Introduktion
Kolonnekromatografi er en udvidelse af tyndlagskromatografi (TLC). Det antages, at læseren har en vis erfaring med laboratoriepraksis og har beskæftiget sig med tyndlagskromatografi. I stedet for at anbringe en prøve på et tyndt lag silica eller aluminiumoxid, anbringes en prøve på en cylinder med adsorbent, og opløsningsmidlet påføres kontinuerligt med tryk, indtil komponenterne løber helt ud af cylinderen. Med denne modifikation kan komponenter ikke kun adskilles, men også opsamles i forskellige beholdere, hvilket gør det muligt at rense blandinger og adskille lægemidler med forureninger. Kolonnekromatografi (også kendt som "flash-kromatografi") bruges ofte i forskningsmiljøer, hvilket fremgår af dens almindelige forekomst i procedureafsnittene i tidsskriftartikler.
Diskussion af procedurer
De samme underliggende principper for tyndlagskromatografi (TLC) gælder for søjlekromatografi. Faktisk kører man altid en TLC, før man udfører en søjle, for at vurdere situationen og bestemme det rette opløsningsmiddelforhold. For at få en god adskillelse er det ideelt, hvis den ønskede komponent har en Rf på omkring 0,35 (læs om Rf i TLC-emnet) og er adskilt fra andre komponenter med mindst 0,2 Rf-enheder. Hvis de pletter, der skal adskilles, ligger meget tæt (hvis forskellen i Rf er < 0,2), er det bedst, hvis den midterste af pletterne har en Rf på 0,35. En Rf nær 0,35 er ideel, fordi den er langsom nok til, at der kan ske en ligevægt mellem stationær og mobil fase, men hurtig nok til at minimere båndudvidelse fra diffusion.
Der er nogle få variabler, som ikke gælder for TLC, men som påvirker adskillelsen af komponenter i søjlekromatografi. Disse omfatter søjlediameteren, mængden af anvendt adsorbent og opløsningsmidlets flowhastighed. Billede. 1 viser variable anbefalinger baseret på prøvestørrelsen og graden af adskillelse mellem komponenterne. I alle scenarier skal kolonnerne forberedes i en højde på mellem 12,5-15 cm.
Der er nogle få variabler, som ikke gælder for TLC, men som påvirker adskillelsen af komponenter i søjlekromatografi. Disse omfatter søjlediameteren, mængden af anvendt adsorbent og opløsningsmidlets flowhastighed. Billede. 1 viser variable anbefalinger baseret på prøvestørrelsen og graden af adskillelse mellem komponenterne. I alle scenarier skal kolonnerne forberedes i en højde på mellem 12,5-15 cm.
For eksempel bør en kolonne på 2,5 cm kunne oprense omkring 400 mg materiale, hvis adskillelsen er god (ΔRf > 0,2, tredje kolonne i fig. 1), eller omkring 160 mg, hvis adskillelsen er vanskelig (ΔRf > 0,1). Søjlen skal kunne klargøres og elueres med ca. 200 ml opløsningsmiddel, og fraktionerne kan opsamles med ca. 10 ml opløsning hver.
Der er flere variationer af, hvordan man fysisk kører en kolonne. En stor forskel i metoderne er, hvordan kolonnen forberedes. I "dry packing"-metoden tilsættes tør silica eller aluminiumoxid direkte til en kolonne, og opløsningsmidlet får lov til at sive igennem i portioner og derefter med tryk. I "vådpakningsmetoden" fyldes kolonnen først med opløsningsmiddel, derefter rystes tør silica eller aluminiumoxid let ind og pakkes derefter med tryk. I "slurry"-metoden tilsættes opløsningsmiddel til silica eller aluminiumoxid i en Erlenmeyer-kolbe, hældes på søjlen som et slamagtigt materiale og pakkes derefter med tryk (trykket kan produceres med en sprøjte).
Det er vigtigt at vide, at der frigøres varme, når der tilsættes opløsningsmiddel til silica eller aluminiumoxid (de har en eksoterm solvationsvarme). Slurrymetoden præsenteres i dette afsnit, og hovedårsagen er, at den gør det muligt at udføre dette eksoterme trin i en Erlenmeyer-kolbe i stedet for på kolonnen. Hvis der frigøres varme under pakningen af kolonnen, kan det generere bobler fra kogningen af opløsningsmidlet. Disse kan forstyrre adskillelsen af kolonnen, hvis de ikke fjernes tilstrækkeligt, og kan knække det adsorberende materiale i kolonnen.
Der er flere variationer af, hvordan man fysisk kører en kolonne. En stor forskel i metoderne er, hvordan kolonnen forberedes. I "dry packing"-metoden tilsættes tør silica eller aluminiumoxid direkte til en kolonne, og opløsningsmidlet får lov til at sive igennem i portioner og derefter med tryk. I "vådpakningsmetoden" fyldes kolonnen først med opløsningsmiddel, derefter rystes tør silica eller aluminiumoxid let ind og pakkes derefter med tryk. I "slurry"-metoden tilsættes opløsningsmiddel til silica eller aluminiumoxid i en Erlenmeyer-kolbe, hældes på søjlen som et slamagtigt materiale og pakkes derefter med tryk (trykket kan produceres med en sprøjte).
Det er vigtigt at vide, at der frigøres varme, når der tilsættes opløsningsmiddel til silica eller aluminiumoxid (de har en eksoterm solvationsvarme). Slurrymetoden præsenteres i dette afsnit, og hovedårsagen er, at den gør det muligt at udføre dette eksoterme trin i en Erlenmeyer-kolbe i stedet for på kolonnen. Hvis der frigøres varme under pakningen af kolonnen, kan det generere bobler fra kogningen af opløsningsmidlet. Disse kan forstyrre adskillelsen af kolonnen, hvis de ikke fjernes tilstrækkeligt, og kan knække det adsorberende materiale i kolonnen.
Trin-for-trin-procedurer
a) TLC af ferrocen/acetylferrocen-blanding, b) Kolonnekromatografi
Kolonnen på billedet i dette afsnit viser oprensning af en prøve på 0,20 g indeholdende en blanding af ferrocen og acetylferrocen (rå TLC er i fig. 2 a). Ca. 8 ml fraktioner blev opsamlet i små reagensglas, og der blev brugt ca. 400 ml elueringsmiddel.
a) TLC-plade af rå ferrocen/acetylferrocen-blanding før eluering, b) Efter eluering, c) Kolonne med frit, d) Kolonne med bomuldskile i bunden, e) Kolonne uden bomuldskile (skal indsættes før brug)
Kør enTLC
1 ) Kør en TLC på den prøve, der skal renses (fig. 3 a og b), for at bestemme det passende opløsningsmiddel til kromatografi. Den ønskede komponent skal have en Rf på omkring 0,35 og skal ideelt set være adskilt fra alle andre pletter med mindst 0,2 Rf-enheder.
2) Forbered et parti elueringsmiddel, der giver den rette Rf-værdi. Den forberedte mængde afhænger af mængden af prøve, kolonnens størrelse, og om opløsningsmiddelsammensætningen skal ændres undervejs. (Se fig. 1 for retningslinjer og den eluotropiske serie for tendenser i "opløsningsmiddelkraft").
2) Forbered et parti elueringsmiddel, der giver den rette Rf-værdi. Den forberedte mængde afhænger af mængden af prøve, kolonnens størrelse, og om opløsningsmiddelsammensætningen skal ændres undervejs. (Se fig. 1 for retningslinjer og den eluotropiske serie for tendenser i "opløsningsmiddelkraft").
Forbered den pakkede kolonne
3 ) Anskaf en passende kolonne (se fig. 1), og sørg for, at der er noget i nærheden af stophanen, som tillader væske at passere, men ikke fast stof. Kolonner kan have en sintret skive (også kendt som en "fritte"), fig. 3 c), eller en prop af bomuld eller glasuld, der er tilbage fra den tidligere bruger (fig. 3 d). Hvis der ikke er nogen disk eller prop (fig. 3 e), skal du klemme en lille klump bomuld eller glasuld ned i bunden af søjlen med en lang stang.
Fig.
a) Hæld silica op til 12,5-15 cm højde i stinkskabet, b) Hæld silica i en Erlenmeyer-kolbe, c og d) Lav en opslæmning
a) Hæld silica op til 12,5-15 cm højde i stinkskabet, b) Hæld silica i en Erlenmeyer-kolbe, c og d) Lav en opslæmning
Sikkerhedsbemærkning: Pulveriseret silica og aluminiumoxid er lungeirriterende og skal altid håndteres forsigtigt i en stinkskab. Spildt støv skal bortskaffes ved at tørre det op med et vådt stykke køkkenrulle (hvis det er vådt, er de fine partikler mindre spredte).
5) I stinkskabet hældes det adsorbent, der er målt i kolonnen, i en Erlenmeyer-kolbe (fig. 4 b), og derefter tilsættes lidt elueringsmiddel (fig. 4 c). Lav en løs opslæmning ved at svirpe og røre med en glasrørepind (fig. 4 d), indtil alt adsorbent er helt vådt, gasbobler frigives, og konsistensen er noget tyk, men hældbar.
Fig.
a) Hældning af opslæmningen i søjlen, b) Skylning af kolben, c) Adsorbent klæbet til siderne af søjlen, d) Skylning af den klæbende adsorbent
a) Hældning af opslæmningen i søjlen, b) Skylning af kolben, c) Adsorbent klæbet til siderne af søjlen, d) Skylning af den klæbende adsorbent
6 ) Sæt et bægerglas eller en Erlenmeyer-kolbe under den fastspændte søjle, og åbn stophanen. I en hurtig bevægelse hvirvles og hældes silica- eller aluminiumoxidopslæmningen i kolonnen ved hjælp af en tragt med stor munding (fig. 5 a). Brug straks mere elueringsmiddel til at skylle resterende opslæmning ud af Erlenmeyer-kolben (fig. 5 b) og ned på kolonnen.
7 ) Skyl straks eventuel silica eller aluminiumoxid af siderne på søjlereservoiret med elueringsmiddel og en hvirvlende bevægelse fra en pasteurpipette (fig. 5 c og d). Hvis adsorbenten får lov til at tørre, vil den klæbe sig til glasset og ikke være let at skylle ned.
7 ) Skyl straks eventuel silica eller aluminiumoxid af siderne på søjlereservoiret med elueringsmiddel og en hvirvlende bevægelse fra en pasteurpipette (fig. 5 c og d). Hvis adsorbenten får lov til at tørre, vil den klæbe sig til glasset og ikke være let at skylle ned.
Fig.
a) Ryst søjlen for at fjerne luftbobler, b) Påfør lufttryk, c) Tilsæt sand, d) Skyl sand af siderne
a) Ryst søjlen for at fjerne luftbobler, b) Påfør lufttryk, c) Tilsæt sand, d) Skyl sand af siderne
8 ) Skub kolonnen fast med en korkring eller dine knoer (fig. 6 a) for at fjerne eventuelle luftbobler i kolonnen (som kan forårsage dårlig adskillelse eller revnedannelse af adsorbenten i kolonnen) og for at fremme en jævn aflejring af adsorbent.
9) Påfør et let lufttryk på toppen af kolonnen (fig. 6 b) for at komprimere den, og stop, når eluentniveauet er 1 cm fra toppen af kolonnen. Hvis der bruges en T-adapter med luftledningen som i fig. 6 b, kan luftstrømmen finjusteres ved at justere klemmen på gummislangen. Under hele elueringsprocessen skal den hvide søjle med adsorbent holdes våd med elueringsniveauet over toppen af silica eller aluminiumoxid. Bryd forsigtigt forseglingen for at stoppe trykket, og luk stophanen for at forhindre, at der drypper mere væske ud.
10) Tilsæt et tyndt lag sand (fig. 6 c), ca. 0,5 cm højt. Skyl siderne af kolonnen med elueringsvæske med en hvirvlende bevægelse for at løsne sandet fra glassets sider (fig. 6 d). Åbn stophanen, og lad væsken dryppe ud, indtil den er lige over sandlaget. Anvend lufttryk, hvis det går for langsomt med at dryppe.
9) Påfør et let lufttryk på toppen af kolonnen (fig. 6 b) for at komprimere den, og stop, når eluentniveauet er 1 cm fra toppen af kolonnen. Hvis der bruges en T-adapter med luftledningen som i fig. 6 b, kan luftstrømmen finjusteres ved at justere klemmen på gummislangen. Under hele elueringsprocessen skal den hvide søjle med adsorbent holdes våd med elueringsniveauet over toppen af silica eller aluminiumoxid. Bryd forsigtigt forseglingen for at stoppe trykket, og luk stophanen for at forhindre, at der drypper mere væske ud.
10) Tilsæt et tyndt lag sand (fig. 6 c), ca. 0,5 cm højt. Skyl siderne af kolonnen med elueringsvæske med en hvirvlende bevægelse for at løsne sandet fra glassets sider (fig. 6 d). Åbn stophanen, og lad væsken dryppe ud, indtil den er lige over sandlaget. Anvend lufttryk, hvis det går for langsomt med at dryppe.
Tilsætprøven
Når prøven er påført kolonnen, er det et kapløb med tiden, da diffusionen vil begynde at gøre materialet bredere. En prøve bør ikke påføres, før du er klar til at færdiggøre kolonnen med det samme og i sin helhed. Denne proces kan tage mellem 15 og 90 minutter! Hvis man bruger reagensglas til at opsamle fraktioner, skal reagensglassene placeres i et stativ, før prøven tilsættes, og søjlens højde skal justeres, så reagensglasstativet kan glide ind under.
a) Opløsning af et fast stof med en lille mængde dichlormethan, b) Påføring af prøven, c) Skylning af prøven i kolben, d) Tryk for at skubbe prøven op på kolonnen lige forbi sandlaget.
11 ) Hvis råprøven er en væske, bruges den direkte (gå videre til trin 13).
12) Hvis råprøven er et fast stof, skal du gøre en af følgende ting.
12) Hvis råprøven er et fast stof, skal du gøre en af følgende ting.
a) Ideel situation: opløs det faste stof i den mindste mængde af eluenten (højst et par ml).
b) Hvis det faste stof ikke er særligt opløseligt eller ikke kan opløses i nogle få ml af eluenten, opløses det i den mindste mængde dichlormethan (højst nogle få ml, fig. 7 a).
c) Hvis det faste stof er uopløseligt i eluenten, er en alternativ procedure også mulig. Opløs det faste stof i en rundbundet kolbe med nogle få ml af et lavtkogende opløsningsmiddel (f.eks. dichlormethan eller acetone). Tilsæt ca. 1 g silica eller aluminiumoxid til kolben, og fjern derefter opløsningsmidlet på rotationsfordamperen, så der er et fast stof tilbage, som indeholder prøven, der er deponeret på adsorbenten. Med en tomme elueringsmiddel hvilende oven på den pakkede søjle (spring sandlaget over, hvis denne metode anvendes) hældes den silica-adsorberede prøve på søjlen ved hjælp af en tragt med bred munding. Hvis der sidder støv på glasset, skylles det ned med mere elueringsmiddel (gå videre til trin 15).
13) Tilsæt forsigtigt prøven til kolonnen med pipetten, og dryp væsken eller opløsningen direkte på sandet med pipettespidsen så tæt på, som du kan, ikke ned ad siderne (fig. 7 b). Pas på ikke at sprøjte væske ind med magt, så der opstår fordybninger i sandet eller silica/aluminiumoxid-kolonnen.
14) Skyl prøvebeholderen med lidt opløsningsmiddel (eller dichlormethan, hvis det bruges, fig. 7 c), og tilsæt skyllevæsken til kolonnen med den samme pipette (for også at skylle pipetten).
15) Åbn stophanen, og lad væsken dryppe ud, indtil prøven er lige forbi sandlaget (fig. 7 d) og ind i det hvide område af kolonnen (brug lufttryk, hvis det tager mere end 20 sekunder).
16) Skyl forsigtigt siderne af kolonnen med en hvirvlende bevægelse ved hjælp af 1-2 pipetter fyldt med elueringsmiddel for at skylle enhver sprøjtet prøve. Lad igen væsken dryppe ud (eller anvend lufttryk), indtil prøven er skubbet ind i den hvide adsorbent.
Gentag skylletrinnet, indtil du føler dig sikker på, at hele prøven er afsat på adsorbenten. Hvis noget af prøven stadig befinder sig i sandlaget, kan det opløses i eluenten, når der tilsættes mere opløsningsmiddel, hvilket fører til et tab af udbytte. Hvis forbindelsen er farvet, skal skylningen være helt klar.
14) Skyl prøvebeholderen med lidt opløsningsmiddel (eller dichlormethan, hvis det bruges, fig. 7 c), og tilsæt skyllevæsken til kolonnen med den samme pipette (for også at skylle pipetten).
15) Åbn stophanen, og lad væsken dryppe ud, indtil prøven er lige forbi sandlaget (fig. 7 d) og ind i det hvide område af kolonnen (brug lufttryk, hvis det tager mere end 20 sekunder).
16) Skyl forsigtigt siderne af kolonnen med en hvirvlende bevægelse ved hjælp af 1-2 pipetter fyldt med elueringsmiddel for at skylle enhver sprøjtet prøve. Lad igen væsken dryppe ud (eller anvend lufttryk), indtil prøven er skubbet ind i den hvide adsorbent.
Gentag skylletrinnet, indtil du føler dig sikker på, at hele prøven er afsat på adsorbenten. Hvis noget af prøven stadig befinder sig i sandlaget, kan det opløses i eluenten, når der tilsættes mere opløsningsmiddel, hvilket fører til et tab af udbytte. Hvis forbindelsen er farvet, skal skylningen være helt klar.
a og b) Fyldning af opløsningsmiddelreservoiret, c og d) Udskylning af kolonnen
Fyld med elueringsmiddel, og eluer kolonnen
17) Tilsæt forsigtigt mere elueringsmiddel med pipetten (fig. 8 a), mens du hvirvler ned ad siderne, og når sandlaget ikke længere forstyrres af tilsætningerne, hælder du forsigtigt større mængder (fig. 8 b) af det forberedte elueringsmiddel i for at fylde reservoiret (eller fyld så meget på, som der er behov for). Ren elueringsvæske opsamlet under pakningen af søjlen kan genbruges.
18) Brug lufttryk til forsigtigt og støt at eluere prøven gennem kolonnen (fig. 8 c og d). Jo flere gange trykket startes og stoppes, jo større er sandsynligheden for, at søjlen revner. Det er bedst, hvis trykket kan holdes blidt og stabilt hele tiden.
Den optimale dryphastighed under elueringen afhænger af søjlens størrelse. Det ideelle flow af elueringsmiddel er, når opløsningsmidlet i den cylindriske del af kolonnen over adsorbenten falder med 5 cm pr. minut. Derfor bør dryphastigheden være langsommere med en smal søjle sammenlignet med en bredere søjle. Dråbehastigheden for en 1-tommers søjle bør være, hvor de enkelte dråber næsten ikke kan skelnes fra hinanden. En væskestrøm, der løber ud af stophanen med denne størrelse søjle, er lidt for hurtig.
18) Brug lufttryk til forsigtigt og støt at eluere prøven gennem kolonnen (fig. 8 c og d). Jo flere gange trykket startes og stoppes, jo større er sandsynligheden for, at søjlen revner. Det er bedst, hvis trykket kan holdes blidt og stabilt hele tiden.
Den optimale dryphastighed under elueringen afhænger af søjlens størrelse. Det ideelle flow af elueringsmiddel er, når opløsningsmidlet i den cylindriske del af kolonnen over adsorbenten falder med 5 cm pr. minut. Derfor bør dryphastigheden være langsommere med en smal søjle sammenlignet med en bredere søjle. Dråbehastigheden for en 1-tommers søjle bør være, hvor de enkelte dråber næsten ikke kan skelnes fra hinanden. En væskestrøm, der løber ud af stophanen med denne størrelse søjle, er lidt for hurtig.
a-c ) Opsamling af fraktioner, d) Kørsel af en kolonne
Opsamling affraktioner
19) Begynd straks at opsamle elueringsvæsken i reagensglas på et stativ (fig. 9 a). Se fig. 1 for anbefalinger om mængder, der skal opsamles i hvert reagensglas.20) Når det første reagensglas er fyldt, eller hvis der er opsamlet en vis mængde væske som anbefalet af din underviser eller i fig. 1, skal du flytte stativet og begynde at opsamle i et andet reagensglas (fig. 9 b og c). Fyld og opbevar rørene i rækkefølge på stativet.
Disse forskellige rør kaldes "fraktioner". Målet med en kolonne er at opsamle små nok fraktioner til, at de fleste (eller nogle) fraktioner indeholder rent materiale. Hvis det er svært at adskille blandingen (hvis komponenternes ΔRf er lav), kan det være bedst at indsamle små fraktioner (f.eks. halvfyldte rør).
Disse forskellige rør kaldes "fraktioner". Målet med en kolonne er at opsamle små nok fraktioner til, at de fleste (eller nogle) fraktioner indeholder rent materiale. Hvis det er svært at adskille blandingen (hvis komponenternes ΔRf er lav), kan det være bedst at indsamle små fraktioner (f.eks. halvfyldte rør).
a-c ) Skyllemateriale sprøjtet på spidsen af kolonnen, d) Studerende kører en kolonne
21) Når væsken løber ud af kolonnen, sprøjter den ofte på ydersiden af kolonnens spids, og når opløsningsmidlet fordamper, kan du se en ring af materiale på spidsen (du vil se en ring af fast stof, hvis komponenten er et fast stof som i fig. 10 b, eller olieagtige dråber, hvis komponenten er en væske). Hvis komponenterne er farvede, skal søjlespidsen skylles (fig. 10 c), når det ser ud til, at den ene komponent er elueret helt, og før den anden komponent nærmer sig.
22) Hold jævnligt øje med elueringsniveauet, og fyld op, før det falder til under sandlaget.
22) Hold jævnligt øje med elueringsniveauet, og fyld op, før det falder til under sandlaget.
Fig.
a) Eluering, b) Tilsætning af ethylacetat for at øge opløsningsmidlets polaritet, c) Opløsningsmiddelniveauet nærmer sig sandlaget, d) Genopfyldning
a) Eluering, b) Tilsætning af ethylacetat for at øge opløsningsmidlets polaritet, c) Opløsningsmiddelniveauet nærmer sig sandlaget, d) Genopfyldning
Øg muligvis opløsningsmidlets polaritet
23) Der kan bruges én eluent gennem hele kolonnen, især hvis de komponenter, der skal adskilles, har lignende Rf-værdier. Men hvis komponenterne har meget forskellige Rf-værdier, kan opløsningsmidlets polaritet øges, efter at en komponent er elueret fra kolonnen (fig. 11 a).
Hvis man øger opløsningsmidlets polaritet, vil komponenterne bevæge sig "hurtigere". Der er flere grunde til, at man ønsker en hurtigere eluering. For det første, hvis en komponent allerede har forladt kolonnen, har kolonnen allerede gjort sit arbejde med separation, så en hurtigere proces vil ikke påvirke renheden af de opsamlede fraktioner. For det andet: Jo længere tid det tager at køre en kolonne, jo bredere bliver komponentbåndene (på grund af diffusion), og opsamling af et bredt bånd af materiale vil bruge (og spilde) en masse opløsningsmiddel.
Hvis man øger opløsningsmidlets polaritet, vil komponenterne bevæge sig "hurtigere". Der er flere grunde til, at man ønsker en hurtigere eluering. For det første, hvis en komponent allerede har forladt kolonnen, har kolonnen allerede gjort sit arbejde med separation, så en hurtigere proces vil ikke påvirke renheden af de opsamlede fraktioner. For det andet: Jo længere tid det tager at køre en kolonne, jo bredere bliver komponentbåndene (på grund af diffusion), og opsamling af et bredt bånd af materiale vil bruge (og spilde) en masse opløsningsmiddel.
Indeholder en delvis liste over den eluotropiske serie, en liste over almindelige opløsningsmidler rangeret efter deres "opløsningsmiddelkraft" i normalfasekromatografi. Det mere polære opløsningsmiddel forårsager den mest dramatiske stigning i Rf
24) For at øge opløsningsmidlets polaritet kan det polære opløsningsmiddel dryppes direkte ned i eluenten på søjlereservoiret (fig. 11 b). Hvis man f.eks. bruger en blanding af hexan og ethylacetat, vil tilsætning af ren ethylacetat til eluenten i reservoiret øge dens polaritet. Hvis elueringsniveauet er lavt, kan der fremstilles en opløsning, der indeholder en højere procentdel af den mere polære komponent. Hvis kolonnen f.eks. først brugte en 4:1 hexan:ethylacetat-blanding, ville en 1:1-blanding være et mere polært opløsningsmiddel.
25 ) Eluer kolonnen med det mere polære opløsningsmiddel som før, og husk altid at holde øje med elueringsniveauet og genopfyld (fig. 11 d), før det falder under sandlaget.
26) For at øge opløsningsmidlets polaritet kan det polære opløsningsmiddel dryppes direkte ned i eluenten på søjlereservoiret (fig. 11 b). Hvis man f.eks. bruger en hexan:ethylacetat-blanding, vil tilsætning af ren ethylacetat til eluenten i reservoiret øge dens polaritet. Hvis elueringsniveauet er lavt, kan der fremstilles en opløsning, der indeholder en højere procentdel af den mere polære komponent. Hvis kolonnen f.eks. først brugte en 4:1 hexan:ethylacetat-blanding, ville en 1:1-blanding være et mere polært opløsningsmiddel.
27) Eluer kolonnen med det mere polære opløsningsmiddel som før, og husk altid at holde øje med elueringsniveauet og fylde op (fig. 11 d), før det falder under sandlaget.
25 ) Eluer kolonnen med det mere polære opløsningsmiddel som før, og husk altid at holde øje med elueringsniveauet og genopfyld (fig. 11 d), før det falder under sandlaget.
26) For at øge opløsningsmidlets polaritet kan det polære opløsningsmiddel dryppes direkte ned i eluenten på søjlereservoiret (fig. 11 b). Hvis man f.eks. bruger en hexan:ethylacetat-blanding, vil tilsætning af ren ethylacetat til eluenten i reservoiret øge dens polaritet. Hvis elueringsniveauet er lavt, kan der fremstilles en opløsning, der indeholder en højere procentdel af den mere polære komponent. Hvis kolonnen f.eks. først brugte en 4:1 hexan:ethylacetat-blanding, ville en 1:1-blanding være et mere polært opløsningsmiddel.
27) Eluer kolonnen med det mere polære opløsningsmiddel som før, og husk altid at holde øje med elueringsniveauet og fylde op (fig. 11 d), før det falder under sandlaget.
Fig.
a) Original TLC-plade, b) Fraktioner opsamlet af kolonnen, c) Spotting af fraktioner på en TLC-plade, d) En visualiseret TLC-plade med prøver af hver fraktion.
a) Original TLC-plade, b) Fraktioner opsamlet af kolonnen, c) Spotting af fraktioner på en TLC-plade, d) En visualiseret TLC-plade med prøver af hver fraktion.
Find og opkoncentrer den ønskede komponent
28) Når man skal finde den ønskede komponent i reagensglasfraktionerne, er det nyttigt at forstå forholdet mellem Rf og elueringsrækkefølgen i søjlekromatografi.I kolonnekromatografi afsættes prøven foran kolonnen og elueres nedad, mens prøven i tyndlagskromatografi afsættes på bunden af pladen og elueres opad. Derfor kan en søjle betragtes som en TLC-plade, der er vendt på hovedet. En forbindelse med en højere Rf løber "hurtigere", hvilket betyder, at den ender højere på en TLC-plade og vil blive opsamlet først med en kolonne. I den kolonne, der er afbilledet i dette afsnit, er komponenten med den laveste Rf (orange på TLC-pladen i fig. 13 a) den komponent, der opsamles som nummer to fra kolonnen.
29) Bestem først, hvilke reagensglas der indeholder opløste forbindelser.
29) Bestem først, hvilke reagensglas der indeholder opløste forbindelser.
a) Sæt en prøve af hver fraktion på en TLC-plade, der er mærket med fraktionsnumre svarende til den rækkefølge, de blev opsamlet i (fig. 13 c). Det kan være bedst at spotte hver prøve 2-3 gange oven på hinanden, hvis fraktionerne er fortyndede.
b) Hvis der er indsamlet mange fraktioner, og du derfor tøver med at tage prøver af hver fraktion, er en metode til at identificere farveløse fraktioner, der kan indeholde stof, at se efter en antydning af rest, der fører reagensglassene. Efter fordampning efterlades der nogle gange en fast rest (fig. 13) eller oliedråber på toppen af reagensglasset, hvilket gør det tydeligt, at disse fraktioner indeholder mere end bare opløsningsmiddel. Tag prøver af alle fraktioner i nærheden af de rør, der indeholder synlige rester.
Fig.
c) Visualiser den plettede TLC-plade ved hjælp af UV-lys og/eller en farve for at bestemme, hvilke fraktioner der indeholder stoffet (fig. 13 d).
c) Visualiser den plettede TLC-plade ved hjælp af UV-lys og/eller en farve for at bestemme, hvilke fraktioner der indeholder stoffet (fig. 13 d).
Fig.
a) Eluerede TLC-plader med fraktioner, der indeholder mulige forbindelser, b) Kombination af fraktioner, c) Skylning af et fraktionsrør
a) Eluerede TLC-plader med fraktioner, der indeholder mulige forbindelser, b) Kombination af fraktioner, c) Skylning af et fraktionsrør
28) Kør en TLC af alle fraktioner, der indeholder forbindelse, og spot op til fem prøver pr. 2,5 cm bred TLC-plade. Bredere TLC-plader kan bruges til dette formål, hvis de er tilgængelige.
29) Identificer forbindelsen med den ønskede Rf ved at sammenligne med den oprindelige rå TLC-plade. Vælg at beholde de fraktioner, der har den ønskede forbindelse i ren form, som det fremgår af den eluerede TLC-plade. Hvis man f.eks. ønsker forbindelsen med den højeste Rf i Fig. 15 a, skal fraktionerne 6-10 bevares.
30) Kombiner de rene fraktioner i en rundbundet kolbe af passende størrelse (ikke mere end halvfuld, fig. 15 b). Skyl hvert reagensglas med en lille mængde elueringsmiddel (eller et andet opløsningsmiddel, hvis opløselighed er et problem), og tilsæt skyllevæsken til den rundbundede kolbe (fig. 15 c).
31) Fordamp opløsningsmidlet på rotationsfordamperen, så den rensede forbindelse bliver tilbage i kolben.
29) Identificer forbindelsen med den ønskede Rf ved at sammenligne med den oprindelige rå TLC-plade. Vælg at beholde de fraktioner, der har den ønskede forbindelse i ren form, som det fremgår af den eluerede TLC-plade. Hvis man f.eks. ønsker forbindelsen med den højeste Rf i Fig. 15 a, skal fraktionerne 6-10 bevares.
30) Kombiner de rene fraktioner i en rundbundet kolbe af passende størrelse (ikke mere end halvfuld, fig. 15 b). Skyl hvert reagensglas med en lille mængde elueringsmiddel (eller et andet opløsningsmiddel, hvis opløselighed er et problem), og tilsæt skyllevæsken til den rundbundede kolbe (fig. 15 c).
31) Fordamp opløsningsmidlet på rotationsfordamperen, så den rensede forbindelse bliver tilbage i kolben.
a) Brug af lufttryk til at tørre kolonnen, b) Lad kolonnen tørre med hovedet nedad, c) Opsamling af silicaaffald
Rengøring af søjlen
32) For at tørre søjlen skal du anvende lufttryk til at dræne størstedelen af eluenten fra søjlen til en affaldsbeholder. Tør derefter kolonnen yderligere ved hjælp af en af disse metoder.
a) Lad en let luftstrøm løbe gennem søjlen for at tørre den yderligere, mens du rydder op i andre ting (fig. 16 a).
b) Spænd søjlen fast på hovedet over et stort affaldsbæger i stinkskabet, så adsorbenten falder ned, når den er tørret (fig. 16 b ). Det vil tage lang tid (indtil næste time), men det er en mulighed.
33) Når adsorbenten er tør, kan den hældes ud af kolonnen og ned i en affaldsbeholder i stinkskabet (fig. 16 c).
Sikkerhedsbemærkning: Adsorbenter i pulverform er lungeirriterende, og faren forværres, hvis kolonnen indeholder restforbindelser, som nu kan komme ned i lungerne. Hældning af silica- eller aluminiumoxidpulver skal altid ske i emhætten.
34) Når størstedelen af adsorbenten er blevet opsamlet i en affaldsbeholder, skal du bruge vand til at skylle eventuelle rester af fast stof ud i vasken og derefter skylle kolonnen med acetone i et affaldsbæger. Rengør derefter søjlen med vand og sæbe, og tør den med stophanens dele adskilt.
Sikkerhedsbemærkning: Adsorbenter i pulverform er lungeirriterende, og faren forværres, hvis kolonnen indeholder restforbindelser, som nu kan komme ned i lungerne. Hældning af silica- eller aluminiumoxidpulver skal altid ske i emhætten.
34) Når størstedelen af adsorbenten er blevet opsamlet i en affaldsbeholder, skal du bruge vand til at skylle eventuelle rester af fast stof ud i vasken og derefter skylle kolonnen med acetone i et affaldsbæger. Rengør derefter søjlen med vand og sæbe, og tør den med stophanens dele adskilt.
Fejlfinding
Derses luftbobler i kolonnen
En luftboble er en tom lomme, hvor der ikke sker en ligevægt mellem den stationære og den mobile fase, så komponenterne bevæger sig hurtigere rundt i en luftboble, end de burde. Dette kan føre til ujævne elueringsbånd, som kan forårsage overlapning, hvis adskillelsen af blandingen er vanskelig (hvis komponenterne har meget tætte Rf-værdier, som i fig. 17).
Fig.
Hvis der ses luftbobler i kolonnen, og sandet eller prøven endnu ikke er påført, skal kolonnen rystes godt under pakningen for at fjerne alle luftbobler. Kontakt din instruktør, hvis boblerne ikke flytter sig, da du måske går for forsigtigt til værks. Hvis sandet eller prøven allerede er påført, er det bedst at lade kolonnen være, som den er, og håbe, at luftboblerne ikke påvirker separationen.
Båndene eluerer ujævnt
Hvis komponenterne i en blanding er farvede, kan det være tydeligt, når båndene eluerer på en skæv måde. Det skyldes højst sandsynligt, at kolonnen er fastspændt i en lille diagonal. Hvis kolonnen er fastspændt på en skrå måde, vil komponenterne bevæge sig på en skrå måde (fig. 18). Det kan give problemer med adskillelsen, hvis komponenterne har samme Rf.
Fig.øjle på adskillelsen
Det er ikke muligt at løse dette problem midt i en kolonne, men hvis komponenterne har meget forskellige Rf-værdier, har de skæve bånd muligvis ingen effekt på separationen. I fremtiden skal du sørge for at kontrollere, at søjlen er helt lodret i både side-til-side- og front-til-bag-retningen.
Last edited by a moderator:
