De genetiske teknologier, som gjorde deres indtog i menneskets liv i slutningen af sidste århundrede, har ændret vores verden i en sådan grad, at den allerede er utænkelig uden dem. Det er også lykkedes disse teknologier at trænge ind i retsvidenskaben; i årtier er genetisk identifikation blevet brugt som en hurtig og relativt billig metode, der gør det muligt at finde forbrydere og opklare deres handlinger uden at forlade laboratoriet. Som uddannet farmakolog er jeg meget interesseret i genetik og er ivrig efter at studere dette felt i dets forskellige aspekter. I denne publikation vil jeg introducere dig til klassiske genetiske tilgange inden for retsmedicin.
Lidt historie, eller hvad har det med riddere at gøre?
For 150 år siden opdagede Johannes Friedrich Miescher nukleinsyrer, et begreb, der i sidste ende vendte op og ned på verden [1]. I midten af det 20. århundrede blev det klart, at DNA og RNA var bærere af arvelig information; derefter blev deres struktur beskrevet, og lidt senere dukkede der adskillige metoder op, som gjorde det muligt at "klippe" disse molekyler in vitro ved hjælp af cellulære enzymer - restrictaser [2]; forstærke dem ved hjælp af PCR [3]; og endda læse sekvensen af specifikke gener og genomer ved hjælp af flere sekventeringsmetoder [4].
Oprindeligt blev arbejdet med genetisk materiale udført bogstaveligt talt "i køkkenet" og kunne ikke altid reproduceres selv i det nærliggende videnskabelige laboratorium. Men tiden gik, tilgangen ændrede sig, og metoderne blev standardiseret i en sådan grad, at de gradvist blev indført i anvendt forskning og endda i bioteknologisk produktion.
I 1984 blev det videnskabelige samfund oprørt over nyheden om, at det var lykkedes forskere at isolere og aflæse et fragment af DNA fra Burchell-zebraen, som er uddød og kun overlever i museumssamlinger [5]. Et år senere bekræftede den svenske genetiker Svante Pääbo muligheden for at bruge museums- og arkæologisk materiale til grundlæggende videnskabelig forskning, efter først at have analyseret det genetiske materiale fra egyptiske mumier. År senere viste det sig, at de prøver, han analyserede, var forurenet med moderne genetisk materiale [6], men udviklingen af sekventeringsmetoder gjorde det stadig muligt at arbejde med selv minimale mængder dårligt bevaret DNA.
Retsmedicinere var også interesserede i de nye teknikker til analyse af genetisk materiale. Faktum er, at metoderne med klassisk daktyloskopi og blodgruppeanalyse, som var gængse på det tidspunkt, havde deres begrænsninger, og i nogle tilfælde slog de fejl.
I 1984 udviklede og præsenterede den britiske forsker Sir Alec John Jeffreys (figur 3) en metode til at identificere en person ved hjælp af hans genetiske materiale. Senere blev denne tilgang kaldt DNA-identifikation, og den vandt kærlighed og respekt hos kriminologer over hele verden. Jeffreys blev slået til ridder for sit arbejde.
Lidt historie, eller hvad har det med riddere at gøre?
For 150 år siden opdagede Johannes Friedrich Miescher nukleinsyrer, et begreb, der i sidste ende vendte op og ned på verden [1]. I midten af det 20. århundrede blev det klart, at DNA og RNA var bærere af arvelig information; derefter blev deres struktur beskrevet, og lidt senere dukkede der adskillige metoder op, som gjorde det muligt at "klippe" disse molekyler in vitro ved hjælp af cellulære enzymer - restrictaser [2]; forstærke dem ved hjælp af PCR [3]; og endda læse sekvensen af specifikke gener og genomer ved hjælp af flere sekventeringsmetoder [4].
Oprindeligt blev arbejdet med genetisk materiale udført bogstaveligt talt "i køkkenet" og kunne ikke altid reproduceres selv i det nærliggende videnskabelige laboratorium. Men tiden gik, tilgangen ændrede sig, og metoderne blev standardiseret i en sådan grad, at de gradvist blev indført i anvendt forskning og endda i bioteknologisk produktion.
I 1984 blev det videnskabelige samfund oprørt over nyheden om, at det var lykkedes forskere at isolere og aflæse et fragment af DNA fra Burchell-zebraen, som er uddød og kun overlever i museumssamlinger [5]. Et år senere bekræftede den svenske genetiker Svante Pääbo muligheden for at bruge museums- og arkæologisk materiale til grundlæggende videnskabelig forskning, efter først at have analyseret det genetiske materiale fra egyptiske mumier. År senere viste det sig, at de prøver, han analyserede, var forurenet med moderne genetisk materiale [6], men udviklingen af sekventeringsmetoder gjorde det stadig muligt at arbejde med selv minimale mængder dårligt bevaret DNA.
Retsmedicinere var også interesserede i de nye teknikker til analyse af genetisk materiale. Faktum er, at metoderne med klassisk daktyloskopi og blodgruppeanalyse, som var gængse på det tidspunkt, havde deres begrænsninger, og i nogle tilfælde slog de fejl.
I 1984 udviklede og præsenterede den britiske forsker Sir Alec John Jeffreys (figur 3) en metode til at identificere en person ved hjælp af hans genetiske materiale. Senere blev denne tilgang kaldt DNA-identifikation, og den vandt kærlighed og respekt hos kriminologer over hele verden. Jeffreys blev slået til ridder for sit arbejde.
DNA-daktyloskopi: fordele og ulemper
Genetisk analyse af biologiske prøver fra gerningssteder har i høj grad forenklet efterforskernes arbejde. De har nu et pålideligt værktøj til at identificere gerningsmanden eller offeret, skaffe ubestridelige beviser og opklare forbrydelser.
De største fordele ved genetiske fingeraftryk er evnen til at arbejde selv med små mængder biologisk materiale og den høje nøjagtighed, der gør det muligt at identificere en person - hvis alle krav til analysen er opfyldt, overstiger pålideligheden 99 %. Denne tilgang er blevet en af de vigtigste i efterforskningen af forbrydelser [7].
Det er vigtigt at bemærke, at klassiske DNA-daktyloskopimetoder ikke gør det muligt at identificere enæggede tvillinger, hvis genetiske profil er den samme, da de er dannet af det samme befrugtede æg.
Til DNA-analyse er der først og fremmest brug for selve DnA, men det er langt fra altid muligt at udtrække genetisk materiale af høj kvalitet fra biologiske prøver, der har været udsat for kemiske og termiske faktorer. I miljøet indgår dette molekyle i kemiske reaktioner, ødelægges (fragmenteres) og modificeres, men under gunstige forhold kan det overleve i tusindvis af år [8].
Man ved, at det ældste genetiske materiale fra menneskets forfædre blev udvundet fra knogleresterne af vores humanoide slægtninge, som levede på Den Iberiske Halvø (Sierra de Atapuerca) for ca. 430.000 år siden [9]. Det specifikke mikroklima i nogle huler med lav luftfugtighed og temperaturværdier øger levetiden for det genetiske materiale betydeligt. Men DNA i de prøver, der findes på gerningsstedet, er ofte repræsenteret i minimale mængder og er, ligesom i arkæologiske prøver, stærkt nedbrudt.
I Europa og USA henledes opmærksomheden på en anden ulempe ved genetiske fingeraftryk, der er relateret til indblanding i en persons privatliv og krænkelse af privatlivets fred.
Menneskerettighedsaktivister frygter, at kriminelles og mistænktes genetiske oplysninger kan falde i hænderne på tredjeparter og derefter blive misbrugt [10]. For eksempel er der allerede kendte tilfælde af brug af genetiske oplysninger til at kontrollere muslimske minoriteter i den kinesiske provins Xinjiang.
USA planlægger også systematisk at indsamle DNA-profiler af immigranter i føderal varetægt [11]. Det er klart, at menneskerettighedsaktivisternes frygt ikke er ubegrundet og har reelle grunde.
De største fordele ved genetiske fingeraftryk er evnen til at arbejde selv med små mængder biologisk materiale og den høje nøjagtighed, der gør det muligt at identificere en person - hvis alle krav til analysen er opfyldt, overstiger pålideligheden 99 %. Denne tilgang er blevet en af de vigtigste i efterforskningen af forbrydelser [7].
Det er vigtigt at bemærke, at klassiske DNA-daktyloskopimetoder ikke gør det muligt at identificere enæggede tvillinger, hvis genetiske profil er den samme, da de er dannet af det samme befrugtede æg.
Til DNA-analyse er der først og fremmest brug for selve DnA, men det er langt fra altid muligt at udtrække genetisk materiale af høj kvalitet fra biologiske prøver, der har været udsat for kemiske og termiske faktorer. I miljøet indgår dette molekyle i kemiske reaktioner, ødelægges (fragmenteres) og modificeres, men under gunstige forhold kan det overleve i tusindvis af år [8].
Man ved, at det ældste genetiske materiale fra menneskets forfædre blev udvundet fra knogleresterne af vores humanoide slægtninge, som levede på Den Iberiske Halvø (Sierra de Atapuerca) for ca. 430.000 år siden [9]. Det specifikke mikroklima i nogle huler med lav luftfugtighed og temperaturværdier øger levetiden for det genetiske materiale betydeligt. Men DNA i de prøver, der findes på gerningsstedet, er ofte repræsenteret i minimale mængder og er, ligesom i arkæologiske prøver, stærkt nedbrudt.
I Europa og USA henledes opmærksomheden på en anden ulempe ved genetiske fingeraftryk, der er relateret til indblanding i en persons privatliv og krænkelse af privatlivets fred.
Menneskerettighedsaktivister frygter, at kriminelles og mistænktes genetiske oplysninger kan falde i hænderne på tredjeparter og derefter blive misbrugt [10]. For eksempel er der allerede kendte tilfælde af brug af genetiske oplysninger til at kontrollere muslimske minoriteter i den kinesiske provins Xinjiang.
USA planlægger også systematisk at indsamle DNA-profiler af immigranter i føderal varetægt [11]. Det er klart, at menneskerettighedsaktivisternes frygt ikke er ubegrundet og har reelle grunde.
Sådan fungerer det
DNA-daktyloskopi-metoder er baseret på menneskets genetiske variabilitet. Nukleotidsubstitutioner i DNA (afhængigt af hyppigheden i befolkningen kaldes de også DNA-polymorfismer eller mutationer) gør os individuelt forskellige. Og disse forskelle kan findes i både kerne- og mitokondriegenomer, små cirkulære DNA-molekyler, der regulerer mitokondriernes funktion, cellernes "energifabrikker".
Det skal bemærkes, at der findes DNA-polymorfismer i vores allesammens genom - de bliver vores unikke DNA-stregkode. Nogle af dem kan forårsage alvorlige sygdomme [12], men i de fleste tilfælde har de ingen effekt på vores vitale funktioner.
Moderne DNA-daktyloskopi-metoder bruger en række genetiske varianter i forskellige regioner af genomet. For eksempel giver analyse af tandemrepetitioner - korte repetitive genomsekvenser, hvis antal er forskelligt hos to tilfældigt udvalgte individer [13] - mulighed for en klar faderskabstest eller for at finde yderligere beviser mod en mistænkt forbryder.
Y-kromosomale DNA-markører kan bruges til at bestemme en persons køn. Genetiske markører giver oplysninger om en persons slægtninges etnicitet, øjenfarve eller hårfarve.
Desuden gør epigenetisk information (f.eks. DNA-methylering) det muligt at estimere den biologiske alder af individuelle celler, væv og organismen som helhed [14]. I denne artikel vil jeg tale mere om de ovennævnte metoder til genetisk analyse. Og brugen af epigenetiske metoder i lægemiddelbranchen vil være emnet for min næste publikation.
Y-kromosomale DNA-markører kan bruges til at bestemme en persons køn. Genetiske markører giver oplysninger om en persons slægtninges etnicitet, øjenfarve eller hårfarve.
Desuden gør epigenetisk information (f.eks. DNA-methylering) det muligt at estimere den biologiske alder af individuelle celler, væv og organismen som helhed [14]. I denne artikel vil jeg tale mere om de ovennævnte metoder til genetisk analyse. Og brugen af epigenetiske metoder i lægemiddelbranchen vil være emnet for min næste publikation.
Indsamling og isolering af DNA fra biologisk materiale
DNA-ekstraktion og -analyse fra retsmedicinske prøver kan ved første øjekast sammenlignes med kunst. Nogle gange er det umuligt at forestille sig, at et par dråber blod eller et stykke hud under et offers fingernegle kan blive det vigtigste bevis i en kriminalefterforskning.
Faktisk er kriminalteknikernes handlinger på gerningsstedet finjusteret og følger et enkelt scenarie, hvor et af hovedmålene er at finde biologisk materiale, der er egnet til DNA-ekstraktion. Alt biologisk væv og menneskelige sekreter kan bruges til dette formål .
- Knoglerester
- Tænder
- Hårfollikler
- blod
- Epitelceller
- Sved
- Spyt
- Sædprøver
- Ekskrementer osv.
Biomateriale på bevislageret kan holde i årtier. Ofte vil undersøgeren kun tage en del af materialet til undersøgelse, så meget som han har brug for til DNA-ekstraktion. Hvis der f.eks. er blodspor på kniven, vasker eksperten ikke alt blodet af, men foretager en lille skylning lige inden DNA-ekstraktionen. Det efterlader spor på kniven, som kan bruges til at foretage en ny undersøgelse flere årtier senere.
I cellekernen er DNA i tæt kontakt med mange organiske molekyler, som er nødvendige for, at det kan fungere effektivt. Men til genetisk analyse skal kulhydrater, lipider og proteiner fjernes fra prøven, hvilket kan reducere effektiviteten af de anvendte metoder og dermed påvirke opklaringen af forbrydelser.DNA-ekstraktion tager kort tid takket være en række kommercielle kits og systemer, der er specielt designet til nukleinsyreekstraktion (f.eks. AutoMate Express DNA Extraction System fra Thermo Fisher Scientific). I store retsmedicinske centre med tusindvis af analyser om dagen er denne proces desuden fuldautomatisk og udføres med deltagelse af robotter under opsyn af en operatør.
I øvrigt bruges robotsystemer ikke kun i retsmedicinske laboratorier, men også i mange medicinske og bioteknologiske centre, hvilket gør det muligt at fremskynde processen, reducere arbejdsomkostningerne og reducere risikoen for fejl betydeligt.
Efter ekstraktion opløses DNA'et i en særlig forbindelse, hvor det kan opbevares i årevis (ved -20 °C eller -80 °C), hvis det er nødvendigt.
Genetisk analyse
Umiddelbart efter DnA-ekstraktion står en specialist over for spørgsmålet om yderligere måder at analysere det på. Siden introduktionen af DNA-identifikation i retsmedicin har molekylærbiologiske teknikker ændret sig så meget, at der er flere mulige varianter. Vores videre historie vil fremhæve de forskellige teknikker til DNA-analyse, som retsmedicinske eksperter bruger i deres praksis.
Restriktionsfragmentlængdepolymorfisme (RFLP-analyse)
RFLP-analyse er historisk set en af de første metoder til DNA-identifikation. Den er baseret på brugen af særlige cellulære enzymer, restriktionsenzymer. Restriktionsenzymer kan genkende bestemte steder på et nukleinsyremolekyle og klippe det over på disse steder. Flere tusinde sådanne enzymer er blevet beskrevet til dato. Efter at have klippet DnA-molekylet med restriktionsenzymer evalueres længden af de opnåede fragmenter ved hjælp af gelelektroforese (figur 9).
Umiddelbart efter DnA-ekstraktion står en specialist over for spørgsmålet om yderligere måder at analysere det på. Siden introduktionen af DNA-identifikation i retsmedicin har molekylærbiologiske teknikker ændret sig så meget, at der er flere mulige varianter. Vores videre historie vil fremhæve de forskellige teknikker til DNA-analyse, som retsmedicinske eksperter bruger i deres praksis.
Restriktionsfragmentlængdepolymorfisme (RFLP-analyse)
RFLP-analyse er historisk set en af de første metoder til DNA-identifikation. Den er baseret på brugen af særlige cellulære enzymer, restriktionsenzymer. Restriktionsenzymer kan genkende bestemte steder på et nukleinsyremolekyle og klippe det over på disse steder. Flere tusinde sådanne enzymer er blevet beskrevet til dato. Efter at have klippet DnA-molekylet med restriktionsenzymer evalueres længden af de opnåede fragmenter ved hjælp af gelelektroforese (figur 9).
Da der ikke findes helt identiske menneskelige genomer (bortset fra enæggede tvillinger), kan forskellen eller ligheden i de resulterende DNA-fragmentlængdeprofiler være en god markør til både personlig identifikation og bestemmelse af slægtskab.
Men denne metode involverer DNA-fragmentering og er derfor følsom over for kvaliteten og mængden af det oprindelige genetiske materiale. Derfor bruges RFLP-analysen ikke i praksis på nuværende tidspunkt - i modsætning til andre metoder, som vil blive diskuteret nedenfor.
Analyse af antallet af tandemrepetitioner i genomet
Tandemrepetitioner er kopier af den samme korte DnA-sekvens, der gentages efter hinanden [15]. Gentagelser, der er af interesse for retsmedicinere, omfatter loci med et varierende antal tandemgentagelser (VNTR) og korte tandemgentagelser (STR). De kaldes også henholdsvis minisatellitter og mikrosatellitter.
Essensen af denne metode er PCR-amplifikation af DNA-fragmenter, der indeholder disse korte repetitive sekvenser, hvis længder er forskellige i to tilfældigt udvalgte individer. Efter amplifikationen evalueres længden af de opnåede fragmenter ved hjælp af gelelektroforese eller kapillarelektroforese.
Quantifiler DNA Quantification Kit og QuantStudio-systemet fra Termo Fisher Scientific kan bruges til dette formål. QuantStudio er et kompakt bordinstrument med en lang række funktioner.
Som med den tidligere metode er den vigtigste identificerende faktor for STR-analysen længden af de opnåede fragmenter, som er unik for hvert individ og afhænger af antallet af gentagelser på det analyserede sted. STR-analyse er kendetegnet ved høj nøjagtighed og hastighed samt lave omkostninger. Kvaliteten af det genetiske materiale er en vigtig forudsætning for analysen.
Men denne metode involverer DNA-fragmentering og er derfor følsom over for kvaliteten og mængden af det oprindelige genetiske materiale. Derfor bruges RFLP-analysen ikke i praksis på nuværende tidspunkt - i modsætning til andre metoder, som vil blive diskuteret nedenfor.
Analyse af antallet af tandemrepetitioner i genomet
Tandemrepetitioner er kopier af den samme korte DnA-sekvens, der gentages efter hinanden [15]. Gentagelser, der er af interesse for retsmedicinere, omfatter loci med et varierende antal tandemgentagelser (VNTR) og korte tandemgentagelser (STR). De kaldes også henholdsvis minisatellitter og mikrosatellitter.
Essensen af denne metode er PCR-amplifikation af DNA-fragmenter, der indeholder disse korte repetitive sekvenser, hvis længder er forskellige i to tilfældigt udvalgte individer. Efter amplifikationen evalueres længden af de opnåede fragmenter ved hjælp af gelelektroforese eller kapillarelektroforese.
Quantifiler DNA Quantification Kit og QuantStudio-systemet fra Termo Fisher Scientific kan bruges til dette formål. QuantStudio er et kompakt bordinstrument med en lang række funktioner.
Som med den tidligere metode er den vigtigste identificerende faktor for STR-analysen længden af de opnåede fragmenter, som er unik for hvert individ og afhænger af antallet af gentagelser på det analyserede sted. STR-analyse er kendetegnet ved høj nøjagtighed og hastighed samt lave omkostninger. Kvaliteten af det genetiske materiale er en vigtig forudsætning for analysen.
STR-analyse dukkede op i praktisk retsmedicin for næsten tyve år siden, men er den dag i dag stadig den vigtigste metode til at identificere personer. Resultaterne af DNA-analyser af mistænkte og kriminelle - genetiske profiler - indtastes af kriminologer i særlige databaser.
Når der findes biologiske spor på gerningssteder, hvorfra dna kan isoleres, er det derfor blevet muligt at identificere alle personer, som allerede er kommet i de retshåndhævende myndigheders søgelys. De samme markører bruges til at søge efter forsvundne personer og til at fastslå faderskab.
Når der findes biologiske spor på gerningssteder, hvorfra dna kan isoleres, er det derfor blevet muligt at identificere alle personer, som allerede er kommet i de retshåndhævende myndigheders søgelys. De samme markører bruges til at søge efter forsvundne personer og til at fastslå faderskab.
Som regel tillader systemer, der er designet til at identificere individer, analyse af flere genomloci (10-24) på én gang, herunder amelogenin-proteingenet, som kønnet bestemmes ud fra. Amelogenin-genet findes på både X- og Y-kromosomet, men er forskelligt i størrelse, hvilket gør det muligt at bestemme en persons køn.
Takket være brugen af højtydende sekventeringsteknologier har retsmedicinerne fået et effektivt værktøj, der har åbnet nye muligheder for samtidig analyse af flere steder (loci) i det nukleare og mitokondrielle genom.
En vigtig fordel ved disse metoder er evnen til at skelne mellem selv enæggede tvillinger (ved somatiske mutationer), hvilket er umuligt med RFLP- eller STR-analyse.
Takket være brugen af højtydende sekventeringsteknologier har retsmedicinerne fået et effektivt værktøj, der har åbnet nye muligheder for samtidig analyse af flere steder (loci) i det nukleare og mitokondrielle genom.
En vigtig fordel ved disse metoder er evnen til at skelne mellem selv enæggede tvillinger (ved somatiske mutationer), hvilket er umuligt med RFLP- eller STR-analyse.
Anden del af denne publikation beskriver, hvordan de ovenfor beskrevne metoder kan bruges til at identificere narkolaboratorier og narkohandlere, og hvordan du kan forvirre retsmedicinerne ved at slette dine spor.
Læs DEL II
