвта във феморалната артерия (наричана по-нататък ФА), (показатели на данните - Vd, Vad); 2) увеличаване на систоличната скорост на движение на кръвта във ФА (VS, Vas), на индексите на Purcello и Gosling. Параметрите се възстановяват до първоначалните си стойности в рамките на 2 минути.
Допълнителна статистическа обработка беше извършена при определяне на броя на стойностите във времето за всяка проба, които бяха изразени в проценти. Критерият на Спирман, който беше използван за статистически анализ, показа най-добро изразяване на необходимата разлика в статистически важните параметри. Най-голяма степен на корелация (p<0,05) беше определена между индекса на средното артериално налягане (наричано по-нататък МАД), линейната скорост на микроциркулацията, систоличната скорост и разликата между систоличната и диастоличната скорост във феморалната артерия. Другите сонографски параметри показаха ниска и по-малко надеждна корелация с динамиката на артериалното налягане и скоростта на микроциркулацията. Изследването на перорално приложен 4-mmc показа статистически значимо повишаване на показателите на SAD, DAD и коефициента на ендотелна дисфункция (QED) в сравнение с контролната група. Показателите на максималната систолна (VS) и максималната диастолна скорост (VD) са значително намалени по време на провокационните тестове при плъховете от група 3, при които перорално е приложен мефедрон.
Ефективността на ендотел-зависимите релаксиращи фактори, освободени и активирани от приложението на ацетилхолин, е количествено и качествено намалена. NO-медиираният ефект в отговор на АХ провокационния тест намалява, поради негативния ефект на 4-mmc върху продукцията и експресията както на този фактор, така и върху активността на гуанилатциклазата. Индуцираната от АХХ ендотелно-зависима релаксация на микроциркулаторните съдове, медиирана чрез мускариновите рецептори, също се нарушава поради дегенерация на рецепторната активност, а също и поради намаляване на плътността на рецепторите по повърхността на ендотелиоцитите. Вероятно механизмът на намаляване на АХ-зависимата реакция на ендотела в отговор на употребата на мефедрон се дължи на значителното увеличаване на образуването на свободни радикали (супероксидни и хидроксилни) в хипоксично състояние на клетката, които взаимодействат с NO2 и NO3.
Наблюдава се статистически значимо намаляване на метаболитната активност на неутрофилите с 38,4% (Me = 13,1 с интерквартилен диапазон от 10,3 до 15,9 с разлика от 5,3 при p=0,002; z = 3,008) в сравнение с показателите на контролната група. При изследването на капацитета за абсорбция на фагоцитоза с добавяне на латекс показателите се увеличават от 13,1 Me до 16,5 Me, като процентното увеличение е 18,2 % за група 3 (интраперитонеално приложение), но процентната разлика в сравнение с контролната група е 18,0 %, което е значително и статистически достоверно доказателство за имуносупресивно действие. Също така е установено статистически значимо намаляване на спонтанната фагоцитоза при Група 3, която е намаляла с 25,3% (при p>0,0001, z=2,84) в сравнение с интактните животни.
- При прилагане на мефедрон на опитните животни е регистрирана статистически значима промяна в анализираните поведенчески актове. Този факт показва наличието на специфична психотропна активност на това съединение, свързана с прекомерно повишени нива на възбуда и тревожност, обаче с намалена устойчивост към стрес. По този начин резултатите от изследването на този етап разшириха информацията за профила на действие на съединението. Наблюдаваните психотропни ефекти на 4-mmc задълбочават разбирането за неговата фармакологична активност и следва да бъдат обект на по-нататъшни проучвания.
- Трайно повишените параметри на кръвното налягане в началните състояния на плъхове от Група 3 (мефедрон), както и относителните им показатели след провокационни тестове, се дължат на нарушаване не само на експресията на NO (един от основните вазодилатационни фактори, регулиращи работата на микроциркулационните съдове), но и на простациклините и факторите на ендотелната хиперполяризация (EDHF). Резултатите от изследването на този етап потвърждават теоретичното предположение за прекомерния негативен ефект на мефедрона както върху ендотела на микроциркулаторните съдове, така и върху жизнеспособността на сърдечносъдовата система като цяло. Получените данни могат да се използват при планирането на предклинични проучвания за разширяване на спектъра от усложнения, свързани с употребата на 4-мс, както и за изграждане на алгоритъм от клинични препоръки за фармакологична корекция на тези усложнени състояния.
- Като се има предвид, че мефедронът вероятно намалява перфузионната пропускливост на клетъчната стена и транспортната функция на белтъците, влияе както върху пасивната и улеснената дифузия, така и върху активния транспорт, повлиява по определен начин когнитивните модели (включително забавените феномени), а също така има способността да влияе положително върху коагулационния компонент на хемостазата (хиперкоагулация), може да се предположи, че активността на COX-2 е преобладаваща като основен ензим, играещ роля в индуцирането на алтернативната фаза на възпалението. По този начин използването на селективни инхибитори на СОХ-2 за лечение на възпалителни заболявания при пациенти, използващи 4-mmc, е най-предпочитано и оправдано. Въпреки това за точното определяне на фармакологичното лечение, насочено към облекчаване на възпалителните процеси, свързани с употребата на 4-mmc, са необходими допълнителни предклинични проучвания.
- Резултатите от третия етап на изследването доказват намаляване на метаболитната и абсорбционната активност на неутрофилите при плъхове, принадлежащи към група 3 (интраперитонеално приложение на 4-mmc), в сравнение с показателите на животните от контролната група. Това определя мефедрона като вещество, което има имуносупресивен ефект. Този извод е основа за по-нататъшни изследвания на патогенетичната коригираща имунотерапия.
Last edited by a moderator: