Biotransformation von Benzaldehyd in L-PAC

archae

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Einführung
L-Phenylacetylcarbinol ist eine Verbindung, die bei der Synthese von Ephedrin verwendet wird, das wiederum als Vorstufe zu Amphetaminen dient. Industriell wird es durch aerobe Fermentation von Benzaldehyd durch Bäckerhefe (S. cerevisiae/SC) synthetisiert. Das Verfahren ist zwar recht einfach, erfordert aber einiges an Ausrüstung und Wissen, insbesondere wenn es um die Aufrechterhaltung steriler Kulturen und geeigneter Wachstumsbedingungen geht. Ich werde daher zwei unterschiedlich anspruchsvolle Methoden für die Herstellung von L-PAC durch Biotransformation erläutern. Das Wachstumsmedium sollte vor der Verwendung durch Autoklavieren sterilisiert werden.

Erste Methode:
Man könnte diese Technik als "schlampig, aber einfach" bezeichnen. Sie erfordert weniger Ausrüstung, ist einfacher, aber auch weniger effektiv und führt zu einer geringeren Ausbeute.

Verfahren:
In 500 ml sterilem 0,1 M pH-6-Citratpuffer 44 g Hefe und 55 g Glukose hinzufügen. In ein auf 30°C erhitztes Wasserbad stellen. 40/50 Minuten lang inkubieren.
Benzaldehyd (25 mmol) in 5 mL Ethanol und Acetaldehyd (25 mmol) zugeben. 60 Minuten lang inkubieren.
Durch Celite filtern.
Mit 3*100 ml Ethylacetat extrahieren. Emulsion mit gesättigter Natriumchloridlösung spalten, über wasserfreiem Natriumsulfat trocknen, filtrieren, Lösungsmittel abdampfen. Dies ist Ihr L-PAC.

Erklärungen:
Citratpuffer: Dieser Puffer wird verwendet, um den pH-Wert stabil zu halten, da er durch das Wachstum der Zelle mit der Zeit sinkt (was nicht gut ist). Um diesen Puffer herzustellen, folgen Sie den Anweisungen dieses Rechners: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Vergessen Sie nicht, den pH-Wert auf 6 zu ändern.
Temperatur: ermöglicht eine höhere Stoffwechselaktivität der Hefe.
Ethanol: wird zur Auflösung von Benzaldehyd und Acetaldehyd verwendet und erhöht deren Bioverfügbarkeit.
Acetaldehyd: wird als Wasserstoffakzeptor anstelle von Benzaldehyd verwendet, wodurch die Produktion von Benzylalkohol begrenzt wird.

Es handelt sich um ein einfaches Verfahren, das nach ein wenig Lektüre über sterile Standardtechniken von fast jedem angewandt werden kann, aber die Ausbeute ist geringer als bei den anderen Verfahren (zwischen 20 und 40 %). Die Ausbeute kann entweder durch eine bessere Belüftung verbessert werden, entweder durch orbitales Schütteln bei 150 U/min oder durch Einpumpen von steriler Luft in das Medium (1 l Luft pro Liter Medium pro Minute), oder durch Immobilisierung der Zellen in Alginatkügelchen. Sie können sich das auf Youtube ansehen, es ist sehr einfach und kann die Ausbeute erheblich steigern.


Zweite Methode:
Dieses Protokoll ist fortgeschrittener, kann aber die Ausbeute um bis zu 60 oder 70 % erhöhen, wenn es richtig gemacht wird. Es wird jedoch mehr Material benötigt. Auch wenn es nicht perfekt ist, ist es doch viel besser.
Diese Methode wurde für die Hefe Candida utilis anstelle von S. cerevisiae entwickelt. Sie können stattdessen auch SC verwenden, aber Sie werden einen geringeren Ertrag erzielen. Sie können C. utilis hier kaufen: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p

Verfahren
Das Wachstumsmedium besteht aus 10g/L Harnstoff (bringt Stickstoff), 10g/L MgSO4 (bringt Magnesium und Schwefel) und zwischen 50 und 70g/L Zucker aus Melasse. Lösen Sie den Zucker in einer ausreichenden Menge von 0,1M pH 6 Citratpuffer auf.
Am Vortag eine Startkultur von Hefe beimpfen und über Nacht bei 30°C bebrüten.
Messen Sie die optische Dichte (Absorption) bei 595nm. Beimpfen Sie Ihren Fermentationsreaktor mit 15% v/v Ihrer auf 0,4 OD eingestellten Ausgangskultur. Beispiel: Um einen 1-Liter-Behälter zu beimpfen, wenn die OD bei 0,2 gemessen wurde, fügen Sie 300 ml zu 700 ml hinzu. Wenn die OD bereits 0,4 beträgt, fügen Sie 150 ml zu 850 ml hinzu usw. (240x106 Zellen/ml im Inokulum, siehe Erläuterungen).
Inkubieren Sie bei 30°C, entweder durch orbitales Schütteln bei 150 U/min oder durch Pumpen von steriler Luft mit einer Geschwindigkeit von 1 v/v/min. Wenn Sie Luft pumpen, sollten Sie etwas langsames Rühren dazuschalten.
Inkubieren, bis die OD zwischen 0,3 und 0,4 liegt. Dies sollte zwischen 4 und 6 Stunden dauern, kann aber auch weniger oder mehr sein. Überprüfen Sie die OD alle 30 Minuten, bis Sie den gewünschten Wert erreicht haben.
Die Zugabe von Benzaldehyd erfolgt in mehreren Dosen. Bei 50 ml sind das die Volumina 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Gleichzeitig wird eine entsprechende Menge Acetaldehyd zugegeben. Zwischen den einzelnen Zugaben eine Stunde warten.
Extrahieren mit 1:2 Toluol/Medium v/v, eindampfen.

Erläuterung:
Optische Dichte: Sie wird mit einem Spektrophotometer gemessen. Hier wird die Absorption bei 595nm gemessen, die proportional zur Anzahl der Zellen in der Lösung ist. Als Faustregel gilt: 0,1 OD=60x10^6 Zellen/mL

Allgemeine Hinweise:
Für die Belüftung ist in kleinem Maßstab orbitales Schütteln bei 150 U/min besser geeignet. In größerem Maßstab müssen Sie die Luft durch einen Filter blasen.
Im zweiten Protokoll wird die Zugabe von Benzaldehyd in mehreren Dosen vorgenommen, um die Ausbeute zu erhöhen. Die Ausbeute kann durch kontinuierliche Injektion von Benzaldehyd in abnehmender Menge weiter verbessert werden, was jedoch im Amateurbereich nur schwer zu bewerkstelligen ist.
Substituierte Benzaldehyde können verwendet werden und ergeben das entsprechende L-PAC-Analogon.
Schließlich können Sie einige Elemente von Methode 2 übernehmen und in Methode 1 einbauen, um den Versuchsplan nach Ihren Wünschen zu gestalten. Beachten Sie, dass auch andere Stämme und Spezies verwendet werden können, was die Ausbeute erheblich steigert. Weitere Informationen finden Sie unter "production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeasts in molasses and sugar cane juice as production medium" von Ravi et al.
 

HerrHaber

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archae

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*für eine 50-ml-Kultur
 

ace4cada

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Welche Farbe hat L-PAC? ist es weiß oder gelb... jemand sagte, es sei weiß und fest...
(wenn man L-PAC mit einem Lösungsmittel extrahiert (z.B. Toluol), bleibt der Zucker im Lösungsmittel und bei der Destillation bleibt die gelbe Farbe zurück...)
 

archae

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Glucose, Fructose und andere Zucker sind in unpolaren Lösungsmitteln nicht löslich. L-PAC ist eine gelbe ölige Flüssigkeit.
 
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ace4cada

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danke.. aber
Chat GPT sagt, es ist ein weißer Feststoff.
schau mal unter sullpiers(https://www.echemi.com/produce/pr2212011836-l-pac-99-powder-suc.html)
ich habe etwas gelbe Flüssigkeit.. aber ich bezweifle, dass es L-PAC ist...
(wenn ich Mosslass und Wasser und Toluol (ohne Ferment) mische und Toluol abtrenne, und dann destilliere.. gelbe Flüssigkeit bleibt über 150 Celcius)
 
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ace4cada

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und der Schmelzpunkt liegt bei 152°C~156°C ( chat GPT und Lieferanten alle)
wenn es richtig ist, muss es bei Raumtemperatur fest sein

 

archae

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Um Himmels willen, hören Sie bitte auf, ChatGPT für Chemie und Naturwissenschaften im Allgemeinen zu verwenden. Es gibt die Google-Suchmaschine, wie intellektuell faul kann man eigentlich sein?
Der Schmelzpunkt von Phenyacetylcarbinol liegt bei 10°C.
Willst du damit sagen, dass du einfach Melasse und Wasser mischst, ohne zu fermentieren? Die gelbe Flüssigkeit sind nur die in der Melasse enthaltenen organischen Wachse....
 

ace4cada

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danke.. ich weiß, dass es möglich ist, aus der Gärung.. aber in goolge außer wikipedia nicht geben Schmelzpunkt. auch CheBi, Chemspider und so weiter nicht bieten Schmelzpunkt.. wie Sie wissen, ist wikipedia nicht genaue Daten (weil persönliche bearbeiten können).. nur mögliche Informationen über Schmelzpunkt ist von Lieferanten (oben Link)..

Ich möchte nur den genauen Schmelzpunkt und die Farbe wissen.
die sullpiers(99% L-PAC) ist falsch oder andere Form ?
 

archae

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Ich habe gerade nachgesehen und kann tatsächlich keinen genauen Schmelzpunkt finden. Ich kann Ihnen jedoch versichern, dass es sich bei Raumtemperatur um eine ölige Flüssigkeit handelt, selbst unter Gefrierbedingungen.

https://www.trc-canada.com/prod-img/MSDS/H949610MSDS.pdf

"Erscheinungsbild: Farbloses bis hellgelbes Öl"
 

Osmosis Vanderwaal

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Als ehemaliger Pilzzüchter habe ich viel über dieses Thema nachgedacht. Ich denke, dass Turbohefe, die alle Nährstoffe enthält und ein Sc-Stamm ist, der bis zu 20 % resistent gegen Ethanol ist, genau das Richtige wäre, um in einer feindlichen Umgebung wie dieser zu überleben.
 

archae

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Um die Nährstoffmenge in meinem Medium zu erhöhen, füge ich manchmal etwas selbst hergestellte Nährhefe hinzu, die ich aus gebrauchter Bierhefe herstelle, da sie alle Nährstoffe enthält, die für das Wachstum von SC
 

Osmosis Vanderwaal

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Ich bin auch ein Heimbrauer. Ich habe über ein Verfahren zur Herstellung von L-Pac gelesen, das kein Chargenverfahren ist. Solange die tote Hefe absinkt, evakuiert man das Fass über einen Hahn am Boden und treibt oder zentrifugiert die tote Hefe und den Schleim aus der Flüssigkeit und fügt dem Fass wieder mehr zu, so dass es ein kontinuierlicher Prozess wird. Ich habe die Mathematik, aber ich vergesse, wie viel Material ich entschied, es würde eine Woche, 20g gereinigte L-pac pro 10 Gallonen ls machen Worth jedes Mal, wenn Sie es abgelassen Ich fühle, und die natürliche Selektion wird die Hefe besser und besser zu tun, die Biochemie, solange Sie es am Leben zu halten
 

kpspoo

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Bei der Fermentierung entstehen viele Nebenprodukte wie Benzylalkohol, Benzoesäure, Ethanol, Essigsäure, Acetophenon, Benzaldehyd (nicht umgesetzt).
Um L-PAC aus dem Lösungsmittel zu reinigen, ist also ein komplizierteres Verfahren erforderlich.
und einige Artikel empfehlen anaerobe Bedingungen für eine höhere Ausbeute
Ich denke, die obige Methode ist ein Leitfaden, der nicht ins Detail geht.
 

kpspoo

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archae

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Die Aufarbeitung ist nicht beschrieben worden. Die Verunreinigung durch Benzoesäure und Benzylalkohol kann jedoch durch Zugabe von Acetaldehyd in das Reaktionsgemisch minimiert werden, wie in dem von mir oben beschriebenen Verfahren beschrieben. Ich war mehr an der Herstellung als an der Aufreinigung interessiert.
 

kpspoo

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Verstehe. Ohne Reinigung kann niemand beweisen, dass L-Pac durch Fermentation hergestellt wurde. Die Farbe kann durch andere Nebenprodukte unterschiedlich sein, und die Destillation ist wegen der Nebenprodukte noch unklarer.
Wie können Sie sich also davon überzeugen, dass L-PAC hergestellt wurde? Haben Sie ein Analysegerät?
 
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