Genetické technologie, které vtrhly do lidského života na konci minulého století, změnily náš svět do té míry, že si jej bez nich již nedovedeme představit. Těmto technologiím se podařilo proniknout i do kriminalistiky; již desítky let se genetická identifikace používá jako rychlá a relativně levná metoda, která umožňuje najít zločince a vyřešit jejich činy, aniž by opustili laboratoř. Jako vystudovaný farmakolog se o genetiku velmi zajímám a s chutí studuji tento obor v jeho různých aspektech. V této publikaci vás seznámím s klasickými genetickými přístupy v oblasti kriminalistiky.
Trochu historie aneb co to má společného s rytíři?
Před 150 lety Johannes Friedrich Miescher objevil nukleové kyseliny, což byl pojem, který nakonec převrátil svět naruby [1]. V polovině 20. století už bylo jasné, že DNA a RNA jsou nositeli dědičné informace, poté byla popsána jejich struktura a o něco později se objevily četné metody, které umožnily tyto molekuly "řezat" in vitro pomocí buněčných enzymů - restriktáz [2], amplifikovat je pomocí PCR [3] a dokonce přečíst sekvenci konkrétních genů a genomů pomocí mnoha metod sekvenování [4].
Zpočátku se práce s genetickým materiálem prováděla doslova "v kuchyni" a nemohla být vždy reprodukována ani v sousední vědecké laboratoři. Čas však plynul, přístupy se měnily a metody se standardizovaly do té míry, že se postupně dostaly do aplikovaného výzkumu, a dokonce i do biotechnologické výroby.
V roce 1984 rozvířila vědeckou komunitu zpráva, že se vědcům podařilo izolovat a přečíst fragment DNA zebry Burchellovy, která vyhynula a přežívá pouze v muzejních sbírkách [5]. O rok později potvrdil možnost využití muzejního a archeologického materiálu pro základní vědecký výzkum švédský genetik Svante Pääbo, který jako první analyzoval genetický materiál egyptských mumií. Po letech se ukázalo, že jím analyzované vzorky byly kontaminovány moderním genetickým materiálem [6], ale rozvoj sekvenačních metod přesto umožnil pracovat i s minimálním množstvím špatně zachovalé DNA.
O nové techniky analýzy genetického materiálu se zajímali i kriminalisté. Faktem je, že metody klasické daktyloskopie a analýzy krevních skupin, které byly v té době obvyklé, měly svá omezení a v některých případech se míjely účinkem.
V roce 1984 britský vědec sir Alec John Jeffreys (obr. 3) vyvinul a představil metodu identifikace osoby pomocí jejího genetického materiálu. Později byl tento přístup nazván identifikací DNA a získal si lásku a respekt kriminalistů na celém světě. Jeffreys byl za svou práci povýšen do rytířského stavu.
Trochu historie aneb co to má společného s rytíři?
Před 150 lety Johannes Friedrich Miescher objevil nukleové kyseliny, což byl pojem, který nakonec převrátil svět naruby [1]. V polovině 20. století už bylo jasné, že DNA a RNA jsou nositeli dědičné informace, poté byla popsána jejich struktura a o něco později se objevily četné metody, které umožnily tyto molekuly "řezat" in vitro pomocí buněčných enzymů - restriktáz [2], amplifikovat je pomocí PCR [3] a dokonce přečíst sekvenci konkrétních genů a genomů pomocí mnoha metod sekvenování [4].
Zpočátku se práce s genetickým materiálem prováděla doslova "v kuchyni" a nemohla být vždy reprodukována ani v sousední vědecké laboratoři. Čas však plynul, přístupy se měnily a metody se standardizovaly do té míry, že se postupně dostaly do aplikovaného výzkumu, a dokonce i do biotechnologické výroby.
V roce 1984 rozvířila vědeckou komunitu zpráva, že se vědcům podařilo izolovat a přečíst fragment DNA zebry Burchellovy, která vyhynula a přežívá pouze v muzejních sbírkách [5]. O rok později potvrdil možnost využití muzejního a archeologického materiálu pro základní vědecký výzkum švédský genetik Svante Pääbo, který jako první analyzoval genetický materiál egyptských mumií. Po letech se ukázalo, že jím analyzované vzorky byly kontaminovány moderním genetickým materiálem [6], ale rozvoj sekvenačních metod přesto umožnil pracovat i s minimálním množstvím špatně zachovalé DNA.
O nové techniky analýzy genetického materiálu se zajímali i kriminalisté. Faktem je, že metody klasické daktyloskopie a analýzy krevních skupin, které byly v té době obvyklé, měly svá omezení a v některých případech se míjely účinkem.
V roce 1984 britský vědec sir Alec John Jeffreys (obr. 3) vyvinul a představil metodu identifikace osoby pomocí jejího genetického materiálu. Později byl tento přístup nazván identifikací DNA a získal si lásku a respekt kriminalistů na celém světě. Jeffreys byl za svou práci povýšen do rytířského stavu.
DNA daktyloskopie: výhody a nevýhody
Genetická analýza biologických vzorků získaných na místech činu výrazně zjednodušila práci vyšetřovatelů. Ti nyní mají k dispozici spolehlivý nástroj pro identifikaci pachatele nebo oběti, získání nezvratných důkazů a vyřešení trestných činů.
Hlavními výhodami genetické daktyloskopie je možnost pracovat i s malým množstvím biologického materiálu a vysoká přesnost, která umožňuje identifikaci jedince - pokud jsou splněny všechny požadavky na analýzu, její spolehlivost přesahuje 99 %. Tento přístup se stal jedním z nejdůležitějších při vyšetřování trestných činů [7].
Je důležité poznamenat, že klasické metody daktyloskopie DNA neumožňují identifikovat jednovaječná dvojčata, jejichž genetický profil je stejný, protože vznikají ze stejného oplozeného vajíčka.
Pro analýzu DNA je především zapotřebí samotná DnA, ale zdaleka ne vždy je možné získat kvalitní genetický materiál z biologických vzorků, které byly vystaveny chemickým a tepelným faktorům. Po vstupu do prostředí tato molekula vstupuje do chemických reakcí, je ničena (fragmentována) a modifikována, i když v příznivých podmínkách může přetrvat tisíce let [8].
Je známo, že nejstarší genetický materiál lidských předků byl získán z kostních pozůstatků našich humanoidních příbuzných, kteří žili na území Pyrenejského poloostrova (Sierra de Atapuerca) asi před 430 tisíci lety [9]. Specifické mikroklima některých jeskyní s nízkými hodnotami vlhkosti a teploty výrazně prodlužuje životnost genetického materiálu. DNA ve vzorcích nalezených na místě činu je však často zastoupena v minimálním množství a stejně jako v archeologických vzorcích je značně znehodnocena.
V Evropě a Spojených státech se upozorňuje na další nevýhodu genetického daktyloskopování, která souvisí se zásahem do soukromí člověka a porušením ochrany osobních údajů.
Ochránci lidských práv se obávají, že genetické informace zločinců a osob podezřelých z trestné činnosti by se mohly dostat do rukou třetích osob a následně být zneužity [10]. Jsou již například známy případy využití genetických informací ke kontrole muslimských menšin v čínské provincii Sin-ťiang.
Také Spojené státy plánují systematicky shromažďovat profily DNA imigrantů ve federální vazbě [11]. Je zřejmé, že obavy aktivistů za lidská práva nejsou neopodstatněné a mají reálný základ.
Hlavními výhodami genetické daktyloskopie je možnost pracovat i s malým množstvím biologického materiálu a vysoká přesnost, která umožňuje identifikaci jedince - pokud jsou splněny všechny požadavky na analýzu, její spolehlivost přesahuje 99 %. Tento přístup se stal jedním z nejdůležitějších při vyšetřování trestných činů [7].
Je důležité poznamenat, že klasické metody daktyloskopie DNA neumožňují identifikovat jednovaječná dvojčata, jejichž genetický profil je stejný, protože vznikají ze stejného oplozeného vajíčka.
Pro analýzu DNA je především zapotřebí samotná DnA, ale zdaleka ne vždy je možné získat kvalitní genetický materiál z biologických vzorků, které byly vystaveny chemickým a tepelným faktorům. Po vstupu do prostředí tato molekula vstupuje do chemických reakcí, je ničena (fragmentována) a modifikována, i když v příznivých podmínkách může přetrvat tisíce let [8].
Je známo, že nejstarší genetický materiál lidských předků byl získán z kostních pozůstatků našich humanoidních příbuzných, kteří žili na území Pyrenejského poloostrova (Sierra de Atapuerca) asi před 430 tisíci lety [9]. Specifické mikroklima některých jeskyní s nízkými hodnotami vlhkosti a teploty výrazně prodlužuje životnost genetického materiálu. DNA ve vzorcích nalezených na místě činu je však často zastoupena v minimálním množství a stejně jako v archeologických vzorcích je značně znehodnocena.
V Evropě a Spojených státech se upozorňuje na další nevýhodu genetického daktyloskopování, která souvisí se zásahem do soukromí člověka a porušením ochrany osobních údajů.
Ochránci lidských práv se obávají, že genetické informace zločinců a osob podezřelých z trestné činnosti by se mohly dostat do rukou třetích osob a následně být zneužity [10]. Jsou již například známy případy využití genetických informací ke kontrole muslimských menšin v čínské provincii Sin-ťiang.
Také Spojené státy plánují systematicky shromažďovat profily DNA imigrantů ve federální vazbě [11]. Je zřejmé, že obavy aktivistů za lidská práva nejsou neopodstatněné a mají reálný základ.
Jak to funguje
Metody daktyloskopie DNA jsou založeny na lidské genetické variabilitě. Nukleotidové záměny v DNA (v závislosti na četnosti v populaci se jim také říká polymorfismy DNA nebo mutace) nás individuálně odlišují. A tyto rozdíly lze nalézt jak v jaderném, tak v mitochondriálním genomu, malých kruhových molekulách DNA, které regulují fungování mitochondrií, energetických "továren" buněk.
Je třeba poznamenat, že polymorfismy DNA lze nalézt v genomu každého z nás - stávají se naším jedinečným čárovým kódem DNA. Některé z nich mohou způsobovat závažná onemocnění [12], ale ve většině případů nemají žádný vliv na naše životní funkce.
Moderní metody DNA daktyloskopie využívají různé genetické varianty v různých oblastech genomu. Například analýza tandemových repetic - krátkých opakujících se sekvencí genomu, jejichž počet se u dvou náhodně vybraných jedinců liší [13]- umožňuje jednoznačný test otcovství nebo nalezení dalších důkazů proti podezřelému z trestného činu.
K určení pohlaví člověka lze použít Y-chromozomální markery DNA. Genetické markery poskytují informace o etnickém původu příbuzných jedince, barvě očí nebo vlasů.
Epigenetické informace (např. metylace DNA) navíc umožňují odhadnout biologické stáří jednotlivých buněk, tkání i organismu jako celku [14]. V tomto článku se budu podrobněji zabývat výše uvedenými metodami genetické analýzy. A využití epigenetických metod v obchodě s léčivy bude předmětem mé další publikace.
K určení pohlaví člověka lze použít Y-chromozomální markery DNA. Genetické markery poskytují informace o etnickém původu příbuzných jedince, barvě očí nebo vlasů.
Epigenetické informace (např. metylace DNA) navíc umožňují odhadnout biologické stáří jednotlivých buněk, tkání i organismu jako celku [14]. V tomto článku se budu podrobněji zabývat výše uvedenými metodami genetické analýzy. A využití epigenetických metod v obchodě s léčivy bude předmětem mé další publikace.
Sběr a izolace DNA z biologického materiálu
Získávání a analýza DNA z forenzních vzorků je na první pohled srovnatelná s uměním. Někdy si ani nedokážeme představit, že několik kapek krve nebo kousek kůže pod nehty oběti se může stát nejdůležitějším důkazem při vyšetřování trestného činu.
Ve skutečnosti jsou úkony forenzních specialistů na místě činu vyladěné a řídí se jednotným scénářem, jehož jedním z hlavních cílů je nalezení biologického materiálu vhodného k extrakci DNA. K tomuto účelu lze použít jakoukoli biologickou tkáň a lidské sekrety .
- Kostní pozůstatky
- Zuby
- vlasové folikuly
- Krev
- Epitelové buňky
- Pot
- Sliny
- Vzorky spermatu
- exkrementy atd.
Biomateriál ve skladu důkazů může vydržet desítky let. Zkoušející často odebere ke zkoumání pouze část materiálu, tolik, kolik potřebuje k extrakci DNA. Například pokud jsou na noži stopy krve, znalec nesmyje všechnu krev, ale provede malý oplach těsně před extrakcí DNA. Tím na noži zanechá stopy, které lze použít k opětovnému zkoumání o několik desítek let později.
V buněčném jádře je DNA v těsném kontaktu s mnoha organickými molekulami nezbytnými pro její efektivní fungování. Pro genetickou analýzu je však třeba ze zkoumaného vzorku odstranit sacharidy, lipidy a bílkoviny, což může snížit účinnost použitých metod a následně ovlivnit rozpustnost zločinů.Extrakce DNA nezabere mnoho času díky řadě komerčních souprav a systémů speciálně určených pro extrakci nukleových kyselin (např. systém AutoMate Express DNA Extraction System od společnosti Thermo Fisher Scientific). Ve velkých forenzních centrech s tisíci analýzami denně je navíc tento proces plně automatizován a probíhá za účasti robotů pod dohledem operátora.
Mimochodem, robotické systémy se hojně využívají nejen ve forenzních laboratořích, ale také v mnoha lékařských a biotechnologických centrech, což umožňuje urychlit proces, snížit náklady na práci a výrazně omezit možnost chyby.
Po extrakci se DNA rozpustí ve speciální směsi, kde může být v případě potřeby skladována i několik let (při -20 °C nebo -80 °C).
Genetická analýza
Ihned po extrakci DnA stojí odborník před otázkou, jakým způsobem ji dále analyzovat. Od zavedení identifikace DNA v kriminalistice se techniky molekulární biologie natolik změnily, že existuje několik možných variant. V našem dalším povídání upozorníme na různé techniky analýzy DNA, které kriminalisté ve své praxi používají.
Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (analýza RFLP)
Analýza RFLP je historicky jednou z prvních metod identifikace DNA. Je založena na použití speciálních buněčných enzymů, restriktáz. Restrikční enzymy dokážou rozpoznat určitá místa na molekule nukleové kyseliny a přes tato místa ji přetnout. Doposud bylo popsáno několik tisíc takových enzymů. Po rozřezání molekuly DnA restrikčními enzymy se délka získaných fragmentů vyhodnotí pomocí gelové elektroforézy (obrázek 9).
Ihned po extrakci DnA stojí odborník před otázkou, jakým způsobem ji dále analyzovat. Od zavedení identifikace DNA v kriminalistice se techniky molekulární biologie natolik změnily, že existuje několik možných variant. V našem dalším povídání upozorníme na různé techniky analýzy DNA, které kriminalisté ve své praxi používají.
Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (analýza RFLP)
Analýza RFLP je historicky jednou z prvních metod identifikace DNA. Je založena na použití speciálních buněčných enzymů, restriktáz. Restrikční enzymy dokážou rozpoznat určitá místa na molekule nukleové kyseliny a přes tato místa ji přetnout. Doposud bylo popsáno několik tisíc takových enzymů. Po rozřezání molekuly DnA restrikčními enzymy se délka získaných fragmentů vyhodnotí pomocí gelové elektroforézy (obrázek 9).
Vzhledem k tomu, že neexistují zcela identické lidské genomy (s výjimkou jednovaječných dvojčat), může být rozdíl nebo podobnost ve výsledných profilech délek fragmentů DNA dobrým markerem pro identifikaci osob i určení příbuznosti.
Tato metoda však zahrnuje fragmentaci DNA, a je proto citlivá na kvalitu a množství původního genetického materiálu. Proto se analýza RFLP v současné době prakticky nepoužívá - na rozdíl od jiných metod, o kterých bude pojednáno níže.
Analýza počtu tandemových repetic v genomu
Tandemové repetice jsou kopie stejné krátké sekvence DnA opakující se za sebou [15]. Mezi opakování, která jsou pro forenzní vědce zajímavá, patří lokusy s různým počtem tandemových opakování (VNTR) a krátké tandemové repetice (STR). Nazývají se také minisatelity, respektive mikrosatelity.
. Podstatou této metody je PCR amplifikace fragmentů DNA obsahujících tyto krátké repetitivní sekvence, jejichž délka se u dvou náhodně vybraných jedinců liší. Po amplifikaci se délka získaných fragmentů vyhodnotí pomocí gelové elektroforézy nebo kapilární elektroforézy.
K tomuto účelu lze použít sadu Quantifiler DNA Quantification Kit a systém QuantStudio od společnosti Termo Fisher Scientific. QuantStudio je kompaktní stolní přístroj s širokou škálou funkcí.
Stejně jako u předchozí metody je hlavním identifikačním faktorem STR testu délka získaných fragmentů, která je pro každého jedince jedinečná a závisí na počtu opakování v analyzovaném místě. STR-analýza se vyznačuje vysokou přesností a rychlostí a také nízkými náklady. Důležitou podmínkou analýzy je kvalita genetického materiálu.
Tato metoda však zahrnuje fragmentaci DNA, a je proto citlivá na kvalitu a množství původního genetického materiálu. Proto se analýza RFLP v současné době prakticky nepoužívá - na rozdíl od jiných metod, o kterých bude pojednáno níže.
Analýza počtu tandemových repetic v genomu
Tandemové repetice jsou kopie stejné krátké sekvence DnA opakující se za sebou [15]. Mezi opakování, která jsou pro forenzní vědce zajímavá, patří lokusy s různým počtem tandemových opakování (VNTR) a krátké tandemové repetice (STR). Nazývají se také minisatelity, respektive mikrosatelity.
. Podstatou této metody je PCR amplifikace fragmentů DNA obsahujících tyto krátké repetitivní sekvence, jejichž délka se u dvou náhodně vybraných jedinců liší. Po amplifikaci se délka získaných fragmentů vyhodnotí pomocí gelové elektroforézy nebo kapilární elektroforézy.
K tomuto účelu lze použít sadu Quantifiler DNA Quantification Kit a systém QuantStudio od společnosti Termo Fisher Scientific. QuantStudio je kompaktní stolní přístroj s širokou škálou funkcí.
Stejně jako u předchozí metody je hlavním identifikačním faktorem STR testu délka získaných fragmentů, která je pro každého jedince jedinečná a závisí na počtu opakování v analyzovaném místě. STR-analýza se vyznačuje vysokou přesností a rychlostí a také nízkými náklady. Důležitou podmínkou analýzy je kvalita genetického materiálu.
STR analýza se v praktické kriminalistice objevila téměř před dvaceti lety, ale dodnes zůstává hlavní metodou identifikace osob. Výsledky analýzy DNA podezřelých osob a pachatelů trestné činnosti - genetické profily - vkládají kriminalisté do speciálních databází.
Pokud se tedy na místě činu najdou biologické stopy, z nichž lze izolovat DNA, je možné identifikovat všechny osoby, které se již dostaly do povědomí orgánů činných v trestním řízení. Stejné markery se používají při pátrání po pohřešovaných osobách a při určování otcovství.
Pokud se tedy na místě činu najdou biologické stopy, z nichž lze izolovat DNA, je možné identifikovat všechny osoby, které se již dostaly do povědomí orgánů činných v trestním řízení. Stejné markery se používají při pátrání po pohřešovaných osobách a při určování otcovství.
Systémy určené k identifikaci jedinců zpravidla umožňují analýzu několika genomových lokusů (10-24) najednou, včetně genu pro protein amelogenin, podle kterého se určuje pohlaví. Gen pro amelogenin se nachází na chromozomu X i Y, ale liší se velikostí, což umožňuje určit pohlaví člověka.
Díky využití vysoce výkonných technologií sekvenování získala kriminalistika účinný nástroj, který otevřel nové možnosti současné analýzy více míst (lokusů) jaderného a mitochondriálního genomu.
Důležitou výhodou těchto metod je možnost rozlišit i jednovaječná dvojčata (podle somatických mutací), což je při analýze RFLP nebo STR nemožné.
Díky využití vysoce výkonných technologií sekvenování získala kriminalistika účinný nástroj, který otevřel nové možnosti současné analýzy více míst (lokusů) jaderného a mitochondriálního genomu.
Důležitou výhodou těchto metod je možnost rozlišit i jednovaječná dvojčata (podle somatických mutací), což je při analýze RFLP nebo STR nemožné.
Ve druhé části této publikace bude popsáno, jak lze výše popsané metody využít k identifikaci drogových laboratoří a drogových dealerů a jak lze zametením stop zmást kriminalisty.
Přečtěte si ČÁST II
