Úvod
Sloupcová chromatografie je rozšířením chromatografie na tenké vrstvě (TLC). Předpokládá se, že čtenář má určité zkušenosti z laboratorní praxe a s tenkovrstvou chromatografií se již setkal. Namísto nanášení vzorku na tenkou vrstvu oxidu křemičitého nebo oxidu hlinitého se vzorek nanáší na válec s adsorbentem a rozpouštědlo se neustále přivádí pod tlakem, dokud složky z válce zcela neodtečou. Díky této úpravě lze složky nejen oddělit, ale i shromažďovat do různých nádob, což umožňuje přečištění směsí a oddělení léčiv se znečištěním. Kolonová chromatografie (známá také jako "blesková chromatografie") se často používá ve výzkumných zařízeních, o čemž svědčí její častý výskyt v procedurálních částech časopiseckých článků.
Procedurální diskuse
Pro sloupcovou chromatografii platí stejné základní principy chromatografie na tenké vrstvě (TLC). Ve skutečnosti se TLC provádí vždy před provedením kolonové chromatografie, aby se posoudila situace a určil správný poměr rozpouštědel. Pro dosažení dobré separace je ideální, pokud má požadovaná složka Rf kolem 0,35 (přečtěte si o Rf v tématu TLC) a je od ostatních složek oddělena alespoň 0,2 jednotkami Rf. Pokud jsou skvrny, které mají být odděleny, velmi blízko sebe (pokud je rozdíl v Rf < 0,2), je nejlepší, když má střed skvrny Rf 0,35. Rf blízko 0,35 je ideální, protože je dostatečně pomalé, aby mohlo dojít k vyrovnání stacionární a mobilní fáze, ale dostatečně rychlé, aby se minimalizovalo rozšíření pásů v důsledku difuze.
Existuje několik proměnných, které se nevztahují na TLC, ale které ovlivňují separaci složek v kolonové chromatografii. Patří mezi ně průměr kolony, množství použitého adsorbentu a průtok rozpouštědla. Obr. 1 ukazuje doporučení proměnných v závislosti na velikosti vzorku a stupni separace složek. Ve všech scénářích mají být kolony připraveny ve výšce 12,5-15 cm.
Existuje několik proměnných, které se nevztahují na TLC, ale které ovlivňují separaci složek v kolonové chromatografii. Patří mezi ně průměr kolony, množství použitého adsorbentu a průtok rozpouštědla. Obr. 1 ukazuje doporučení proměnných v závislosti na velikosti vzorku a stupni separace složek. Ve všech scénářích mají být kolony připraveny ve výšce 12,5-15 cm.
Například kolona o průměru 2,5 cm by měla být schopna přečistit přibližně 400 mg materiálu, pokud je separace dobrá (ΔRf > 0,2, třetí sloupec na obr. 1), nebo přibližně 160 mg, pokud je separace obtížná (ΔRf > 0,1). Kolonu by mělo být možné připravit a eluovat za použití přibližně 200 ml rozpouštědla a frakce lze sbírat přibližně po 10 ml roztoku.
Existuje více variant, jak kolonu fyzicky spustit. Jedním z velkých rozdílů v metodách je způsob přípravy kolony. Při metodě "suchého balení" se suchý oxid křemičitý nebo oxid hlinitý přidává přímo do kolony a rozpouštědlo se nechá po částech a pak pod tlakem protékat. Při metodě "mokrého balení" se kolona nejprve naplní rozpouštědlem, pak se do ní lehce protřepává suchý oxid křemičitý nebo oxid hlinitý a poté se plní tlakem. Při metodě "kalu" se rozpouštědlo přidá do oxidu křemičitého nebo oxidu hlinitého v Erlenmeyerově baňce, nalije se na kolonu jako kal a pak se naplní tlakem (tlak lze vytvořit injekční stříkačkou).
Je důležité vědět, že při přidávání rozpouštědla do oxidu křemičitého nebo oxidu hlinitého se uvolňuje teplo (mají exotermické rozpouštěcí teplo). V této části je uvedena metoda suspenze, přičemž hlavním důvodem je, že umožňuje, aby tento exotermický krok proběhl v Erlenmeyerově baňce místo na koloně. Pokud se teplo uvolní během balení kolony, může dojít ke vzniku bublin z varu rozpouštědla. Ty mohou narušit separaci kolony, pokud nejsou dostatečně odstraněny, a mohou způsobit prasknutí adsorpčního materiálu v koloně.
Existuje více variant, jak kolonu fyzicky spustit. Jedním z velkých rozdílů v metodách je způsob přípravy kolony. Při metodě "suchého balení" se suchý oxid křemičitý nebo oxid hlinitý přidává přímo do kolony a rozpouštědlo se nechá po částech a pak pod tlakem protékat. Při metodě "mokrého balení" se kolona nejprve naplní rozpouštědlem, pak se do ní lehce protřepává suchý oxid křemičitý nebo oxid hlinitý a poté se plní tlakem. Při metodě "kalu" se rozpouštědlo přidá do oxidu křemičitého nebo oxidu hlinitého v Erlenmeyerově baňce, nalije se na kolonu jako kal a pak se naplní tlakem (tlak lze vytvořit injekční stříkačkou).
Je důležité vědět, že při přidávání rozpouštědla do oxidu křemičitého nebo oxidu hlinitého se uvolňuje teplo (mají exotermické rozpouštěcí teplo). V této části je uvedena metoda suspenze, přičemž hlavním důvodem je, že umožňuje, aby tento exotermický krok proběhl v Erlenmeyerově baňce místo na koloně. Pokud se teplo uvolní během balení kolony, může dojít ke vzniku bublin z varu rozpouštědla. Ty mohou narušit separaci kolony, pokud nejsou dostatečně odstraněny, a mohou způsobit prasknutí adsorpčního materiálu v koloně.
Postupy krok za krokem
a ) TLC směsi ferrocen/acetylferrocen, b) Sloupcová chromatografie
Kolona vyobrazená v této části ukazuje čištění 0,20 g vzorku obsahujícího směs ferrocenu a acetylferrocenu (surová TLC je na obr. 2 a). Zhruba 8ml frakce byly shromážděny do malých zkumavek a bylo použito zhruba 400 ml eluentu.
Obr
a) TLC destička surové směsi ferrocen/acetylferrocen před elucí, b ) po eluci, c ) kolona s fritou, d ) kolona s bavlněným klínem na dně, e) kolona bez bavlněného klínu (před použitím by bylo třeba vložit).
a) TLC destička surové směsi ferrocen/acetylferrocen před elucí, b ) po eluci, c ) kolona s fritou, d ) kolona s bavlněným klínem na dně, e) kolona bez bavlněného klínu (před použitím by bylo třeba vložit).
Proveďte TLC
1) Proveďte TLC na vzorku, který má být přečištěn (obr. 3 a a b), abyste určili vhodné rozpouštědlo pro chromatografii. Požadovaná složka by měla mít Rf kolem 0,35 a v ideálním případě by měla být oddělena od všech ostatních skvrn alespoň o 0,2 Rf jednotky.
2 ) Připravte dávku eluentu, který dává správnou hodnotu Rf. Připravené množství závisí na množství vzorku, velikosti kolony a na tom, zda se plánuje změna složení rozpouštědla v polovině cesty. (Pokyny naleznete na obr. 1 a v eluotropické řadě naleznete trendy v "síle rozpouštědla").
2 ) Připravte dávku eluentu, který dává správnou hodnotu Rf. Připravené množství závisí na množství vzorku, velikosti kolony a na tom, zda se plánuje změna složení rozpouštědla v polovině cesty. (Pokyny naleznete na obr. 1 a v eluotropické řadě naleznete trendy v "síle rozpouštědla").
Příprava balené kolony
3 ) Pořiďte si vhodnou kolonu (viz obr. 1) a ujistěte se, že v blízkosti uzavíracího kohoutu je něco, co umožní průchod kapaliny, ale ne pevné látky. Kolony mohou mít sintrovaný disk (známý také jako "frita"), obr. 3 c), nebo zátku z vaty či skelné vaty, která zůstala po předchozím uživateli (obr. 3 d). Pokud není přítomen žádný disk ani zátka (obr. 3 e), zaklíněte do dna kolony pomocí dlouhé tyče malý chomáček vaty nebo skelné vaty.
a ) Nasypání oxidu křemičitého do výšky 12,5-15 cm v digestoři, b ) Nasypání oxidu křemičitého do Erlenmeyerovy baňky, c a d) Vytvoření suspenze.
Bezpečnostní upozornění: Práškový oxid křemičitý a oxid hlinitý dráždí plíce a v digestoři by se s nimi mělo vždy manipulovat opatrně. Rozsypaný prach by se měl zlikvidovat setřením mokrým papírovým ručníkem (pokud je mokrý, jemné částice jsou méně disperzní).
5) V digestoři nasypte adsorbent odměřený v koloně do Erlenmeyerovy baňky (obr. 4 b) a poté přidejte trochu eluentu (obr. 4 c). Vytvořte sypkou kaši vířením a mícháním skleněnou míchací tyčinkou (Obr.4 d), dokud není všechen adsorbent zcela vlhký, neuvolňují se bublinky plynu a konzistence je poněkud hustá, ale sypká.
a ) Nalití suspenze do kolony, b ) opláchnutí baňky, c ) adsorbent přilnutý ke stěnám kolony, d) opláchnutí ulpělého adsorbentu.
6 ) Pod sevřenou kolonu umístěte kádinku nebo Erlenmeyerovu baňku a otevřete kohout. Jedním rychlým pohybem roztočte a nalijte křemičitou nebo hlinitou suspenzi do kolony pomocí nálevky s velkým hrdlem (obr. 5 a). Okamžitě použijte další eluent k vypláchnutí zbytkové suspenze z Erlenmeyerovy baňky (obr. 5 b) a na kolonu.
7) Okamžitě opláchněte veškerý oxid křemičitý nebo hlinitý ze stěn zásobníku kolony pomocí eluentu a vířivého pohybu Pasteurovy pipety (obr. 5 c a d). Necháte-li adsorbent zaschnout, ulpí na skle a nepůjde snadno opláchnout.
7) Okamžitě opláchněte veškerý oxid křemičitý nebo hlinitý ze stěn zásobníku kolony pomocí eluentu a vířivého pohybu Pasteurovy pipety (obr. 5 c a d). Necháte-li adsorbent zaschnout, ulpí na skle a nepůjde snadno opláchnout.
a ) Pošťuchování sloupce za účelem odstranění vzduchových bublin, b) Přitlačení vzduchu, c ) Přidání písku, d) Opláchnutí písku ze stran.
8) Pevně zatřeste sloupcem pomocí korkového kroužku nebo kloubů prstů (obr. 6 a), abyste odstranili případné vzduchové bubliny ve sloupci (které by mohly způsobit špatnou separaci nebo praskání adsorbentu ve sloupci) a podpořili rovnoměrné usazování adsorbentu.
9) Mírným tlakem vzduchu na horní část kolony (Obr. 6 b) ji stlačte a přestaňte, když je hladina eluentu 1 cm od horní části kolony. Pokud je se vzduchovým vedením použit T-adaptér jako na obr. 6 b, lze jemné regulace průtoku vzduchu dosáhnout nastavením přítlačné svorky na gumové hadičce. Po celou dobu elučního procesu udržujte bílý sloupec adsorbentu vlhký, s hladinou eluentu nad horní částí oxidu křemičitého nebo oxidu hlinitého. Jemným přerušením těsnění přestaňte vyvíjet tlak a uzavřete uzavírací kohout, abyste zabránili dalšímu odkapávání kapaliny.
10 ) Přidejte tenkou vrstvu písku (obr. 6 c), vysokou přibližně 0,5 cm. Strany kolony opláchněte eluentem vířivým pohybem, aby se písek uvolnil ze stěn skla (obr. 6 d). Otevřete kohout a nechte kapalinu odkapávat, dokud není těsně nad vrstvou písku. Pokud kapání probíhá příliš pomalu, použijte tlak vzduchu.
9) Mírným tlakem vzduchu na horní část kolony (Obr. 6 b) ji stlačte a přestaňte, když je hladina eluentu 1 cm od horní části kolony. Pokud je se vzduchovým vedením použit T-adaptér jako na obr. 6 b, lze jemné regulace průtoku vzduchu dosáhnout nastavením přítlačné svorky na gumové hadičce. Po celou dobu elučního procesu udržujte bílý sloupec adsorbentu vlhký, s hladinou eluentu nad horní částí oxidu křemičitého nebo oxidu hlinitého. Jemným přerušením těsnění přestaňte vyvíjet tlak a uzavřete uzavírací kohout, abyste zabránili dalšímu odkapávání kapaliny.
10 ) Přidejte tenkou vrstvu písku (obr. 6 c), vysokou přibližně 0,5 cm. Strany kolony opláchněte eluentem vířivým pohybem, aby se písek uvolnil ze stěn skla (obr. 6 d). Otevřete kohout a nechte kapalinu odkapávat, dokud není těsně nad vrstvou písku. Pokud kapání probíhá příliš pomalu, použijte tlak vzduchu.
Přidejte vzorek
Jakmile je vzorek nanesen na kolonu, nastává závod s časem, protože difúze začne materiál rozšiřovat. Vzorek by se neměl nanášet, dokud nejste připraveni okamžitě a v celém rozsahu dokončit kolonku. Tento proces může trvat 15 až 90 minut! Používáte-li ke sběru frakcí zkumavky, měly by být zkumavky před přidáním vzorku uspořádány ve stojanu a výška kolony by měla být nastavena tak, aby se stojan se zkumavkami mohl zasunout pod ni.
a ) Rozpuštění pevné látky malým množstvím dichlormethanu, b) Nanesení vzorku, c ) Opláchnutí vzorku v baňce, d) Tlak, kterým se vzorek natlačí na kolonu těsně za vrstvu písku.
11) Pokud je surový vzorek kapalný, použijte jej přímo (přejděte ke kroku 13).
12 ) Pokud je surový vzorek v pevném stavu, proveďte jednu z následujících činností.
12 ) Pokud je surový vzorek v pevném stavu, proveďte jednu z následujících činností.
a) Ideální situace: pevnou látku rozpusťte v minimálním množství eluentu (maximálně několik ml).
b ) Pokud pevná látka není zvlášť rozpustná nebo se nerozpustí v několika ml eluentu, rozpusťte ji v minimálním množství dichlormethanu (nejvýše několik ml, obr. 7 a).
c) Pokud je pevná látka v eluentu nerozpustná, je možný i alternativní postup. Rozpusťte pevnou látku v baňce s kulatým dnem pomocí několika ml nízkovroucího rozpouštědla (např. dichlormethanu nebo acetonu). Do baňky se přidá přibližně 1 g oxidu křemičitého nebo oxidu hlinitého, poté se rozpouštědlo odstraní na rotační odparce, aby zůstala pevná látka, která obsahuje vzorek usazený na adsorbentu. Když je na plněné koloně centimetr eluentu (při použití této metody vynechte přidání vrstvy písku), nalijte vzorek naadsorbovaný oxidem křemičitým na kolonu pomocí nálevky se širokým hrdlem. Pokud na skle ulpí prach, opláchněte jej dalším eluentem (přejděte ke kroku 15).
13) Jemně přidejte vzorek do kolony pomocí pipety, přičemž kapalinu nebo roztok kapejte špičkou pipety přímo na písek co nejblíže, nikoli po stranách (obr. 7 b). Dbejte na to, abyste kapalinu nestříkali násilím tak, že by v písku nebo koloně oxidu křemičitého/hlinitého vznikly důlky.
14) Nádobku se vzorkem vypláchněte trochou rozpouštědla (nebo dichlormethanu, pokud jste jej použili, obr. 7 c) a výplach přidejte do kolony pomocí stejné pipety (abyste vypláchli i pipetu).
15) Otevřete uzavírací kohout a nechte kapalinu odkapávat, dokud se vzorek nedostane těsně za vrstvu písku (Obr. 7 d) do bílé oblasti kolony (pokud to trvá déle než 20 sekund, použijte tlak vzduchu).
16) Jemně opláchněte boky kolony vířivým pohybem pomocí 1-2 pipet plných eluentu, abyste opláchli případný rozstříknutý vzorek. Opět nechte kapalinu odkapávat (nebo použijte tlak vzduchu), dokud není vzorek zatlačen do bílého adsorbentu.
Opakujte krok oplachování, dokud si nebudete jisti, že je celý vzorek usazen na adsorbentu. Pokud se část vzorku stále nachází ve vrstvě písku, může se při přidání dalšího rozpouštědla rozpustit v eluentu, což povede ke ztrátě výtěžku. Pokud je sloučenina barevná, měl by být výplach zcela čirý.
14) Nádobku se vzorkem vypláchněte trochou rozpouštědla (nebo dichlormethanu, pokud jste jej použili, obr. 7 c) a výplach přidejte do kolony pomocí stejné pipety (abyste vypláchli i pipetu).
15) Otevřete uzavírací kohout a nechte kapalinu odkapávat, dokud se vzorek nedostane těsně za vrstvu písku (Obr. 7 d) do bílé oblasti kolony (pokud to trvá déle než 20 sekund, použijte tlak vzduchu).
16) Jemně opláchněte boky kolony vířivým pohybem pomocí 1-2 pipet plných eluentu, abyste opláchli případný rozstříknutý vzorek. Opět nechte kapalinu odkapávat (nebo použijte tlak vzduchu), dokud není vzorek zatlačen do bílého adsorbentu.
Opakujte krok oplachování, dokud si nebudete jisti, že je celý vzorek usazen na adsorbentu. Pokud se část vzorku stále nachází ve vrstvě písku, může se při přidání dalšího rozpouštědla rozpustit v eluentu, což povede ke ztrátě výtěžku. Pokud je sloučenina barevná, měl by být výplach zcela čirý.
a a b) Plnění zásobníku rozpouštědla, c a d) Vyplavování kolony.
Naplněníeluentem a eluce kolony
17) Jemně přidávejte další eluent pipetou (Obr. 8 a), vířivými pohyby po stranách a poté, když by vrstva písku již nebyla přídavky narušena, opatrně přilévejte větší množství (Obr. 8 b) připraveného eluentu tak, abyste naplnili zásobník (nebo jej naplňte tolik, kolik může být potřeba). Čistý eluent nashromážděný během plnění kolony lze znovu použít.
18 ) Pomocí tlaku vzduchu jemně a rovnoměrně eluujte vzorek přes kolonu (obr. 8 c a d). Čím vícekrát se tlak spustí a zastaví, tím je pravděpodobnější, že kolona může prasknout. Nejlepší je, pokud lze tlak udržovat po celou dobu jemně a rovnoměrně.
Optimální rychlost kapání během eluce závisí na velikosti kolony. Ideální průtok eluentu je, když rozpouštědlo ve válcové části kolony nad adsorbentem klesá rychlostí 5 cm za minutu. Proto by rychlost odkapávání měla být u úzké kolony nižší než u širší kolony. Rychlost odkapávání pro jednopalcovou kolonu by měla být taková, že jednotlivé kapky lze sotva rozlišit. Proud kapaliny vytékající z kohoutku při této velikosti kolony je mírně příliš rychlý.
18 ) Pomocí tlaku vzduchu jemně a rovnoměrně eluujte vzorek přes kolonu (obr. 8 c a d). Čím vícekrát se tlak spustí a zastaví, tím je pravděpodobnější, že kolona může prasknout. Nejlepší je, pokud lze tlak udržovat po celou dobu jemně a rovnoměrně.
Optimální rychlost kapání během eluce závisí na velikosti kolony. Ideální průtok eluentu je, když rozpouštědlo ve válcové části kolony nad adsorbentem klesá rychlostí 5 cm za minutu. Proto by rychlost odkapávání měla být u úzké kolony nižší než u širší kolony. Rychlost odkapávání pro jednopalcovou kolonu by měla být taková, že jednotlivé kapky lze sotva rozlišit. Proud kapaliny vytékající z kohoutku při této velikosti kolony je mírně příliš rychlý.
Obr
a-c) Sběr frakcí, d ) Průběh kolony
a-c) Sběr frakcí, d ) Průběh kolony
Sběr frakcí
19 ) Ihned začněte sbírat eluční kapalinu do zkumavek na stojanu (obr. 9 a). Doporučení ohledně objemů, které se mají sbírat do jednotlivých zkumavek, viz obr. 1.20) Jakmile se naplní první zkumavka nebo pokud byla nasbírána určitá výška kapaliny podle doporučení školitele nebo podle Obr.1, přesuňte stojan a začněte sbírat do jiné zkumavky (Obr.9 b a c). Zkumavky naplňte a udržujte je na stojanu v pořadí.
Tyto různé zkumavky se nazývají "frakce". Cílem kolony je sbírat dostatečně malé frakce, aby většina (nebo některé) frakce obsahovaly čistý materiál. Pokud je separace směsi obtížná (pokud je ΔRf složek nízký), může být nejlepší sbírat malé frakce (např. z poloviny naplněné zkumavky).
Tyto různé zkumavky se nazývají "frakce". Cílem kolony je sbírat dostatečně malé frakce, aby většina (nebo některé) frakce obsahovaly čistý materiál. Pokud je separace směsi obtížná (pokud je ΔRf složek nízký), může být nejlepší sbírat malé frakce (např. z poloviny naplněné zkumavky).
a-c ) Oplachovací materiál rozstříknutý na špičku kolony, d ) Studenti, kteří vedou kolonu.
21) Jak kapalina odtéká z kolony, často se rozstříkne na vnější strany hrotu kolony, a když se rozpouštědlo odpaří, můžete na hrotu vidět prstenec materiálu (uvidíte prstenec pevné látky, pokud je složka pevná jako na obr. 10 b, nebo olejové kapičky, pokud je složka kapalná). Pokud jsou složky barevné, měl by se hrot kolony opláchnout (obr. 10 c), když se zdá, že se jedna složka zcela eluovala, a předtím, než se přiblíží druhá složka.
22 ) Pravidelně sledujte hladinu eluentu a doplňte ji dříve, než klesne pod vrstvu písku.
22 ) Pravidelně sledujte hladinu eluentu a doplňte ji dříve, než klesne pod vrstvu písku.
a) Eluce, b ) Přidání ethylacetátu pro zvýšení polarity rozpouštědla, c ) Hladina rozpouštědla se blíží k vrstvě písku, d) Doplnění.
Případné zvýšení polarity rozpouštědla
23) V celé koloně lze použít jeden eluent, zejména pokud mají separované složky podobné hodnoty Rf. Pokud však mají složky velmi rozdílné hodnoty Rf, lze polaritu rozpouštědla zvýšit poté, co se jedna složka eluuje z kolony (obr. 11 a).
Zvýšení polarity rozpouštědla způsobí, že se složky budou pohybovat "rychleji". Existuje několik důvodů, proč je rychlejší eluce žádoucí. Zaprvé, pokud již jedna složka opustila kolonu, kolona již svou práci se separací vykonala, takže urychlení procesu neovlivní čistotu shromážděných frakcí. Za druhé, čím déle bude kolona pracovat, tím širší budou pásy složek (v důsledku difuze) a při sběru širokého pásma materiálu se spotřebuje (a vyplýtvá) velké množství rozpouštědla.
Zvýšení polarity rozpouštědla způsobí, že se složky budou pohybovat "rychleji". Existuje několik důvodů, proč je rychlejší eluce žádoucí. Zaprvé, pokud již jedna složka opustila kolonu, kolona již svou práci se separací vykonala, takže urychlení procesu neovlivní čistotu shromážděných frakcí. Za druhé, čím déle bude kolona pracovat, tím širší budou pásy složek (v důsledku difuze) a při sběru širokého pásma materiálu se spotřebuje (a vyplýtvá) velké množství rozpouštědla.
Obsahuje částečný seznam eluotropických řad, seznam běžných rozpouštědel seřazených podle jejich "rozpouštěcí síly" v normální fázové chromatografii. Polárnější rozpouštědlo způsobuje nejdramatičtější nárůst Rf
24) Pro zvýšení polarity rozpouštědla lze polární rozpouštědlo nakapat přímo do eluentu na zásobníku kolony (obr. 11 b). Například při použití směsi hexanů a ethylacetátu se přidáním čistého ethylacetátu do eluentu, který je právě v zásobníku, zvýší jeho polarita. Pokud je hladina eluentu nízká, bylo by možné připravit roztok, který by obsahoval vyšší procento polárnější složky. Například pokud se na koloně nejprve používala směs hexanů a ethylacetátu v poměru 4:1, použitím směsi v poměru 1:1 by se dosáhlo polárnějšího rozpouštědla.
25 ) Eluujte kolonu polárnějším rozpouštědlem jako předtím a vždy nezapomeňte sledovat hladinu eluentu a doplňte ji (obr. 11 d) dříve, než klesne pod vrstvu písku.
26) Chcete-li zvýšit polaritu rozpouštědla, můžete polární rozpouštědlo nakapat přímo do eluentu na nádržce kolony (obr. 11 b). Například při použití směsi hexanů a ethylacetátu se přidáním čistého ethylacetátu do eluentu, který je právě v zásobníku, zvýší jeho polarita. Pokud je hladina eluentu nízká, bylo by možné připravit roztok, který by obsahoval vyšší procento polárnější složky. Například pokud se na koloně nejprve používala směs hexanů a ethylacetátu v poměru 4:1, použitím směsi v poměru 1:1 by se dosáhlo polárnějšího rozpouštědla.
27) Eluujte kolonu polárnějším rozpouštědlem jako předtím a vždy nezapomeňte sledovat hladinu eluentu a doplňte ji (obr. 11 d) dříve, než klesne pod vrstvu písku.
25 ) Eluujte kolonu polárnějším rozpouštědlem jako předtím a vždy nezapomeňte sledovat hladinu eluentu a doplňte ji (obr. 11 d) dříve, než klesne pod vrstvu písku.
26) Chcete-li zvýšit polaritu rozpouštědla, můžete polární rozpouštědlo nakapat přímo do eluentu na nádržce kolony (obr. 11 b). Například při použití směsi hexanů a ethylacetátu se přidáním čistého ethylacetátu do eluentu, který je právě v zásobníku, zvýší jeho polarita. Pokud je hladina eluentu nízká, bylo by možné připravit roztok, který by obsahoval vyšší procento polárnější složky. Například pokud se na koloně nejprve používala směs hexanů a ethylacetátu v poměru 4:1, použitím směsi v poměru 1:1 by se dosáhlo polárnějšího rozpouštědla.
27) Eluujte kolonu polárnějším rozpouštědlem jako předtím a vždy nezapomeňte sledovat hladinu eluentu a doplňte ji (obr. 11 d) dříve, než klesne pod vrstvu písku.
a) Původní TLC destička, b ) Frakce shromážděné kolonou, c) Frakce vyfiltrované na TLC destičku, d) Vizualizovaná TLC destička se vzorky jednotlivých frakcí.
Vyhledání a koncentrace požadované složky
28 ) Při hledání požadované složky ve frakcích ve zkumavce je užitečné pochopit vztah mezi Rf a pořadím eluce v kolonové chromatografii.Při sloupcové chromatografii je vzorek nanesen v čele kolony a eluován dolů, zatímco při tenkovrstvé chromatografii je vzorek nanesen na dno destičky a eluován nahoru. Proto si lze kolonu představit jako obrácenou TLC desku. Sloučenina s vyšším Rf vyteče "rychleji", což znamená, že na TLC desce skončí výše a bude sloupcem zachycena jako první. V koloně vyobrazené v této části je složka s nižším Rf (oranžová na TLC desce na obr. 13 a) složkou, která se z kolony sbírá jako druhá.
29) Nejprve určete, které zkumavky obsahují rozpuštěnou sloučeninu.
29) Nejprve určete, které zkumavky obsahují rozpuštěnou sloučeninu.
a ) Na TLC destičku označenou čísly frakcí odpovídajícími pořadí, v jakém byly odebrány (obr. 13 c), naneste vzorek každé frakce. V případě, že jsou frakce zředěné, může být nejvhodnější umístit každý vzorek 2-3krát nad sebe.
b) Pokud bylo odebráno mnoho frakcí, takže váháte, zda odebrat vzorek z každé frakce, je jednou z metod identifikace bezbarvých frakcí, které mohou obsahovat sloučeninu, hledání náznaku zbytků vedoucích zkumavky. Po odpaření někdy zůstává na horní části zkumavky pevný zbytek (obr. 13) nebo olejovité kapičky, z nichž je zřejmé, že tyto frakce obsahují více než jen rozpouštědlo. Odeberte vzorky všech frakcí v blízkosti zkumavek, které obsahují viditelný zbytek.
c) Vizualizujte skvrnitou TLC destičku pomocí UV světla a/nebo barviva, abyste určili, které frakce obsahují sloučeninu (obr. 13 d).
a ) Eluční TLC destičky frakcí obsahujících možnou sloučeninu, b ) Spojování frakcí, c) Proplachování zkumavky s frakcí
28) Proveďte TLC všech frakcí, které obsahují sloučeninu, přičemž na 2,5 cm širokou TLC desku naneste až pět vzorků. K tomuto účelu lze použít širší TLC desky, pokud jsou k dispozici.
29 ) Identifikujte sloučeninu s požadovaným Rf porovnáním s původní surovou TLC destičkou. Rozhodněte se ponechat si frakce, které mají požadovanou sloučeninu v čisté formě, jak dokládá eluovaná TLC destička. Například pokud je na obr. 15 a požadována sloučenina s vyšším Rf, měly by být ponechány frakce 6-10.
30 ) Spojte čisté frakce do vhodně velké baňky s kulatým dnem (ne více než z poloviny naplněné, obr. 15 b). Každou zkumavku vypláchněte malým množstvím eluentu (nebo jiného rozpouštědla, pokud je problémem rozpustnost) a přidejte výplach do baňky s kulatým dnem (obr. 15 c).
31 ) Odpařte rozpouštědlo na rotační odparce, aby v baňce zůstala přečištěná sloučenina.
29 ) Identifikujte sloučeninu s požadovaným Rf porovnáním s původní surovou TLC destičkou. Rozhodněte se ponechat si frakce, které mají požadovanou sloučeninu v čisté formě, jak dokládá eluovaná TLC destička. Například pokud je na obr. 15 a požadována sloučenina s vyšším Rf, měly by být ponechány frakce 6-10.
30 ) Spojte čisté frakce do vhodně velké baňky s kulatým dnem (ne více než z poloviny naplněné, obr. 15 b). Každou zkumavku vypláchněte malým množstvím eluentu (nebo jiného rozpouštědla, pokud je problémem rozpustnost) a přidejte výplach do baňky s kulatým dnem (obr. 15 c).
31 ) Odpařte rozpouštědlo na rotační odparce, aby v baňce zůstala přečištěná sloučenina.
a ) Použití tlaku vzduchu k vysušení kolony, b ) Nechání kolony vyschnout dnem vzhůru, c) Shromáždění odpadního oxidu křemičitého.
Vyčištění kolony
32 ) K vysušení kolony použijte tlak vzduchu k odvedení většiny eluentu z kolony do odpadní nádoby. Poté kolonu dále vysušte jednou z těchto metod.
a) Nechte připojený mírný proud vzduchu proudit kolonou, abyste ji dále vysušili, zatímco budete čistit ostatní věci (obr. 16 a).
b ) Kolonu upněte dnem vzhůru nad velkou odpadní kádinku v digestoři, aby adsorbent po vysušení spadl (obr. 16 b). To bude trvat dlouho (do další vyučovací hodiny), ale je to jedna z možností.
33 ) Po vyschnutí lze adsorbent vysypat z kolony do odpadní nádoby v digestoři (obr. 16 c).
Bezpečnostní poznámka: Práškové adsorbenty dráždí plíce a jejich nebezpečnost se zvyšuje, pokud kolona obsahuje zbytky sloučenin, které se nyní mohou dostat do plic. Sypání práškového oxidu křemičitého nebo oxidu hlinitého by se mělo vždy provádět v digestoři.
34 ) Jakmile se většina adsorbentu shromáždí v odpadní nádobě, použijte vodu k opláchnutí všech zbytků pevných látek do dřezu a poté sloupec opláchněte acetonem do odpadní kádinky. Dále vyčistěte kolonu vodou a mýdlem a vysušte ji s oddělenými částmi kohoutů.
Bezpečnostní poznámka: Práškové adsorbenty dráždí plíce a jejich nebezpečnost se zvyšuje, pokud kolona obsahuje zbytky sloučenin, které se nyní mohou dostat do plic. Sypání práškového oxidu křemičitého nebo oxidu hlinitého by se mělo vždy provádět v digestoři.
34 ) Jakmile se většina adsorbentu shromáždí v odpadní nádobě, použijte vodu k opláchnutí všech zbytků pevných látek do dřezu a poté sloupec opláchněte acetonem do odpadní kádinky. Dále vyčistěte kolonu vodou a mýdlem a vysušte ji s oddělenými částmi kohoutů.
Řešení problémů
Vkoloně se objevují vzduchové bubliny
Vzduchová bublina je prázdná kapsa, ve které nedochází k vyrovnání stacionární a mobilní fáze, takže se složky pohybují kolem vzduchové bubliny rychleji, než by měly. To může vést k nerovnoměrným elučním pásům, které mohou způsobit překrývání, pokud je separace směsi obtížná (pokud mají složky velmi blízké hodnoty Rf, jako na obr. 17).
Pokud se v koloně objeví vzduchové bubliny a písek nebo vzorek ještě nebyl nanesen, pořádně kolonou během balení zatřeste, abyste odstranili všechny vzduchové bubliny. Pokud se bublinky nepohnou, obraťte se na instruktora, protože jste možná přistupovali k úkolu příliš jemně. Pokud již byl písek nebo vzorek nanesen, je nejlepší nechat kolonu tak, jak je, a doufat, že vzduchové bubliny neovlivní separaci.
Pásma se eluují nerovnoměrně
Pokud jsou složky směsi barevné, může být zřejmé, že pásy eluují křivě. To je s největší pravděpodobností způsobeno tím, že kolona je upnuta mírně šikmo. Pokud je kolona upnuta šikmo, složky budou putovat šikmo (obr. 18). To může způsobit problémy s oddělením, pokud mají součásti podobný Rf.
Tento problém nelze vyřešit uprostřed sloupce, ale pokud mají součásti velmi rozdílné hodnoty Rf, nemusí mít šikmé pásy na separaci žádný vliv. V budoucnu nezapomeňte zkontrolovat, zda je sloupec dokonale svislý ve směru ze strany na stranu i zepředu dozadu.
Last edited by a moderator:
