Mefedron (4-metylmetkatinon) je β-ketoamfetaminová stimulační droga zneužívání s úzkou strukturní a mechanickou podobností s metamfetaminem. Jedním z nejsilnějších účinků spojených s mefedronem je schopnost stimulovat uvolňování dopaminu (DA) a blokovat jeho zpětné vychytávání prostřednictvím interakce s dopaminovým transportérem (DAT). Ačkoli mefedron nezpůsobuje toxicitu DA nervových zakončení, jeho schopnost sloužit jako blokátor DAT by mohla poskytovat ochranu před neurotoxicitou vyvolanou metamfetaminem podobně jako jiné inhibitory DAT. K otestování této možnosti byly myši před každou injekcí neurotoxického režimu metamfetaminu (4 injekce 2,5 nebo 5,0 mg/kg ve 2hodinových intervalech) ošetřeny mefedronem (10, 20 nebo 40 mg/kg). Integrita DA nervových zakončení striata byla hodnocena pomocí měření hladin DA, DAT a tyrosinhydroxylázy. Střední až těžká DA toxicita spojená s různými dávkami metamfetaminu nebyla zabráněna žádnou dávkou mefedronu, ale byla naopak významně zvýšena. Hypertermie způsobená kombinovanou léčbou mefedronem a metamfetaminem byla stejná jako po podání kteréhokoli z těchto léků samostatně. Mefedron také zesílil neurotoxické účinky amfetaminu a MDMA na DA nervová zakončení. Naproti tomu nomifensin chránil před neurotoxicitou vyvolanou metamfetaminem. Vzhledem k tomu, že mefedron zvyšuje neurotoxicitu metamfetaminu, současné výsledky naznačují, že interaguje s DAT způsobem odlišným od jiných typických inhibitorů DAT. Relativně neškodné účinky samotného mefedronu na nervová zakončení DA maskují potenciálně nebezpečnou interakci s drogami, které se s ním často užívají společně, což vede ke zvýšené neurotoxicitě.
Mefedron (4-metylmetkatinon) je derivát katinonu a strukturní analog metamfetaminu a 3,4-metylendioxy-metamfetaminu (MDMA). Mefedron je jednou z psychoaktivních složek "koupelových solí" spolu s dalšími sloučeninami, jako je metylon, butylon a 3,4-metylendioxypyrovaleron (MDPV). β-ketoamfetaminy jsou zneužívány ve stále větší míře, což je z velké části způsobeno velmi omezenou dostupností prekurzorů potřebných pro syntézu metamfetaminu a MDMA v tajných laboratořích a odpovídajícím snížením jejich čistoty (Winstock et al. 2011b, Brunt et al. 2011). Vzhledem k tomu, že zneužívání β-ketoamfetaminů stále roste, seznam jejich nežádoucích účinků se rozrostl o kardiovaskulární komplikace, agitovanost, nespavost, psychózy a deprese (Schifano et al. 2011, Prosser a Nelson 2012).
Vzhledem k tomu, že β-ketoamfetaminy jsou chemickými příbuznými metamfetaminu a MDMA, není překvapivé, že mají na centrální nervový systém mnoho stejných účinků jako tyto první drogy. Tyto drogy například blokují dopaminové (DA) a serotoninové (5-HT) transportéry (DAT, resp. SERT) (Cozzi et al. 1999, Rothman et al. 2003, Fleckenstein et al. 2000, Lopez-Arnau et al. 2012) a stimulují uvolňování monoaminů in vitro (Kalix a Glennon 1986, Gygi et al. 1997, Rothman et al. 2003) a in vivo (Gygi et al. 1997, Kehr et al. 2011). Metkatinon způsobuje trvalé snížení aktivity tryptofanhydroxylázy a tyrosinhydroxylázy (TH) a vyčerpání DA a 5-HT (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). PET zobrazovací studie u abstinujících uživatelů metkatinonu odhalily sníženou striatální hustotu DAT, což naznačuje úbytek DA terminálů (McCann et al. 1998). Současná stimulace uvolňování DA a inhibice jeho vychytávání odráží kritické prvky, které jsou základem neurotoxicity spojené s metamfetaminem (Kuhn et al. 2008, Yamamoto a Bankson 2005, Cadet et al. 2007, Fleckenstein et al. 2007).
My (Angoa-Perez et al. 2012) a další (Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011) jsme nedávno zkoumali možnost, že by mefedron mohl způsobovat neurotoxicitu podobně jako metamfetamin a MDMA. Překvapivě mefedron nebyl toxický pro DA nervová zakončení striata (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Otázka, zda mefedron poškozuje nervová zakončení 5-HT, zůstává nevyřešena, protože jedna studie dokumentovala pozitivní účinky (Hadlock et al. 2011), zatímco jiná byla negativní (Baumann et al. 2012). Vzhledem k relativně příznivému účinku mefedronu na nervová zakončení DA a s ohledem na jeho vlastnosti jako blokátoru DAT jsme předpokládali, že by mohl skutečně chránit neuronální systém DA před neurotoxickými účinky metamfetaminu podobně, jako je to známo u jiných blokátorů DAT, jako je kyselina amfonelová (Pu et al. 1994, Schmidt a Gibb 1985, Marek et al. 1990) a nomifensin (Poth et al. 2012). V současnosti uvádíme, že mefedron významně zvyšuje neurotoxicitu metamfetaminu. Tento účinek se rozšiřuje i na amfetamin a MDMA, drogy, které se často užívají společně s mefedronem (Feyissa a Kelly 2008, Schifano et al. 2011). Tyto překvapivé výsledky vrhají na zneužívání mefedronu nové světlo a dodávají naléhavost uznání této nenápadné a nebezpečné vlastnosti tohoto β-ketoamfetaminu.
Materiály a metody
Drogy a činidla
Mefedron hydrochlorid a 3,4-methylendioxymetamfetamin (MDMA) byly získány z programu NIDA Research Resources Drug Supply Program. (+) Metamfetamin hydrochlorid, nomifensin maleát, d-amfetamin sulfát, pentobarbital, DA a všechny pufry a HPLC činidla byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Soupravy pro stanovení bílkovin kyseliny bikinchoninové byly získány od společnosti Pierce (Rockford, IL, USA). Polyklonální protilátky proti krysí TH byly vyrobeny podle předchozího popisu (Kuhn a Billingsley 1987). Monoklonální protilátky proti krysímu DAT velkoryse poskytla Dr. Roxanne A. Vaughan (University of North Dakota, Grand Forks, ND, USA). Sekundární protilátky anti-IgG konjugované s HRP poskytla společnost Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc (West Grove, PA, USA).
Zvířata
Samice myší C57BL/6 (Harlan, Indianapolis, IN, USA) vážící v době pokusu 20-25 g byly umístěny po 5 v každé kleci ve velkých klecích typu shoe-box v místnosti s kontrolovaným světlem (12 h světlo/tma) a teplotou. Byly použity myší samice, protože je známo, že jsou velmi citlivé na poškození neuronů neurotoxickými amfetaminy, a aby byla zachována konzistence s našimi předchozími studiemi neurotoxicity metamfetaminu (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Myši měly volný přístup k potravě a vodě. Institucionální výbor pro péči a použití na Wayne State University schválil péči o zvířata a experimentální postupy. Všechny postupy byly rovněž v souladu s Příručkou NIH pro péči o laboratorní zvířata a jejich používání.
Farmakologické, fyziologické a behaviorální postupy
Myši byly léčeny mefedronem pomocí binge-like režimu sestávajícího ze 4 injekcí 10, 20 nebo 40 mg/kg s dvouhodinovým intervalem mezi jednotlivými injekcemi. Tento režim léčby binge, pokud se používá k injekčnímu podání substituovaných amfetaminů a katinonových derivátů, vede k rozsáhlému poškození DA nervových zakončení. Dávky mefedronu používané v současnosti se dříve ukázaly jako netoxické pro DA nervová zakončení (Angoa-Perez et al. 2012). Myším byl podáván metamfetamin (4× 2,5 nebo 5 mg/kg), amfetamin (4× 5 mg/kg) nebo MDMA (4× 20 mg/kg) samostatně nebo v kombinaci s mefedronem. Při léčbě dvěma drogami dostaly myši injekci mefedronu 30 minut před každou ze 4 injekcí metamfetaminu, amfetaminu nebo MDMA. Kontrolní skupiny dostaly injekce fyziologického roztoku podle stejného schématu, jaké bylo použito pro mefedron samotný nebo v kombinaci s jinými amfetaminy. Jako kontrola účinků inhibitoru DAT na toxicitu metamfetaminu byl myším 30 minut před každou injekcí metamfetaminu (4x 5 mg/kg) podán nomifensin (4x 5 mg/kg). Všechny injekce byly podány i.p. cestou. Myši byly usmrceny 2 dny po poslední léčbě, kdy neurotoxicita spojená s amfetaminem dosáhla maxima. Tělesná teplota byla monitorována telemetricky pomocí implantovatelných teplotních transpondérů IPTT-300 společnosti Bio Medic Data Systems, Inc (Seaford, DE, USA). Teplota byla zaznamenávána neinvazivně každých 20 minut počínaje 60 minut před první injekcí METH a pokračuje po dobu 9 hodin poté pomocí konzolového systému DAS-5001 od společnosti Bio Medic.
Stanovení striatálního obsahu DA
Striatální tkáň byla po léčbě oboustranně vypreparována z mozku a uložena při -80 °C. Zmrazené tkáně byly zváženy a sonikovány v 10 objemech 0,16 N kyseliny chlorovodíkové při 4 °C. Nerozpustný protein byl odstraněn centrifugací a DA byl stanoven pomocí HPLC s elektrochemickou detekcí, jak bylo dříve popsáno pro metamfetamin (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
Stanovení hladin proteinů TH a DAT pomocí imunoblotu
Účinky léčby léky na striatální hladiny TH a DAT byly stanoveny imunoblottingem jako index toxicity pro striatální DA nervová zakončení. Myši byly po léčbě usmrceny dekapitací a striatum bylo oboustranně vypreparováno. Tkáň byla uložena při -80 °C. Zmrazená tkáň byla narušena sonikací v 1% SDS při 95 °C a nerozpustný materiál byl sedimentován centrifugací. Protein byl stanoven metodou kyseliny bicinchoninové a stejná množství proteinu (70 μg/l) byla rozdělena elektroforézou v SDS-polyakrylamidovém gelu a poté elektrolotována na nitrocelulózu. Bloty byly blokovány ve fyziologickém roztoku pufrovaném Trisem obsahujícím Tween 20 (0,1 % v/v) a 5 % netučného sušeného mléka po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Na bloty byly přidány primární protilátky proti TH (1:1000) nebo DAT (1:1000) a nechaly se inkubovat 16 h při 4 °C. Bloty byly 3x promyty ve fyziologickém roztoku pufrovaném Tris, aby se odstranily nezreagované protilátky, a poté inkubovány s HRP-konjugovanou sekundární protilátkou anti-IgG (1:4000) po dobu 1 h při pokojové teplotě. Imunoreaktivní pásy byly vizualizovány zvýšenou chemiluminiscencí a relativní hustota pásů reagujících s TH a DAT byla stanovena zobrazením pomocí Kodak Image Station (Carestream Molecular Systems, Rochester, NY, USA) a kvantifikována pomocí softwaru ImageJ (NIH).
Analýza dat
K analýze účinků dávky metamfetaminu oproti mefedronu na DA, DAT a TH byly provedeny dvoucestné ANOVA. Účinky léčby léky na striatální obsah DA, TH a DAT byly testovány na významnost pomocí jednosměrné ANOVA a následného Tukeyho testu vícenásobného srovnání. Výsledky léčby léky na teplotu tělesného jádra v čase byly analyzovány pomocí dvoucestné ANOVA následované Bonferroniho testem ke zjištění významnosti rozdílů v teplotě v jednotlivých časech po léčbě. Rozdíly byly považovány za významné, pokud p < 0,05. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí programu GraphPad Prism verze 5.02 pro Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com).
Přejděte na následující stránku:
Výsledky
Účinky mefedronu na neurotoxicitu vyvolanou metamfetaminem
Mefedron v dávkách (10, 20 nebo 40 mg/kg), o nichž je známo, že nezpůsobují toxicitu DA nervových zakončení (Angoa-Perez et al. 2012), byl podáván 30 minut před každou injekcí metamfetaminu. Metamfetamin byl podáván v dávkách, které způsobují střední (4x 2,5 mg/kg) nebo těžké (4x 5 mg/kg) poškození DA nervových zakončení striata (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). Výsledky uvedené na obr. 1 ukazují, že hlavní účinky dávky metamfetaminu (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) a dávky mefedronu (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) na hladiny DA ve striatu byly vysoce významné podle dvoucestné ANOVA. Hlavní účinek mefedronu podaného v kombinaci s 2,5 mg/kg (F4,22 = 35,96, p < 0,001) nebo 5,0 mg/kg metamfetaminu (F4,17 = 953,9, p < 0,0001) byl rovněž vysoce významný pomocí jednocestné ANOVA. Všechna ošetření s kteroukoli dávkou metamfetaminu ± mefedronu způsobila významně větší snížení DA ve srovnání s příslušnou kontrolou (p < 0,0001 pro všechny). Obr. 1 také ukazuje, že dávky mefedronu 20 (p < 0,01) a 40 mg/kg (p < 0,001) významně zesílily depleční účinky metamfetaminu 2,5 mg/kg na DA, zatímco všechny dávky mefedronu významně zesílily účinky metamfetaminu 5,0 mg/kg na hladiny DA (p < 0,0001 pro všechny).
Obr.1
Účinky mefedronu na metamfetaminem indukované snížení striatálního DA. Myši byly ošetřeny uvedenými dávkami mefedronu (MEPH) 30 minut před každou injekcí 2,5 (-) nebo 5,0 mg/kg (■) metamfetaminu (METH) a o 2 dny později usmrceny pro stanovení striatálních hladin DA pomocí HPLC. Údaje jsou průměrné ± SEM pro 5-7 myší z každé skupiny. Některé chybové úsečky byly příliš malé na to, aby přesáhly velikost symbolů, a nejsou viditelné. ***p < 0,001 oproti kontrolám a #p < 0,01, ##p < 0,001 nebo ###p < 0,0001 oproti příslušné dávce metamfetaminu (Tukeyho test mnohonásobného srovnání).
Obr. 2a ukazuje, že mefedron významně zvýšil snížení hladin DAT vyvolané metamfetaminem, jak bylo stanoveno pomocí imunoblotu. Imunobloty byly kvantifikovány a ve shodě s výsledky pro DA byly hlavní účinky dávky metamfetaminu (F1,92 = 9,48, p < 0,001) a dávky mefedronu (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) na hladiny DAT ve striatu vysoce významné pomocí dvoucestné ANOVA (obr. 2b). Hlavní účinek mefedronu podaného v kombinaci s 2,5 mg/kg (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) nebo 5,0 mg/kg metamfetaminu (F4,39 = 24,84, p < 0,0001) byl vysoce významný také pomocí jednocestné ANOVA. Všechna ošetření s kteroukoli dávkou metamfetaminu ± mefedronu způsobila významně větší snížení DAT ve srovnání s příslušnou kontrolou (p < 0,01 pro samotný metamfetamin 2,5 mg/kg; p < 0,0001 pro všechna ostatní ošetření). Obr. 2b rovněž ukazuje, že dávky mefedronu 20 mg/kg (p < 0,01) a 40 mg/kg (p < 0,001) významně zvýšily snížení DAT způsobené metamfetaminem 2,5 mg/kg, zatímco pouze dávka mefedronu 40 mg/kg významně zvýšila (p < 0,01) účinky metamfetaminu 5,0 mg/kg na snížení DAT.
Obr. 2
Účinky mefedronu na metamfetaminem indukované snížení striatální DAT. Myši byly ošetřeny uvedenými dávkami mefedronu (MEPH) 30 minut před každou injekcí 2,5 (●) nebo 5,0 mg/kg (■) metamfetaminu (METH) a o 2 dny později usmrceny pro stanovení striatálních hladin DAT pomocí imunoblotu (a). Bloty byly kvantifikovány pomocí ImageJ a údaje jsou průměrem ± SEM pro 10-12 myší z každé skupiny (b). *p < 0,01 nebo ***p < 0,0001 oproti kontrole (C) a #p < 0,01 nebo ##p < 0,001 oproti příslušné dávce metamfetaminu (Tukeyho test mnohonásobného srovnání).
Obr. 3a ukazuje, že mefedron významně zvýšil snížení hladin TH vyvolané metamfetaminem, jak bylo stanoveno pomocí imunoblotu. Imunobloty byly kvantifikovány a ve shodě s výše uvedenými výsledky pro DA a DAT byly hlavní účinky dávky metamfetaminu (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) a dávky mefedronu (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) vysoce významné pomocí dvoucestné ANOVA (obr. 3b). Hlavní účinek mefedronu podaného v kombinaci s 2,5 mg/kg (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) nebo 5,0 mg/kg metamfetaminu (F4,49 = 99,16, p < 0,0001) byl vysoce signifikantní také pomocí jednocestné ANOVA. Všechna ošetření s kteroukoli dávkou metamfetaminu ± mefedronu způsobila významně větší snížení TH ve srovnání s příslušnou kontrolou (p < 0,001 pro 2,5 mg/kg metamfetaminu + 10 mg/kg mefedronu; p < 0,0001 pro všechny ostatní kombinace) s výjimkou samotného 2,5 mg/kg metamfetaminu, který hladiny TH významně nezměnil (tj. žádná toxicita). Obr. 3b také ukazuje, že dávky mefedronu 20 mg/kg (p < 0,01) a 40 mg/kg (p < 0,001) významně zvýšily snížení TH způsobené metamfetaminem 2,5 mg/kg a všechny tři dávky mefedronu významně (p < 0,0001) zvýšily účinky metamfetaminu 5,0 mg/kg na snížení TH.
Obr. 3
Účinky mefedronu na metamfetaminem indukované snížení striatálního TH. Myši byly ošetřeny uvedenými dávkami mefedronu (MEPH) 30 min před každou injekcí 2,5 (●) nebo 5,0 mg/kg (■) metamfetaminu (METH) a o 2d později usmrceny pro stanovení striatálních hladin TH pomocí imunoblotu (a). Bloty byly kvantifikovány pomocí ImageJ a údaje jsou průměrem ± SEM pro 10-12 myší z každé skupiny (b). Některé chybové úsečky byly příliš malé na to, aby přesáhly velikost symbolů, a nejsou viditelné. **p < 0,001 nebo ***p < 0,0001 oproti kontrole (C) a #p < 0,01, ##p < 0,001 nebo ###p < 0,0001) oproti příslušné dávce metamfetaminu (Tukeyho test mnohonásobného srovnání).
Účinky mefedronu na hypertermii vyvolanou metamfetaminem
Mefedron, stejně jako metamfetamin, způsobuje významnou hypertermii (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Když byl mefedron podán 30 minut před každou injekcí metamfetaminu, je na obr. 4 vidět, že hlavní účinky dávek metamfetaminu a mefedronu (F1,300 = 11,99, p < 0,0001) v čase (F4,300 = 51,73, p < 0,0001) byly vysoce významné pomocí dvoucestné ANOVA. Hlavní účinky mefedronu podaného v kombinaci buď s 2,5 mg/kg metamfetaminu (F4,120 = 41,44, p < 0,0001, panel a) v čase (F30,120 = 3,84, p < 0,0001), nebo 5,0 mg/kg metamfetaminu (F4,120 = 78,09, p < 0,0001, panel b) v čase (F30,120 = 9,98, p < 0,0001) byly rovněž vysoce významné pomocí dvoucestné ANOVA. Všechna ošetření s kteroukoli dávkou metamfetaminu ± mefedronu se významně lišila od příslušných kontrol (p < 0,0001 pro všechna ošetření).
Obr. 4
Účinky mefedronu na hypertermii vyvolanou metamfetaminem. Myším byly podávány uvedené dávky mefedronu (MEPH) 30 minut před každou injekcí 2,5 (a) nebo 5,0 mg/kg (b) metamfetaminu (METH). Teplota jádra byla měřena ve 20minutových intervalech pomocí telemetrie počínaje 60 min před první injekcí metamfetaminu. Čtyři injekce metamfetaminu jsou označeny šipkami spočívajícími na ose x. Údaje jsou vyjádřeny jako průměrná tělesná teplota 6-8 myší z každé skupiny. SEM byly vždy < 10 % průměru a pro přehlednost jsou vynechány.
Účinky mefedronu na neurotoxicitu vyvolanou amfetaminem a MDMA
Za účelem otestování, zda by se zesilující účinky mefedronu na metamfetamin mohly rozšířit i na další neurotoxické amfetaminy, byly myši léčeny tímto β-ketoamfetaminem (20 mg/kg) plus amfetaminem (4x 5 mg/kg) nebo MDMA (4x 20 mg/kg) a výsledky jsou uvedeny na obr. 5. Na obr. 5 je znázorněna účinnost mefedronu na amfetamin. Připomeňme, že samotný mefedron nesnižuje striatální DA, DAT ani TH (Angoa-Perez et al. 2012). Hlavní účinek léčiva (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) byl vysoce významný podle jednocestné ANOVA pro snížení DA (obr. 5a). Na obr. 5a je také vidět, že všechna ošetření amfetaminem (p < 0,001) nebo MDMA (p < 0,001) samostatně nebo v kombinaci s mefedronem (p < 0,0001 pro obě léčiva) významně snížila hladiny DA oproti kontrole. Mefedron významně zvýšil snížení DA způsobené amfetaminem (p < 0,01) nebo MDMA (p < 0,01). Obr. 5b ukazuje podobné účinky kombinované léčby léky na hladiny DAT ve striatu. Hlavní účinek léčiva (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) byl vysoce významný pomocí jednocestné ANOVA pro DAT. Na obr. 5b je také vidět, že všechny léčby amfetaminem nebo MDMA byly ve srovnání s kontrolou významně (p < 0,0001 pro všechny) nižší. Mefedron také významně zvýšil snížení DAT způsobené amfetaminem nebo MDMA (p < 0,0001 v obou případech). A konečně obr. 5c ukazuje, že hlavní účinek léčiva (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) byl vysoce významný podle jednocestné ANOVA pro snížení TH. Na obr. 5c je také vidět, že všechny procedury s amfetaminem nebo MDMA byly ve srovnání s kontrolou významně (p < 0,0001 pro všechny) nižší. Mefedron také významně zvýšil snížení TH způsobené amfetaminem nebo MDMA (p < 0,0001 v obou případech).
Obr. 5
Účinky mefedronu na neurotoxicitu DA nervových zakončení vyvolanou amfetaminem nebo MDMA. Myším bylo 30 minut před každou injekcí 5,0 mg/kg amfetaminu (AMPH) nebo 20 mg/kg MDMA podáno 20 mg/kg mefedronu (MEPH) a 2d po léčbě byly usmrceny pro stanovení striatálních hladin a) DA pomocí HPLC. (b) DAT a (c) TH byly stanoveny imunoblotováním a bloty byly kvantifikovány pomocí ImageJ. Reprezentativní imunobloty pro DAT a TH jsou zahrnuty jako vložky do panelů (b) a (c) a léčby pro oba panely jsou označeny 1,5: kontrola; 2,6: MEPH; 3: AMPH; 4: AMPH + MEPH; 7: MDMA; a 8: MDMA + MEPH. Údaje jsou průměrné ± SEM pro 5-12 myší v každé skupině. **p < 0,001 nebo ***p < 0,0001 oproti kontrole a #p < 0,01 nebo ###p < 0,0001 oproti AMPH nebo MDMA (Tukeyho test mnohonásobného porovnání).
Účinky nomifensinu na neurotoxicitu vyvolanou metamfetaminem
Nomifensin, silný blokátor DAT bez známého zneužívacího nebo neurotoxického potenciálu, byl testován na schopnost chránit před neurotoxicitou vyvolanou metamfetaminem a na kontrast k účinkům mefedronu na toxicitu DA nervových zakončení způsobenou metamfetaminem, amfetaminem a MDMA. Výsledky na obr. 6a ukazují, že hlavní účinek léčiva (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) na hladiny DA byl vysoce významný podle jednocestné ANOVA. Samotný nomifensin hladiny DA nezměnil, ale snížení způsobené metamfetaminem (p < 0,0001) bylo mírně, ale významně zvráceno nomifensinem (p < 0,01). Hlavní účinek léčiva (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) na hladiny DAT byl vysoce významný pomocí jednosměrné ANOVA, jak ukazuje obr. 6b. Nomifensin hladiny DAT nezměnil, ale poskytl významnou ochranu (p < 0,001) před snížením striatálního DAT způsobeným metamfetaminem (p < 0,0001) ve srovnání s kontrolou. Konečně obr. 6c ukazuje, že hlavní účinek léčiva (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) na hladiny TH byl vysoce významný pomocí jednocestné ANOVA. Stejně jako v případě DA a DAT bylo snížení TH způsobené metamfetaminem (p < 0,0001) mírně, ale významně zabráněno nomifensinem (p < 0,01).
Obr. 6
Účinky nomifensinu na neurotoxicitu DA nervových zakončení vyvolanou metamfetaminem. Myším bylo 30 min před každou injekcí 5,0 mg/kg metamfetaminu (METH) podáno 5,0 mg/kg nomifensinu (NOM) a o 2 d později byly usmrceny pro stanovení striatálních hladin (a) DA pomocí HPLC. (b) DAT a (c) TH byly stanoveny imunoblotováním a bloty byly kvantifikovány pomocí ImageJ. Reprezentativní imunobloty pro DAT a TH jsou uvedeny jako vložky k panelům (b) a (c). Údaje jsou průměrné plus SEM pro 5-7 myší na skupinu. ***p < 0,0001 oproti kontrole (C) a #p < 0,01 nebo ##p < 0,001 oproti samotnému metamfetaminu (Tukeyho test mnohonásobného srovnání).
Diskuse
Cílem této studie bylo zjistit, zda mefedron zabrání toxicitě DA nervových zakončení způsobené metamfetaminem. Na základě jeho chemické podobnosti s metamfetaminem a MDMA se původně očekávalo, že mefedron bude mít škodlivé účinky na DA neuronální systém. Několik studií však téměř současně prokázalo, že mefedron není pro nervová zakončení DA toxický (Angoa-Perez et al. 2012, Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011). Otázka, zda tato droga způsobuje poškození neuronálního systému 5-HT, zůstává otevřená. Jedna studie uvádí trvalé snížení funkce nervových zakončení 5-HT (Hadlock et al. 2011), zatímco jiná zjistila, že mefedron poškození nezpůsobuje (Baumann et al. 2012). Mefedron interaguje s nervovým zakončením DA způsobem, který naznačuje, že skutečně stimuluje uvolňování a blokuje zpětné vychytávání DA prostřednictvím interakcí s DAT. Klíčovým aspektem neurotoxického mechanismu účinku metamfetaminu je jeho schopnost získat přístup k DA nervovým zakončením prostřednictvím DAT a narušit homeostázu DA (Sulzer 2011). Pokud se tomuto časnému kroku v neurotoxické kaskádě metamfetaminu zabrání inhibicí DAT, je toxicitě zabráněno (Pu et al. 1994, Poth et al. 2012, Marek et al. 1990, Schmidt a Gibb 1985). Předpokládali jsme, že mefedron by mohl mít stejnou ochrannou vlastnost jako jiné inhibitory DAT, ale místo toho jsme pozorovali výrazné zvýšení toxicity. Tato interakce byla pozorována při použití dvou různých dávek metamfetaminu, které způsobují střední nebo těžké poškození DA nervových zakončení (4x 2,5, resp. 5,0 mg/kg). Tento zesilující účinek mefedronu se neomezoval pouze na metamfetamin a rozšířil se i na amfetamin a MDMA, dvě drogy, které se často užívají společně s mefedronem a dalšími β-ketoamfetaminy (Feyissa a Kelly 2008, Schifano et al. 2011, Kelly 2011). Proto navzdory skutečnosti, že mefedron nezpůsobuje toxicitu alespoň DA nervových zakončení striata, zesiluje neurotoxické účinky jiných drog zneužívání. Toto nové zjištění by mělo zneužívání mefedronu postavit do ještě ostřejšího světla, protože jeho nedostatečná vlastní neurotoxicita může způsobit, že se bude jevit jako neškodný.
Hypertermie je běžně hlášený akutní nežádoucí účinek požití metamfetaminu (Greene et al. 2008) a β-ketoamfetaminu u lidí (Borek a Holstege 2012, Prosser a Nelson 2012). Stejně jako metamfetamin způsobují i mnohé z β-ketoamfetaminových drog výrazné zvýšení tělesné teploty u hlodavců (Angoa-Perez et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Rockhold et al. 1997). Hypertermie způsobená metamfetaminem by sice mohla přispívat k jeho morfologickým a neuronům škodlivým účinkům, nemusí však nutně platit, že hypertermie je přímou příčinou těchto účinků (Kiyatkin a Sharma 2009). U myší léčených mefedronem a metamfetaminem jsme zaznamenávali teplotu tělesného jádra a pozorovali jsme, že kombinovaná léčba nezvýšila teplotu nad maximální zvýšení pozorované po jedné z obou drog samostatně. Metamfetamin způsobil zvýšení tělesné teploty v závislosti na dávce a tato hypertermie byla neměnná v celém testovaném rozsahu dávek mefedronu. Pokles tělesné teploty po injekci pozorovaný po léčbě mefedronem (Angoa-Perez et al. 2012) se ve skutečnosti zachoval i při vyšších dávkách mefedronu plus metamfetaminu. Přestože hypertermie vyvolaná léky nebyla kombinovanou léčbou zesílena, neurotoxické účinky byly aditivní. Zdá se tedy, že přinejmenším v tomto případě mohou být neurotoxické účinky metamfetaminu zesíleny mefedronem způsobem, který je nezávislý na hypertermii.
Mefedron jasně inhibuje funkci DAT a blokuje zpětné vychytávání DA in vitro (Lopez-Arnau et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Kehr et al. 2011, Martinez-Clemente et al. 2012, Cozzi et al. 1999). Mefedron vytěsňuje WIN-35,428 z jeho vazebného místa na DAT, což naznačuje, že je kompetitivním inhibitorem vychytávání DA (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). Účinnost mefedronu je v tomto ohledu velmi podobná účinnosti metamfetaminu (Cozzi et al. 1999) a MDMA (Escubedo et al. 2011). Není známo, zda je mefedron transportován DAT, ale methcathinon ano (Cozzi a Foley 2003). Nomifensin a kyselina amfonelová, které se vážou na DAT a inhibují vychytávání DA, poskytují značnou ochranu před neurotoxicitou vyvolanou metamfetaminem (Pu et al. 1994, Marek et al. 1990, Schmidt a Gibb 1985, Poth et al. 2012) a myši bez DAT jsou rezistentní vůči neuronální toxicitě metamfetaminu (Fumagalli et al. 1998). Vědomí, že mefedron není neurotoxický a je blokátorem DAT, vede k předpokladu, že by měl toxicitě zabránit. V tomto ohledu jsme testovali nomifensin jako pozitivní kontrolu a potvrdili jsme, že chrání před deplecí DA, DAT a TH vyvolanou metamfetaminem. Nomifensin také inhibuje norepinefrinový transportér (Brogden et al. 1979), ale tato vlastnost nemůže vysvětlit současné výsledky, protože většina β-ketoamfetaminů včetně mefedronu inhibuje norepinefrinový transportér a blokuje vychytávání norepinefrinu (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). Úloha neuronálního systému 5-HT v některých farmakologických účincích mefedronu je možná vzhledem ke schopnosti této drogy, podobně jako MDMA (Yamamoto et al. 1995), způsobovat vyplavování striatálního DA prostřednictvím interakcí s receptory 5-HT2A (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). Hyperlokomoce způsobená mefedronem je závislá na endogenním 5-HT (Lopez-Arnau et al. 2012) a tento lék také stimuluje uvolňování 5-HT a inhibuje jeho vychytávání in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) a in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). Úlohu endogenního 5-HT v DA neurotoxicitě přinejmenším metamfetaminu však můžeme vyloučit tím, že jsme prokázali, že myši geneticky ochuzené o 5-HT si zachovávají citlivost na neurotoxicitu (Thomas et al. 2010).
Mefedron by mohl zvýšit neurotoxicitu metamfetaminu několika možnými mechanismy. Zaprvé by mefedron mohl interagovat s VMAT a způsobit únik DA do cytoplazmy presynaptického nervového zakončení. Léčba, která zvyšuje cytoplazmatický pool (tj. uvolnitelný lékem) DA, zvyšuje neurotoxicitu metamfetaminu (Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009, Schmidt et al. 1985). Tento mechanismus není pravděpodobný, protože methcathinon interaguje s VMAT jen slabě (Cozzi et al. 1999). Za druhé, kombinace mefedronu a metamfetaminu by mohla mít synergický účinek na nevezikulární uvolňování DA, ale tato možnost se zdá být také nepravděpodobná ve světle výsledků, které ukazují, že léčba buněk CHO exprimujících DAT nebo SERT metylonem a metamfetaminem nemá aditivní účinek na uvolňování DA nebo 5-HT (Sogawa et al. 2011). Za třetí, mefedron by mohl interagovat s DAT novým způsobem, který přispívá k aditivní toxicitě. Bylo prokázáno, že methylon v kombinaci s metamfetaminem způsobuje synergickou cytotoxicitu v buňkách CHO exprimujících DAT nebo SERT, ale nikoli v buňkách CHO divokého typu, které tyto transportéry postrádají (Sogawa et al. 2011). Cytotoxicita pozorovaná u kultivovaných buněk v těchto studiích (tj. uvolňování LDH) je velmi odlišná od poškození DA nervových zakončení způsobeného metamfetaminem, ale tento mechanismus naznačuje zajímavou, ale nedefinovanou roli DAT ve zvýšené cytotoxicitě. A konečně, mefedron by mohl změnit metabolismus metamfetaminu. Mefedron je primárně metabolizován N-demetylací (Meyer a Maurer 2010), stejně jako metamfetamin a MDMA (Caldwell 1976). Podpora tohoto mechanismu vychází z prokázání, že metamfetamin a MDMA vzájemně inhibují tvorbu svých primárních metabolitů a zvyšují plazmatické hladiny drog nad hodnoty pozorované po podání jedné z nich samostatně (Kuwayama et al. 2012). Dávky mefedronu použité v současnosti a v naší předchozí studii (Angoa-Perez et al. 2012) jsou sice vysoké, ale nejsou neurotoxické a spadají do rozmezí dávek zneužívaných lidmi (McErath a O'Neill 2011). Mefedron by tedy mohl působit podobně jako MDMA a zvyšovat plazmatické hladiny metamfetaminu tím, že inhibuje jeho metabolismus. K potvrzení této druhé možnosti bude zapotřebí provést hloubkovou farmakokinetickou analýzu.
Zneužívání β-ketoamfetaminů roste alarmujícím tempem a mefedron je nyní po konopí, MDMA a kokainu jednou z nejčastěji užívaných drog (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Mefedron navíc u lidí vyvolává silnější pocity touhy ve srovnání s MDMA (Brunt et al. 2011) a uživatelé, kteří mefedron šňupou, jej hodnotí jako návykovější než kokain (Winstock et al. 2011b). Mefedron je lidmi konzumován nárazově (tj. "stohováním") a často je užíván s jinými drogami, jako je konopí a amfetaminové psychostimulanty (Schifano et al. 2011, Fass et al. 2012, Winstock et al. 2011a, Kelly 2011, Torrance a Cooper 2010). Mefedron se stále častěji vyskytuje v tabletách prodávaných jako MDMA (Brunt et al. 2011) a jeho užívání pravděpodobně předčí užívání MDMA, protože čistota této druhé drogy stále klesá (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Na základě běžných vzorců zneužívání mefedronu a dalších složek "koupelových solí" je důležité zvážit, zda při záměrné či nevědomé kombinaci těchto drog s amfetaminy vznikají u lidí další zdravotní rizika. Naše výsledky, které ukazují, že přinejmenším mefedron významně zesiluje neurotoxicitu DA nervových zakončení striata způsobenou metamfetaminem, amfetaminem a MDMA, odhalují zvláště nebezpečnou a nečekanou vlastnost tohoto β-ketoamfetaminu.
Použité zkratky
5-HT serotonin
DA dopamin
DAT DA transportér
MDMA 3,4-methylendioxymetamfetamin
TH tyrosinhydroxyláza
VMAT vezikulární monoaminový transportér
Mefedron (4-metylmetkatinon) je derivát katinonu a strukturní analog metamfetaminu a 3,4-metylendioxy-metamfetaminu (MDMA). Mefedron je jednou z psychoaktivních složek "koupelových solí" spolu s dalšími sloučeninami, jako je metylon, butylon a 3,4-metylendioxypyrovaleron (MDPV). β-ketoamfetaminy jsou zneužívány ve stále větší míře, což je z velké části způsobeno velmi omezenou dostupností prekurzorů potřebných pro syntézu metamfetaminu a MDMA v tajných laboratořích a odpovídajícím snížením jejich čistoty (Winstock et al. 2011b, Brunt et al. 2011). Vzhledem k tomu, že zneužívání β-ketoamfetaminů stále roste, seznam jejich nežádoucích účinků se rozrostl o kardiovaskulární komplikace, agitovanost, nespavost, psychózy a deprese (Schifano et al. 2011, Prosser a Nelson 2012).
Vzhledem k tomu, že β-ketoamfetaminy jsou chemickými příbuznými metamfetaminu a MDMA, není překvapivé, že mají na centrální nervový systém mnoho stejných účinků jako tyto první drogy. Tyto drogy například blokují dopaminové (DA) a serotoninové (5-HT) transportéry (DAT, resp. SERT) (Cozzi et al. 1999, Rothman et al. 2003, Fleckenstein et al. 2000, Lopez-Arnau et al. 2012) a stimulují uvolňování monoaminů in vitro (Kalix a Glennon 1986, Gygi et al. 1997, Rothman et al. 2003) a in vivo (Gygi et al. 1997, Kehr et al. 2011). Metkatinon způsobuje trvalé snížení aktivity tryptofanhydroxylázy a tyrosinhydroxylázy (TH) a vyčerpání DA a 5-HT (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). PET zobrazovací studie u abstinujících uživatelů metkatinonu odhalily sníženou striatální hustotu DAT, což naznačuje úbytek DA terminálů (McCann et al. 1998). Současná stimulace uvolňování DA a inhibice jeho vychytávání odráží kritické prvky, které jsou základem neurotoxicity spojené s metamfetaminem (Kuhn et al. 2008, Yamamoto a Bankson 2005, Cadet et al. 2007, Fleckenstein et al. 2007).
My (Angoa-Perez et al. 2012) a další (Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011) jsme nedávno zkoumali možnost, že by mefedron mohl způsobovat neurotoxicitu podobně jako metamfetamin a MDMA. Překvapivě mefedron nebyl toxický pro DA nervová zakončení striata (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Otázka, zda mefedron poškozuje nervová zakončení 5-HT, zůstává nevyřešena, protože jedna studie dokumentovala pozitivní účinky (Hadlock et al. 2011), zatímco jiná byla negativní (Baumann et al. 2012). Vzhledem k relativně příznivému účinku mefedronu na nervová zakončení DA a s ohledem na jeho vlastnosti jako blokátoru DAT jsme předpokládali, že by mohl skutečně chránit neuronální systém DA před neurotoxickými účinky metamfetaminu podobně, jako je to známo u jiných blokátorů DAT, jako je kyselina amfonelová (Pu et al. 1994, Schmidt a Gibb 1985, Marek et al. 1990) a nomifensin (Poth et al. 2012). V současnosti uvádíme, že mefedron významně zvyšuje neurotoxicitu metamfetaminu. Tento účinek se rozšiřuje i na amfetamin a MDMA, drogy, které se často užívají společně s mefedronem (Feyissa a Kelly 2008, Schifano et al. 2011). Tyto překvapivé výsledky vrhají na zneužívání mefedronu nové světlo a dodávají naléhavost uznání této nenápadné a nebezpečné vlastnosti tohoto β-ketoamfetaminu.
Materiály a metody
Drogy a činidla
Mefedron hydrochlorid a 3,4-methylendioxymetamfetamin (MDMA) byly získány z programu NIDA Research Resources Drug Supply Program. (+) Metamfetamin hydrochlorid, nomifensin maleát, d-amfetamin sulfát, pentobarbital, DA a všechny pufry a HPLC činidla byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Soupravy pro stanovení bílkovin kyseliny bikinchoninové byly získány od společnosti Pierce (Rockford, IL, USA). Polyklonální protilátky proti krysí TH byly vyrobeny podle předchozího popisu (Kuhn a Billingsley 1987). Monoklonální protilátky proti krysímu DAT velkoryse poskytla Dr. Roxanne A. Vaughan (University of North Dakota, Grand Forks, ND, USA). Sekundární protilátky anti-IgG konjugované s HRP poskytla společnost Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc (West Grove, PA, USA).
Zvířata
Samice myší C57BL/6 (Harlan, Indianapolis, IN, USA) vážící v době pokusu 20-25 g byly umístěny po 5 v každé kleci ve velkých klecích typu shoe-box v místnosti s kontrolovaným světlem (12 h světlo/tma) a teplotou. Byly použity myší samice, protože je známo, že jsou velmi citlivé na poškození neuronů neurotoxickými amfetaminy, a aby byla zachována konzistence s našimi předchozími studiemi neurotoxicity metamfetaminu (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Myši měly volný přístup k potravě a vodě. Institucionální výbor pro péči a použití na Wayne State University schválil péči o zvířata a experimentální postupy. Všechny postupy byly rovněž v souladu s Příručkou NIH pro péči o laboratorní zvířata a jejich používání.
Farmakologické, fyziologické a behaviorální postupy
Myši byly léčeny mefedronem pomocí binge-like režimu sestávajícího ze 4 injekcí 10, 20 nebo 40 mg/kg s dvouhodinovým intervalem mezi jednotlivými injekcemi. Tento režim léčby binge, pokud se používá k injekčnímu podání substituovaných amfetaminů a katinonových derivátů, vede k rozsáhlému poškození DA nervových zakončení. Dávky mefedronu používané v současnosti se dříve ukázaly jako netoxické pro DA nervová zakončení (Angoa-Perez et al. 2012). Myším byl podáván metamfetamin (4× 2,5 nebo 5 mg/kg), amfetamin (4× 5 mg/kg) nebo MDMA (4× 20 mg/kg) samostatně nebo v kombinaci s mefedronem. Při léčbě dvěma drogami dostaly myši injekci mefedronu 30 minut před každou ze 4 injekcí metamfetaminu, amfetaminu nebo MDMA. Kontrolní skupiny dostaly injekce fyziologického roztoku podle stejného schématu, jaké bylo použito pro mefedron samotný nebo v kombinaci s jinými amfetaminy. Jako kontrola účinků inhibitoru DAT na toxicitu metamfetaminu byl myším 30 minut před každou injekcí metamfetaminu (4x 5 mg/kg) podán nomifensin (4x 5 mg/kg). Všechny injekce byly podány i.p. cestou. Myši byly usmrceny 2 dny po poslední léčbě, kdy neurotoxicita spojená s amfetaminem dosáhla maxima. Tělesná teplota byla monitorována telemetricky pomocí implantovatelných teplotních transpondérů IPTT-300 společnosti Bio Medic Data Systems, Inc (Seaford, DE, USA). Teplota byla zaznamenávána neinvazivně každých 20 minut počínaje 60 minut před první injekcí METH a pokračuje po dobu 9 hodin poté pomocí konzolového systému DAS-5001 od společnosti Bio Medic.
Stanovení striatálního obsahu DA
Striatální tkáň byla po léčbě oboustranně vypreparována z mozku a uložena při -80 °C. Zmrazené tkáně byly zváženy a sonikovány v 10 objemech 0,16 N kyseliny chlorovodíkové při 4 °C. Nerozpustný protein byl odstraněn centrifugací a DA byl stanoven pomocí HPLC s elektrochemickou detekcí, jak bylo dříve popsáno pro metamfetamin (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
Stanovení hladin proteinů TH a DAT pomocí imunoblotu
Účinky léčby léky na striatální hladiny TH a DAT byly stanoveny imunoblottingem jako index toxicity pro striatální DA nervová zakončení. Myši byly po léčbě usmrceny dekapitací a striatum bylo oboustranně vypreparováno. Tkáň byla uložena při -80 °C. Zmrazená tkáň byla narušena sonikací v 1% SDS při 95 °C a nerozpustný materiál byl sedimentován centrifugací. Protein byl stanoven metodou kyseliny bicinchoninové a stejná množství proteinu (70 μg/l) byla rozdělena elektroforézou v SDS-polyakrylamidovém gelu a poté elektrolotována na nitrocelulózu. Bloty byly blokovány ve fyziologickém roztoku pufrovaném Trisem obsahujícím Tween 20 (0,1 % v/v) a 5 % netučného sušeného mléka po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Na bloty byly přidány primární protilátky proti TH (1:1000) nebo DAT (1:1000) a nechaly se inkubovat 16 h při 4 °C. Bloty byly 3x promyty ve fyziologickém roztoku pufrovaném Tris, aby se odstranily nezreagované protilátky, a poté inkubovány s HRP-konjugovanou sekundární protilátkou anti-IgG (1:4000) po dobu 1 h při pokojové teplotě. Imunoreaktivní pásy byly vizualizovány zvýšenou chemiluminiscencí a relativní hustota pásů reagujících s TH a DAT byla stanovena zobrazením pomocí Kodak Image Station (Carestream Molecular Systems, Rochester, NY, USA) a kvantifikována pomocí softwaru ImageJ (NIH).
Analýza dat
K analýze účinků dávky metamfetaminu oproti mefedronu na DA, DAT a TH byly provedeny dvoucestné ANOVA. Účinky léčby léky na striatální obsah DA, TH a DAT byly testovány na významnost pomocí jednosměrné ANOVA a následného Tukeyho testu vícenásobného srovnání. Výsledky léčby léky na teplotu tělesného jádra v čase byly analyzovány pomocí dvoucestné ANOVA následované Bonferroniho testem ke zjištění významnosti rozdílů v teplotě v jednotlivých časech po léčbě. Rozdíly byly považovány za významné, pokud p < 0,05. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí programu GraphPad Prism verze 5.02 pro Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com).
Přejděte na následující stránku:
Výsledky
Účinky mefedronu na neurotoxicitu vyvolanou metamfetaminem
Mefedron v dávkách (10, 20 nebo 40 mg/kg), o nichž je známo, že nezpůsobují toxicitu DA nervových zakončení (Angoa-Perez et al. 2012), byl podáván 30 minut před každou injekcí metamfetaminu. Metamfetamin byl podáván v dávkách, které způsobují střední (4x 2,5 mg/kg) nebo těžké (4x 5 mg/kg) poškození DA nervových zakončení striata (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). Výsledky uvedené na obr. 1 ukazují, že hlavní účinky dávky metamfetaminu (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) a dávky mefedronu (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) na hladiny DA ve striatu byly vysoce významné podle dvoucestné ANOVA. Hlavní účinek mefedronu podaného v kombinaci s 2,5 mg/kg (F4,22 = 35,96, p < 0,001) nebo 5,0 mg/kg metamfetaminu (F4,17 = 953,9, p < 0,0001) byl rovněž vysoce významný pomocí jednocestné ANOVA. Všechna ošetření s kteroukoli dávkou metamfetaminu ± mefedronu způsobila významně větší snížení DA ve srovnání s příslušnou kontrolou (p < 0,0001 pro všechny). Obr. 1 také ukazuje, že dávky mefedronu 20 (p < 0,01) a 40 mg/kg (p < 0,001) významně zesílily depleční účinky metamfetaminu 2,5 mg/kg na DA, zatímco všechny dávky mefedronu významně zesílily účinky metamfetaminu 5,0 mg/kg na hladiny DA (p < 0,0001 pro všechny).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/sywobkqrnd-jpg.47/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Obr.1
Účinky mefedronu na metamfetaminem indukované snížení striatálního DA. Myši byly ošetřeny uvedenými dávkami mefedronu (MEPH) 30 minut před každou injekcí 2,5 (-) nebo 5,0 mg/kg (■) metamfetaminu (METH) a o 2 dny později usmrceny pro stanovení striatálních hladin DA pomocí HPLC. Údaje jsou průměrné ± SEM pro 5-7 myší z každé skupiny. Některé chybové úsečky byly příliš malé na to, aby přesáhly velikost symbolů, a nejsou viditelné. ***p < 0,001 oproti kontrolám a #p < 0,01, ##p < 0,001 nebo ###p < 0,0001 oproti příslušné dávce metamfetaminu (Tukeyho test mnohonásobného srovnání).
Obr. 2a ukazuje, že mefedron významně zvýšil snížení hladin DAT vyvolané metamfetaminem, jak bylo stanoveno pomocí imunoblotu. Imunobloty byly kvantifikovány a ve shodě s výsledky pro DA byly hlavní účinky dávky metamfetaminu (F1,92 = 9,48, p < 0,001) a dávky mefedronu (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) na hladiny DAT ve striatu vysoce významné pomocí dvoucestné ANOVA (obr. 2b). Hlavní účinek mefedronu podaného v kombinaci s 2,5 mg/kg (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) nebo 5,0 mg/kg metamfetaminu (F4,39 = 24,84, p < 0,0001) byl vysoce významný také pomocí jednocestné ANOVA. Všechna ošetření s kteroukoli dávkou metamfetaminu ± mefedronu způsobila významně větší snížení DAT ve srovnání s příslušnou kontrolou (p < 0,01 pro samotný metamfetamin 2,5 mg/kg; p < 0,0001 pro všechna ostatní ošetření). Obr. 2b rovněž ukazuje, že dávky mefedronu 20 mg/kg (p < 0,01) a 40 mg/kg (p < 0,001) významně zvýšily snížení DAT způsobené metamfetaminem 2,5 mg/kg, zatímco pouze dávka mefedronu 40 mg/kg významně zvýšila (p < 0,01) účinky metamfetaminu 5,0 mg/kg na snížení DAT.
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/bfu3sx5dnr-jpg.4797/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Obr. 2
Účinky mefedronu na metamfetaminem indukované snížení striatální DAT. Myši byly ošetřeny uvedenými dávkami mefedronu (MEPH) 30 minut před každou injekcí 2,5 (●) nebo 5,0 mg/kg (■) metamfetaminu (METH) a o 2 dny později usmrceny pro stanovení striatálních hladin DAT pomocí imunoblotu (a). Bloty byly kvantifikovány pomocí ImageJ a údaje jsou průměrem ± SEM pro 10-12 myší z každé skupiny (b). *p < 0,01 nebo ***p < 0,0001 oproti kontrole (C) a #p < 0,01 nebo ##p < 0,001 oproti příslušné dávce metamfetaminu (Tukeyho test mnohonásobného srovnání).
Obr. 3a ukazuje, že mefedron významně zvýšil snížení hladin TH vyvolané metamfetaminem, jak bylo stanoveno pomocí imunoblotu. Imunobloty byly kvantifikovány a ve shodě s výše uvedenými výsledky pro DA a DAT byly hlavní účinky dávky metamfetaminu (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) a dávky mefedronu (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) vysoce významné pomocí dvoucestné ANOVA (obr. 3b). Hlavní účinek mefedronu podaného v kombinaci s 2,5 mg/kg (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) nebo 5,0 mg/kg metamfetaminu (F4,49 = 99,16, p < 0,0001) byl vysoce signifikantní také pomocí jednocestné ANOVA. Všechna ošetření s kteroukoli dávkou metamfetaminu ± mefedronu způsobila významně větší snížení TH ve srovnání s příslušnou kontrolou (p < 0,001 pro 2,5 mg/kg metamfetaminu + 10 mg/kg mefedronu; p < 0,0001 pro všechny ostatní kombinace) s výjimkou samotného 2,5 mg/kg metamfetaminu, který hladiny TH významně nezměnil (tj. žádná toxicita). Obr. 3b také ukazuje, že dávky mefedronu 20 mg/kg (p < 0,01) a 40 mg/kg (p < 0,001) významně zvýšily snížení TH způsobené metamfetaminem 2,5 mg/kg a všechny tři dávky mefedronu významně (p < 0,0001) zvýšily účinky metamfetaminu 5,0 mg/kg na snížení TH.
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/tggfrjpqru-jpg.4798/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Obr. 3
Účinky mefedronu na metamfetaminem indukované snížení striatálního TH. Myši byly ošetřeny uvedenými dávkami mefedronu (MEPH) 30 min před každou injekcí 2,5 (●) nebo 5,0 mg/kg (■) metamfetaminu (METH) a o 2d později usmrceny pro stanovení striatálních hladin TH pomocí imunoblotu (a). Bloty byly kvantifikovány pomocí ImageJ a údaje jsou průměrem ± SEM pro 10-12 myší z každé skupiny (b). Některé chybové úsečky byly příliš malé na to, aby přesáhly velikost symbolů, a nejsou viditelné. **p < 0,001 nebo ***p < 0,0001 oproti kontrole (C) a #p < 0,01, ##p < 0,001 nebo ###p < 0,0001) oproti příslušné dávce metamfetaminu (Tukeyho test mnohonásobného srovnání).
Účinky mefedronu na hypertermii vyvolanou metamfetaminem
Mefedron, stejně jako metamfetamin, způsobuje významnou hypertermii (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Když byl mefedron podán 30 minut před každou injekcí metamfetaminu, je na obr. 4 vidět, že hlavní účinky dávek metamfetaminu a mefedronu (F1,300 = 11,99, p < 0,0001) v čase (F4,300 = 51,73, p < 0,0001) byly vysoce významné pomocí dvoucestné ANOVA. Hlavní účinky mefedronu podaného v kombinaci buď s 2,5 mg/kg metamfetaminu (F4,120 = 41,44, p < 0,0001, panel a) v čase (F30,120 = 3,84, p < 0,0001), nebo 5,0 mg/kg metamfetaminu (F4,120 = 78,09, p < 0,0001, panel b) v čase (F30,120 = 9,98, p < 0,0001) byly rovněž vysoce významné pomocí dvoucestné ANOVA. Všechna ošetření s kteroukoli dávkou metamfetaminu ± mefedronu se významně lišila od příslušných kontrol (p < 0,0001 pro všechna ošetření).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/x0ik9hdwsw-jpg.4799/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Obr. 4
Účinky mefedronu na hypertermii vyvolanou metamfetaminem. Myším byly podávány uvedené dávky mefedronu (MEPH) 30 minut před každou injekcí 2,5 (a) nebo 5,0 mg/kg (b) metamfetaminu (METH). Teplota jádra byla měřena ve 20minutových intervalech pomocí telemetrie počínaje 60 min před první injekcí metamfetaminu. Čtyři injekce metamfetaminu jsou označeny šipkami spočívajícími na ose x. Údaje jsou vyjádřeny jako průměrná tělesná teplota 6-8 myší z každé skupiny. SEM byly vždy < 10 % průměru a pro přehlednost jsou vynechány.
Účinky mefedronu na neurotoxicitu vyvolanou amfetaminem a MDMA
Za účelem otestování, zda by se zesilující účinky mefedronu na metamfetamin mohly rozšířit i na další neurotoxické amfetaminy, byly myši léčeny tímto β-ketoamfetaminem (20 mg/kg) plus amfetaminem (4x 5 mg/kg) nebo MDMA (4x 20 mg/kg) a výsledky jsou uvedeny na obr. 5. Na obr. 5 je znázorněna účinnost mefedronu na amfetamin. Připomeňme, že samotný mefedron nesnižuje striatální DA, DAT ani TH (Angoa-Perez et al. 2012). Hlavní účinek léčiva (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) byl vysoce významný podle jednocestné ANOVA pro snížení DA (obr. 5a). Na obr. 5a je také vidět, že všechna ošetření amfetaminem (p < 0,001) nebo MDMA (p < 0,001) samostatně nebo v kombinaci s mefedronem (p < 0,0001 pro obě léčiva) významně snížila hladiny DA oproti kontrole. Mefedron významně zvýšil snížení DA způsobené amfetaminem (p < 0,01) nebo MDMA (p < 0,01). Obr. 5b ukazuje podobné účinky kombinované léčby léky na hladiny DAT ve striatu. Hlavní účinek léčiva (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) byl vysoce významný pomocí jednocestné ANOVA pro DAT. Na obr. 5b je také vidět, že všechny léčby amfetaminem nebo MDMA byly ve srovnání s kontrolou významně (p < 0,0001 pro všechny) nižší. Mefedron také významně zvýšil snížení DAT způsobené amfetaminem nebo MDMA (p < 0,0001 v obou případech). A konečně obr. 5c ukazuje, že hlavní účinek léčiva (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) byl vysoce významný podle jednocestné ANOVA pro snížení TH. Na obr. 5c je také vidět, že všechny procedury s amfetaminem nebo MDMA byly ve srovnání s kontrolou významně (p < 0,0001 pro všechny) nižší. Mefedron také významně zvýšil snížení TH způsobené amfetaminem nebo MDMA (p < 0,0001 v obou případech).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/onvypkgxvn-jpg.4800/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Obr. 5
Účinky mefedronu na neurotoxicitu DA nervových zakončení vyvolanou amfetaminem nebo MDMA. Myším bylo 30 minut před každou injekcí 5,0 mg/kg amfetaminu (AMPH) nebo 20 mg/kg MDMA podáno 20 mg/kg mefedronu (MEPH) a 2d po léčbě byly usmrceny pro stanovení striatálních hladin a) DA pomocí HPLC. (b) DAT a (c) TH byly stanoveny imunoblotováním a bloty byly kvantifikovány pomocí ImageJ. Reprezentativní imunobloty pro DAT a TH jsou zahrnuty jako vložky do panelů (b) a (c) a léčby pro oba panely jsou označeny 1,5: kontrola; 2,6: MEPH; 3: AMPH; 4: AMPH + MEPH; 7: MDMA; a 8: MDMA + MEPH. Údaje jsou průměrné ± SEM pro 5-12 myší v každé skupině. **p < 0,001 nebo ***p < 0,0001 oproti kontrole a #p < 0,01 nebo ###p < 0,0001 oproti AMPH nebo MDMA (Tukeyho test mnohonásobného porovnání).
Účinky nomifensinu na neurotoxicitu vyvolanou metamfetaminem
Nomifensin, silný blokátor DAT bez známého zneužívacího nebo neurotoxického potenciálu, byl testován na schopnost chránit před neurotoxicitou vyvolanou metamfetaminem a na kontrast k účinkům mefedronu na toxicitu DA nervových zakončení způsobenou metamfetaminem, amfetaminem a MDMA. Výsledky na obr. 6a ukazují, že hlavní účinek léčiva (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) na hladiny DA byl vysoce významný podle jednocestné ANOVA. Samotný nomifensin hladiny DA nezměnil, ale snížení způsobené metamfetaminem (p < 0,0001) bylo mírně, ale významně zvráceno nomifensinem (p < 0,01). Hlavní účinek léčiva (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) na hladiny DAT byl vysoce významný pomocí jednosměrné ANOVA, jak ukazuje obr. 6b. Nomifensin hladiny DAT nezměnil, ale poskytl významnou ochranu (p < 0,001) před snížením striatálního DAT způsobeným metamfetaminem (p < 0,0001) ve srovnání s kontrolou. Konečně obr. 6c ukazuje, že hlavní účinek léčiva (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) na hladiny TH byl vysoce významný pomocí jednocestné ANOVA. Stejně jako v případě DA a DAT bylo snížení TH způsobené metamfetaminem (p < 0,0001) mírně, ale významně zabráněno nomifensinem (p < 0,01).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/daczg9cwfv-jpg.4801/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Obr. 6
Účinky nomifensinu na neurotoxicitu DA nervových zakončení vyvolanou metamfetaminem. Myším bylo 30 min před každou injekcí 5,0 mg/kg metamfetaminu (METH) podáno 5,0 mg/kg nomifensinu (NOM) a o 2 d později byly usmrceny pro stanovení striatálních hladin (a) DA pomocí HPLC. (b) DAT a (c) TH byly stanoveny imunoblotováním a bloty byly kvantifikovány pomocí ImageJ. Reprezentativní imunobloty pro DAT a TH jsou uvedeny jako vložky k panelům (b) a (c). Údaje jsou průměrné plus SEM pro 5-7 myší na skupinu. ***p < 0,0001 oproti kontrole (C) a #p < 0,01 nebo ##p < 0,001 oproti samotnému metamfetaminu (Tukeyho test mnohonásobného srovnání).
Diskuse
Cílem této studie bylo zjistit, zda mefedron zabrání toxicitě DA nervových zakončení způsobené metamfetaminem. Na základě jeho chemické podobnosti s metamfetaminem a MDMA se původně očekávalo, že mefedron bude mít škodlivé účinky na DA neuronální systém. Několik studií však téměř současně prokázalo, že mefedron není pro nervová zakončení DA toxický (Angoa-Perez et al. 2012, Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011). Otázka, zda tato droga způsobuje poškození neuronálního systému 5-HT, zůstává otevřená. Jedna studie uvádí trvalé snížení funkce nervových zakončení 5-HT (Hadlock et al. 2011), zatímco jiná zjistila, že mefedron poškození nezpůsobuje (Baumann et al. 2012). Mefedron interaguje s nervovým zakončením DA způsobem, který naznačuje, že skutečně stimuluje uvolňování a blokuje zpětné vychytávání DA prostřednictvím interakcí s DAT. Klíčovým aspektem neurotoxického mechanismu účinku metamfetaminu je jeho schopnost získat přístup k DA nervovým zakončením prostřednictvím DAT a narušit homeostázu DA (Sulzer 2011). Pokud se tomuto časnému kroku v neurotoxické kaskádě metamfetaminu zabrání inhibicí DAT, je toxicitě zabráněno (Pu et al. 1994, Poth et al. 2012, Marek et al. 1990, Schmidt a Gibb 1985). Předpokládali jsme, že mefedron by mohl mít stejnou ochrannou vlastnost jako jiné inhibitory DAT, ale místo toho jsme pozorovali výrazné zvýšení toxicity. Tato interakce byla pozorována při použití dvou různých dávek metamfetaminu, které způsobují střední nebo těžké poškození DA nervových zakončení (4x 2,5, resp. 5,0 mg/kg). Tento zesilující účinek mefedronu se neomezoval pouze na metamfetamin a rozšířil se i na amfetamin a MDMA, dvě drogy, které se často užívají společně s mefedronem a dalšími β-ketoamfetaminy (Feyissa a Kelly 2008, Schifano et al. 2011, Kelly 2011). Proto navzdory skutečnosti, že mefedron nezpůsobuje toxicitu alespoň DA nervových zakončení striata, zesiluje neurotoxické účinky jiných drog zneužívání. Toto nové zjištění by mělo zneužívání mefedronu postavit do ještě ostřejšího světla, protože jeho nedostatečná vlastní neurotoxicita může způsobit, že se bude jevit jako neškodný.
Hypertermie je běžně hlášený akutní nežádoucí účinek požití metamfetaminu (Greene et al. 2008) a β-ketoamfetaminu u lidí (Borek a Holstege 2012, Prosser a Nelson 2012). Stejně jako metamfetamin způsobují i mnohé z β-ketoamfetaminových drog výrazné zvýšení tělesné teploty u hlodavců (Angoa-Perez et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Rockhold et al. 1997). Hypertermie způsobená metamfetaminem by sice mohla přispívat k jeho morfologickým a neuronům škodlivým účinkům, nemusí však nutně platit, že hypertermie je přímou příčinou těchto účinků (Kiyatkin a Sharma 2009). U myší léčených mefedronem a metamfetaminem jsme zaznamenávali teplotu tělesného jádra a pozorovali jsme, že kombinovaná léčba nezvýšila teplotu nad maximální zvýšení pozorované po jedné z obou drog samostatně. Metamfetamin způsobil zvýšení tělesné teploty v závislosti na dávce a tato hypertermie byla neměnná v celém testovaném rozsahu dávek mefedronu. Pokles tělesné teploty po injekci pozorovaný po léčbě mefedronem (Angoa-Perez et al. 2012) se ve skutečnosti zachoval i při vyšších dávkách mefedronu plus metamfetaminu. Přestože hypertermie vyvolaná léky nebyla kombinovanou léčbou zesílena, neurotoxické účinky byly aditivní. Zdá se tedy, že přinejmenším v tomto případě mohou být neurotoxické účinky metamfetaminu zesíleny mefedronem způsobem, který je nezávislý na hypertermii.
Mefedron jasně inhibuje funkci DAT a blokuje zpětné vychytávání DA in vitro (Lopez-Arnau et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Kehr et al. 2011, Martinez-Clemente et al. 2012, Cozzi et al. 1999). Mefedron vytěsňuje WIN-35,428 z jeho vazebného místa na DAT, což naznačuje, že je kompetitivním inhibitorem vychytávání DA (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). Účinnost mefedronu je v tomto ohledu velmi podobná účinnosti metamfetaminu (Cozzi et al. 1999) a MDMA (Escubedo et al. 2011). Není známo, zda je mefedron transportován DAT, ale methcathinon ano (Cozzi a Foley 2003). Nomifensin a kyselina amfonelová, které se vážou na DAT a inhibují vychytávání DA, poskytují značnou ochranu před neurotoxicitou vyvolanou metamfetaminem (Pu et al. 1994, Marek et al. 1990, Schmidt a Gibb 1985, Poth et al. 2012) a myši bez DAT jsou rezistentní vůči neuronální toxicitě metamfetaminu (Fumagalli et al. 1998). Vědomí, že mefedron není neurotoxický a je blokátorem DAT, vede k předpokladu, že by měl toxicitě zabránit. V tomto ohledu jsme testovali nomifensin jako pozitivní kontrolu a potvrdili jsme, že chrání před deplecí DA, DAT a TH vyvolanou metamfetaminem. Nomifensin také inhibuje norepinefrinový transportér (Brogden et al. 1979), ale tato vlastnost nemůže vysvětlit současné výsledky, protože většina β-ketoamfetaminů včetně mefedronu inhibuje norepinefrinový transportér a blokuje vychytávání norepinefrinu (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). Úloha neuronálního systému 5-HT v některých farmakologických účincích mefedronu je možná vzhledem ke schopnosti této drogy, podobně jako MDMA (Yamamoto et al. 1995), způsobovat vyplavování striatálního DA prostřednictvím interakcí s receptory 5-HT2A (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). Hyperlokomoce způsobená mefedronem je závislá na endogenním 5-HT (Lopez-Arnau et al. 2012) a tento lék také stimuluje uvolňování 5-HT a inhibuje jeho vychytávání in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) a in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). Úlohu endogenního 5-HT v DA neurotoxicitě přinejmenším metamfetaminu však můžeme vyloučit tím, že jsme prokázali, že myši geneticky ochuzené o 5-HT si zachovávají citlivost na neurotoxicitu (Thomas et al. 2010).
Mefedron by mohl zvýšit neurotoxicitu metamfetaminu několika možnými mechanismy. Zaprvé by mefedron mohl interagovat s VMAT a způsobit únik DA do cytoplazmy presynaptického nervového zakončení. Léčba, která zvyšuje cytoplazmatický pool (tj. uvolnitelný lékem) DA, zvyšuje neurotoxicitu metamfetaminu (Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009, Schmidt et al. 1985). Tento mechanismus není pravděpodobný, protože methcathinon interaguje s VMAT jen slabě (Cozzi et al. 1999). Za druhé, kombinace mefedronu a metamfetaminu by mohla mít synergický účinek na nevezikulární uvolňování DA, ale tato možnost se zdá být také nepravděpodobná ve světle výsledků, které ukazují, že léčba buněk CHO exprimujících DAT nebo SERT metylonem a metamfetaminem nemá aditivní účinek na uvolňování DA nebo 5-HT (Sogawa et al. 2011). Za třetí, mefedron by mohl interagovat s DAT novým způsobem, který přispívá k aditivní toxicitě. Bylo prokázáno, že methylon v kombinaci s metamfetaminem způsobuje synergickou cytotoxicitu v buňkách CHO exprimujících DAT nebo SERT, ale nikoli v buňkách CHO divokého typu, které tyto transportéry postrádají (Sogawa et al. 2011). Cytotoxicita pozorovaná u kultivovaných buněk v těchto studiích (tj. uvolňování LDH) je velmi odlišná od poškození DA nervových zakončení způsobeného metamfetaminem, ale tento mechanismus naznačuje zajímavou, ale nedefinovanou roli DAT ve zvýšené cytotoxicitě. A konečně, mefedron by mohl změnit metabolismus metamfetaminu. Mefedron je primárně metabolizován N-demetylací (Meyer a Maurer 2010), stejně jako metamfetamin a MDMA (Caldwell 1976). Podpora tohoto mechanismu vychází z prokázání, že metamfetamin a MDMA vzájemně inhibují tvorbu svých primárních metabolitů a zvyšují plazmatické hladiny drog nad hodnoty pozorované po podání jedné z nich samostatně (Kuwayama et al. 2012). Dávky mefedronu použité v současnosti a v naší předchozí studii (Angoa-Perez et al. 2012) jsou sice vysoké, ale nejsou neurotoxické a spadají do rozmezí dávek zneužívaných lidmi (McErath a O'Neill 2011). Mefedron by tedy mohl působit podobně jako MDMA a zvyšovat plazmatické hladiny metamfetaminu tím, že inhibuje jeho metabolismus. K potvrzení této druhé možnosti bude zapotřebí provést hloubkovou farmakokinetickou analýzu.
Zneužívání β-ketoamfetaminů roste alarmujícím tempem a mefedron je nyní po konopí, MDMA a kokainu jednou z nejčastěji užívaných drog (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Mefedron navíc u lidí vyvolává silnější pocity touhy ve srovnání s MDMA (Brunt et al. 2011) a uživatelé, kteří mefedron šňupou, jej hodnotí jako návykovější než kokain (Winstock et al. 2011b). Mefedron je lidmi konzumován nárazově (tj. "stohováním") a často je užíván s jinými drogami, jako je konopí a amfetaminové psychostimulanty (Schifano et al. 2011, Fass et al. 2012, Winstock et al. 2011a, Kelly 2011, Torrance a Cooper 2010). Mefedron se stále častěji vyskytuje v tabletách prodávaných jako MDMA (Brunt et al. 2011) a jeho užívání pravděpodobně předčí užívání MDMA, protože čistota této druhé drogy stále klesá (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Na základě běžných vzorců zneužívání mefedronu a dalších složek "koupelových solí" je důležité zvážit, zda při záměrné či nevědomé kombinaci těchto drog s amfetaminy vznikají u lidí další zdravotní rizika. Naše výsledky, které ukazují, že přinejmenším mefedron významně zesiluje neurotoxicitu DA nervových zakončení striata způsobenou metamfetaminem, amfetaminem a MDMA, odhalují zvláště nebezpečnou a nečekanou vlastnost tohoto β-ketoamfetaminu.
Použité zkratky
5-HT serotonin
DA dopamin
DAT DA transportér
MDMA 3,4-methylendioxymetamfetamin
TH tyrosinhydroxyláza
VMAT vezikulární monoaminový transportér
