Einführung
Die Säulenchromatographie ist eine Erweiterung der Dünnschichtchromatographie (TLC). Es wird davon ausgegangen, dass der Leser eine gewisse Erfahrung in der Laborpraxis hat und sich mit der Dünnschichtchromatographie beschäftigt hat. Anstatt eine Probe auf eine dünne Schicht aus Siliziumdioxid oder Aluminiumoxid aufzutragen, wird eine Probe auf einen Zylinder mit Adsorptionsmittel aufgebracht und kontinuierlich Lösungsmittel unter Druck zugeführt, bis die Komponenten vollständig aus dem Zylinder abfließen. Mit dieser Modifikation können Komponenten nicht nur getrennt, sondern auch in verschiedenen Behältern gesammelt werden, was die Reinigung von Mischungen und die Trennung von Medikamenten mit Verunreinigungen ermöglicht. Die Säulenchromatographie (auch "Flash-Chromatographie" genannt) wird häufig in der Forschung eingesetzt, wie ihr häufiges Vorkommen in den verfahrenstechnischen Abschnitten von Zeitschriftenartikeln beweist.
Diskussion über das Verfahren
Für die Säulenchromatographie gelten die gleichen Grundsätze wie für die Dünnschichtchromatographie (TLC). Tatsächlich wird vor der Durchführung einer Säulenchromatographie immer eine TLC durchgeführt, um die Situation zu beurteilen und das richtige Lösungsmittelverhältnis zu bestimmen. Um eine gute Trennung zu erreichen, ist es ideal, wenn die gewünschte Komponente einen Rf-Wert von etwa 0,35 hat (lesen Sie über Rf im Thema TLC) und von anderen Komponenten durch mindestens 0,2 Rf-Einheiten getrennt ist. Wenn die zu trennenden Spots sehr nahe beieinander liegen (wenn der Rf-Unterschied < 0,2 ist), ist es am besten, wenn der mittlere der Spots einen Rf von 0,35 hat. Ein Rf-Wert nahe 0,35 ist ideal, da er langsam genug ist, um ein Gleichgewicht zwischen stationärer und mobiler Phase zu ermöglichen, aber schnell genug, um eine Verbreiterung der Bande durch Diffusion zu minimieren.
Es gibt einige Variablen, die nicht für die TLC gelten, aber die Trennung von Komponenten in der Säulenchromatographie beeinflussen. Dazu gehören der Säulendurchmesser, die Menge des verwendeten Adsorptionsmittels und die Fließgeschwindigkeit des Lösungsmittels. Abb. 1 zeigt variable Empfehlungen in Abhängigkeit von der Probengröße und dem Grad der Trennung zwischen den Komponenten. In allen Szenarien sollten die Säulen in einer Höhe von 12,5-15 cm vorbereitet werden.
Es gibt einige Variablen, die nicht für die TLC gelten, aber die Trennung von Komponenten in der Säulenchromatographie beeinflussen. Dazu gehören der Säulendurchmesser, die Menge des verwendeten Adsorptionsmittels und die Fließgeschwindigkeit des Lösungsmittels. Abb. 1 zeigt variable Empfehlungen in Abhängigkeit von der Probengröße und dem Grad der Trennung zwischen den Komponenten. In allen Szenarien sollten die Säulen in einer Höhe von 12,5-15 cm vorbereitet werden.
Mit einer 2,5 cm hohen Säule sollten beispielsweise bei guter Trennung (ΔRf > 0,2, dritte Säule in Abb. 1) etwa 400 mg Material aufgereinigt werden können, bei schwieriger Trennung (ΔRf > 0,1) etwa 160 mg. Die Säule sollte mit etwa 200 ml Lösungsmittel vorbereitet und eluiert werden können, und die Fraktionen können mit jeweils etwa 10 ml Lösung gesammelt werden.
Es gibt zahlreiche Varianten, wie eine Säule physikalisch betrieben werden kann. Ein großer Unterschied zwischen den Methoden besteht darin, wie die Säule vorbereitet wird. Bei der "Trockenpackungs"-Methode wird trockenes Siliziumdioxid oder Aluminiumoxid direkt in die Säule gegeben, und das Lösungsmittel wird erst portionsweise und dann unter Druck durchgetropft. Bei der "Nasspackungs"-Methode wird die Säule zunächst mit Lösungsmittel gefüllt, dann wird das trockene Siliziumdioxid oder Aluminiumoxid leicht eingeschüttelt und anschließend mit Druck gepackt. Bei der "Slurry"-Methode wird das Lösungsmittel dem Siliciumdioxid oder Aluminiumoxid in einem Erlenmeyerkolben zugesetzt, als schlammiges Material auf die Säule gegossen und dann mit Druck gepackt (der Druck kann mit einer Spritze erzeugt werden).
Es ist wichtig zu wissen, dass bei der Zugabe von Lösungsmitteln zu Siliziumdioxid oder Aluminiumoxid Wärme freigesetzt wird (sie haben eine exotherme Solvatationswärme). In diesem Abschnitt wird die Slurry-Methode vorgestellt, deren Hauptgrund darin besteht, dass dieser exotherme Schritt in einem Erlenmeyerkolben und nicht auf der Säule stattfindet. Wenn beim Packen der Säule Wärme freigesetzt wird, können durch das Sieden des Lösungsmittels Blasen entstehen. Diese können die Trennung der Säule beeinträchtigen, wenn sie nicht angemessen entfernt werden, und das Adsorptionsmaterial in der Säule kann brechen.
Es gibt zahlreiche Varianten, wie eine Säule physikalisch betrieben werden kann. Ein großer Unterschied zwischen den Methoden besteht darin, wie die Säule vorbereitet wird. Bei der "Trockenpackungs"-Methode wird trockenes Siliziumdioxid oder Aluminiumoxid direkt in die Säule gegeben, und das Lösungsmittel wird erst portionsweise und dann unter Druck durchgetropft. Bei der "Nasspackungs"-Methode wird die Säule zunächst mit Lösungsmittel gefüllt, dann wird das trockene Siliziumdioxid oder Aluminiumoxid leicht eingeschüttelt und anschließend mit Druck gepackt. Bei der "Slurry"-Methode wird das Lösungsmittel dem Siliciumdioxid oder Aluminiumoxid in einem Erlenmeyerkolben zugesetzt, als schlammiges Material auf die Säule gegossen und dann mit Druck gepackt (der Druck kann mit einer Spritze erzeugt werden).
Es ist wichtig zu wissen, dass bei der Zugabe von Lösungsmitteln zu Siliziumdioxid oder Aluminiumoxid Wärme freigesetzt wird (sie haben eine exotherme Solvatationswärme). In diesem Abschnitt wird die Slurry-Methode vorgestellt, deren Hauptgrund darin besteht, dass dieser exotherme Schritt in einem Erlenmeyerkolben und nicht auf der Säule stattfindet. Wenn beim Packen der Säule Wärme freigesetzt wird, können durch das Sieden des Lösungsmittels Blasen entstehen. Diese können die Trennung der Säule beeinträchtigen, wenn sie nicht angemessen entfernt werden, und das Adsorptionsmaterial in der Säule kann brechen.
Schritt-für-Schritt-Verfahren
a) TLC der Ferrocen/Acetylferrocen-Mischung, b) Säulenchromatographie
Die in diesem Abschnitt abgebildete Säule zeigt die Reinigung einer 0,20 g schweren Probe, die ein Gemisch aus Ferrocen und Acetylferrocen enthält (rohe TLC in Abb. 2 a). Etwa 8 ml Fraktionen wurden in kleinen Reagenzgläsern gesammelt, und es wurden etwa 400 ml Eluent verwendet.
a) TLC-Platte der rohen Ferrocen/Acetylferrocen-Mischung vor der Elution, b) nach der Elution, c) Säule mit Fritte, d) Säule mit Baumwollkeil im Boden, e) Säule ohne Baumwollkeil (müsste vor der Verwendung eingesetzt werden)
Durchführen einer TLC
1) Führen Sie eine TLC mit der zu reinigenden Probe durch (Abb. 3 a und b), um das geeignete Lösungsmittel für die Chromatografie zu bestimmen. Die gewünschte Komponente sollte einen Rf-Wert von etwa 0,35 haben und idealerweise von allen anderen Spots um mindestens 0,2 Rf-Einheiten getrennt sein.
2) Bereiten Sie eine Charge des Eluenten vor, die den richtigen Rf-Wert ergibt. Die vorbereitete Menge hängt von der Probenmenge, der Größe der Säule und davon ab, ob die Lösungsmittelzusammensetzung auf halbem Weg geändert werden soll. (Siehe Abb. 1 für Richtlinien und die eluotrope Reihe für Trends in der "Lösungsmittelstärke").
2) Bereiten Sie eine Charge des Eluenten vor, die den richtigen Rf-Wert ergibt. Die vorbereitete Menge hängt von der Probenmenge, der Größe der Säule und davon ab, ob die Lösungsmittelzusammensetzung auf halbem Weg geändert werden soll. (Siehe Abb. 1 für Richtlinien und die eluotrope Reihe für Trends in der "Lösungsmittelstärke").
Bereiten Sie die gepackte Säule vor
3) Besorgen Sie sich eine geeignete Säule (siehe Abb. 1) und stellen Sie sicher, dass sich in der Nähe des Absperrhahns etwas befindet, das die Flüssigkeit durchlässt, aber nicht fest ist. Die Säulen können eine Sinterscheibe (auch "Fritte" genannt), Abb. 3 c), oder einen Pfropfen aus Watte oder Glaswolle enthalten, der vom vorherigen Benutzer übrig geblieben ist (Abb. 3 d). Wenn keine Scheibe oder kein Pfropfen vorhanden ist (Abb. 3 e), klemmen Sie einen kleinen Wattebausch oder Glaswolle mit einem langen Stab in den Boden der Säule.
a) Einfüllen von Kieselsäure bis zu einer Höhe von 12,5-15 cm im Abzug, b) Einfüllen der Kieselsäure in einen Erlenmeyerkolben, c und d) Herstellen einer Aufschlämmung
Sicherheitshinweis: Pulverförmiges Siliziumdioxid und Aluminiumoxid sind lungenreizend und sollten immer vorsichtig im Abzug gehandhabt werden. Verschütteter Staub sollte durch Aufwischen mit einem feuchten Papiertuch entsorgt werden (in feuchtem Zustand sind die feinen Partikel weniger dispergierbar).
5) Schütten Sie das in der Säule abgemessene Adsorptionsmittel im Abzug in einen Erlenmeyerkolben (Abb. 4 b) und geben Sie dann etwas Elutionsmittel hinzu (Abb. 4 c). Durch Schwenken und Rühren mit einem Glasrührstab (Abb. 4 d) eine lockere Aufschlämmung herstellen, bis das gesamte Adsorptionsmittel vollständig benetzt ist, Gasblasen freigesetzt werden und die Konsistenz etwas dickflüssig, aber fließfähig ist.
a) Einfüllen der Aufschlämmung in die Säule, b) Spülen des Kolbens, c) An den Seiten der Säule haftendes Adsorptionsmittel, d) Abspülen des anhaftenden Adsorptionsmittels
6) Man stellt ein Becherglas oder einen Erlenmeyerkolben unter die eingespannte Säule und öffnet den Absperrhahn. Mit einer schnellen Bewegung wird die Siliciumdioxid- oder Aluminiumoxidaufschlämmung mit einem großmündigen Trichter in die Säule geschüttet (Abb. 5 a). Verwenden Sie sofort mehr Elutionsmittel, um die restliche Aufschlämmung aus dem Erlenmeyerkolben (Abb. 5 b) und auf die Säule zu spülen.
7) Spülen Sie sofort etwaiges Siliciumdioxid oder Aluminiumoxid von den Seiten des Säulenreservoirs mit Elutionsmittel und einer Wirbelbewegung mit einer Pasteurpipette (Abb. 5 c und d). Wenn man es trocknen lässt, bleibt das Adsorptionsmittel am Glas haften und lässt sich nicht mehr so leicht abspülen.
7) Spülen Sie sofort etwaiges Siliciumdioxid oder Aluminiumoxid von den Seiten des Säulenreservoirs mit Elutionsmittel und einer Wirbelbewegung mit einer Pasteurpipette (Abb. 5 c und d). Wenn man es trocknen lässt, bleibt das Adsorptionsmittel am Glas haften und lässt sich nicht mehr so leicht abspülen.
a) Rütteln der Säule, um Luftblasen zu entfernen, b) Anlegen von Luftdruck, c) Hinzufügen von Sand, d) Abspülen von Sand von den Seiten
8) Stoßen Sie die Säule mit einem Korkring oder Ihren Fingerknöcheln fest an (Abb. 6 a), um eventuelle Luftblasen in der Säule zu entfernen (die zu einer schlechten Trennung oder Rissbildung des Adsorptionsmittels in der Säule führen könnten) und um eine gleichmäßige Ablagerung des Adsorptionsmittels zu fördern.
9) Üben Sie leichten Luftdruck auf den oberen Teil der Säule aus (Abb. 6 b), um sie zusammenzudrücken, und hören Sie auf, wenn der Füllstand des Elutionsmittels 1 cm vom oberen Ende der Säule entfernt ist. Wenn ein T-Adapter mit der Luftleitung verwendet wird (Abb. 6 b), kann der Luftstrom durch Einstellen der Quetschklemme am Gummischlauch fein reguliert werden. Während des gesamten Elutionsvorgangs ist die weiße Adsorptionssäule feucht zu halten, wobei der Eluentenspiegel über der Oberseite des Siliciumdioxids oder Aluminiumoxids liegen muss. Brechen Sie den Verschluss vorsichtig auf, um den Druck zu beenden, und schließen Sie den Absperrhahn, um ein weiteres Austropfen der Flüssigkeit zu verhindern.
10) Fügen Sie eine dünne Schicht Sand hinzu (Abb. 6 c), etwa 0,5 cm hoch. Spülen Sie die Seiten der Säule mit dem Elutionsmittel, indem Sie den Sand durch Schwenken von den Seiten des Glases lösen (Abb. 6 d). Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie die Flüssigkeit abtropfen, bis die Flüssigkeit knapp über der Sandschicht steht. Wenden Sie Luftdruck an, wenn die Flüssigkeit zu langsam abtropft.
9) Üben Sie leichten Luftdruck auf den oberen Teil der Säule aus (Abb. 6 b), um sie zusammenzudrücken, und hören Sie auf, wenn der Füllstand des Elutionsmittels 1 cm vom oberen Ende der Säule entfernt ist. Wenn ein T-Adapter mit der Luftleitung verwendet wird (Abb. 6 b), kann der Luftstrom durch Einstellen der Quetschklemme am Gummischlauch fein reguliert werden. Während des gesamten Elutionsvorgangs ist die weiße Adsorptionssäule feucht zu halten, wobei der Eluentenspiegel über der Oberseite des Siliciumdioxids oder Aluminiumoxids liegen muss. Brechen Sie den Verschluss vorsichtig auf, um den Druck zu beenden, und schließen Sie den Absperrhahn, um ein weiteres Austropfen der Flüssigkeit zu verhindern.
10) Fügen Sie eine dünne Schicht Sand hinzu (Abb. 6 c), etwa 0,5 cm hoch. Spülen Sie die Seiten der Säule mit dem Elutionsmittel, indem Sie den Sand durch Schwenken von den Seiten des Glases lösen (Abb. 6 d). Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie die Flüssigkeit abtropfen, bis die Flüssigkeit knapp über der Sandschicht steht. Wenden Sie Luftdruck an, wenn die Flüssigkeit zu langsam abtropft.
Zugabeder Probe
Sobald die Probe auf die Säule aufgetragen wird, beginnt ein Wettlauf mit der Zeit, da die Diffusion das Material zu verbreitern beginnt. Eine Probe sollte erst dann aufgetragen werden, wenn Sie bereit sind, die Säule sofort und vollständig zu füllen. Dieser Vorgang kann zwischen 15 und 90 Minuten dauern! Bei Verwendung von Reagenzgläsern zum Sammeln von Fraktionen sollten die Reagenzgläser vor der Zugabe der Probe in einem Gestell angeordnet werden, und die Höhe der Säule sollte so eingestellt werden, dass das Reagenzglasgestell darunter gleiten kann.
a) Auflösen eines Feststoffs mit einer kleinen Menge Dichlormethan, b) Auftragen der Probe, c) Spülen der Probe in ihrem Kolben, d) Ausüben von Druck, um die Probe auf die Säule zu schieben, gerade über die Sandschicht hinaus
11) Handelt es sich bei der Rohprobe um eine Flüssigkeit, verwenden Sie diese direkt (weiter mit Schritt 13).
12 ) Handelt es sich bei der Rohprobe um einen Feststoff, führen Sie eine der folgenden Maßnahmen durch.
12 ) Handelt es sich bei der Rohprobe um einen Feststoff, führen Sie eine der folgenden Maßnahmen durch.
a) Im Idealfall: Lösen Sie den Feststoff in einer minimalen Menge des Elutionsmittels (höchstens einige ml).
b ) Wenn der Feststoff nicht besonders löslich ist oder sich nicht in einigen ml des Elutionsmittels auflöst, löst man ihn in der Mindestmenge an Dichlormethan (höchstens einige ml, Abb. 7 a).
c) Wenn der Feststoff im Elutionsmittel unlöslich ist, kann auch ein anderes Verfahren angewandt werden. Der Feststoff wird in einem Rundkolben mit einigen ml eines niedrig siedenden Lösungsmittels (z. B. Dichlormethan oder Aceton) aufgelöst. In den Kolben gibt man etwa 1 g Siliciumdioxid oder Aluminiumoxid und entfernt das Lösungsmittel mit dem Rotationsverdampfer, so dass ein Feststoff zurückbleibt, der die auf dem Adsorptionsmittel abgelagerte Probe enthält. Während ein Zoll Elutionsmittel auf der gepackten Säule ruht (bei dieser Methode kann die Sandschicht weggelassen werden), gießt man die an Kieselerde adsorbierte Probe mit einem weithalsigen Trichter auf die Säule. Wenn Staub am Glas haftet, spülen Sie es mit mehr Elutionsmittel ab (fahren Sie mit Schritt 15 fort).
13) Geben Sie die Probe vorsichtig mit der Pipette auf die Säule, indem Sie die Flüssigkeit oder Lösung mit der Pipettenspitze direkt auf den Sand tropfen, und zwar so nah wie möglich, nicht an den Seiten (Abb. 7 b). Achten Sie darauf, dass die Flüssigkeit nicht mit Gewalt hineingespritzt wird, so dass Vertiefungen im Sand oder in der Quarz-/Tonerdesäule entstehen.
14) Spülen Sie den Probenbehälter mit etwas Lösungsmittel (oder Dichlormethan, falls verwendet, Abb.7 c) und geben Sie die Spülung mit der gleichen Pipette in die Säule (um auch die Pipette zu spülen).
15) Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie die Flüssigkeit abtropfen, bis die Probe gerade über die Sandschicht (Abb. 7 d) und in den weißen Bereich der Säule gelangt ist (wenden Sie Luftdruck an, wenn dies länger als 20 Sekunden dauert).
16) Spülen Sie die Seiten der Säule vorsichtig mit einer Wirbelbewegung, indem Sie 1 bis 2 Pipetten voll Eluent verwenden, um die verspritzte Probe auszuspülen. Lassen Sie auch hier die Flüssigkeit abtropfen (oder üben Sie Luftdruck aus), bis die Probe in das weiße Adsorptionsmittel gedrückt wird.
Wiederholen Sie den Spülvorgang, bis Sie sicher sind, dass sich die gesamte Probe auf dem Adsorptionsmittel abgesetzt hat. Befindet sich noch ein Teil der Probe in der Sandschicht, kann er sich bei Zugabe von mehr Lösungsmittel im Eluenten auflösen, was zu einem Verlust an Ausbeute führt. Wenn die Verbindung gefärbt ist, sollte die Spülung völlig klar sein.
14) Spülen Sie den Probenbehälter mit etwas Lösungsmittel (oder Dichlormethan, falls verwendet, Abb.7 c) und geben Sie die Spülung mit der gleichen Pipette in die Säule (um auch die Pipette zu spülen).
15) Öffnen Sie den Absperrhahn und lassen Sie die Flüssigkeit abtropfen, bis die Probe gerade über die Sandschicht (Abb. 7 d) und in den weißen Bereich der Säule gelangt ist (wenden Sie Luftdruck an, wenn dies länger als 20 Sekunden dauert).
16) Spülen Sie die Seiten der Säule vorsichtig mit einer Wirbelbewegung, indem Sie 1 bis 2 Pipetten voll Eluent verwenden, um die verspritzte Probe auszuspülen. Lassen Sie auch hier die Flüssigkeit abtropfen (oder üben Sie Luftdruck aus), bis die Probe in das weiße Adsorptionsmittel gedrückt wird.
Wiederholen Sie den Spülvorgang, bis Sie sicher sind, dass sich die gesamte Probe auf dem Adsorptionsmittel abgesetzt hat. Befindet sich noch ein Teil der Probe in der Sandschicht, kann er sich bei Zugabe von mehr Lösungsmittel im Eluenten auflösen, was zu einem Verlust an Ausbeute führt. Wenn die Verbindung gefärbt ist, sollte die Spülung völlig klar sein.
a und b) Füllen des Lösungsmittelreservoirs, c und d) Eluieren der Säule
Füllenmit Elutionsmittel und Eluieren der Säule
17) Geben Sie vorsichtig mehr Elutionsmittel mit der Pipette hinzu (Abb. 8 a), wobei Sie an den Seiten hinunterschwenken, und gießen Sie dann, wenn die Sandschicht durch die Zugaben nicht mehr gestört wird, vorsichtig größere Mengen (Abb. 8 b) des vorbereiteten Elutionsmittels ein, um das Reservoir zu füllen (oder füllen Sie so viel ein, wie benötigt wird). Sauberes Elutionsmittel, das beim Packen der Säule aufgefangen wurde, kann wiederverwendet werden.
18) Verwenden Sie Luftdruck, um die Probe sanft und gleichmäßig durch die Säule zu eluieren (Abb.8 c und d). Je öfter der Druck ein- und ausgeschaltet wird, desto eher kann die Säule reißen. Am besten ist es, wenn der Druck die ganze Zeit über sanft und gleichmäßig gehalten werden kann.
Die optimale Tropfgeschwindigkeit während der Elution hängt von der Größe der Säule ab. Der ideale Elutionsmittelfluss liegt vor, wenn das Lösungsmittel im zylindrischen Teil der Säule über dem Adsorptionsmittel mit 5 cm pro Minute abtropft. Daher sollte die Tropfgeschwindigkeit bei einer schmalen Säule langsamer sein als bei einer breiteren Säule. Die Tropfgeschwindigkeit bei einer 1-Zoll-Säule sollte so hoch sein, dass einzelne Tropfen kaum noch zu unterscheiden sind. Ein Flüssigkeitsstrom, der bei dieser Säulengröße aus dem Absperrhahn fließt, ist etwas zu schnell.
18) Verwenden Sie Luftdruck, um die Probe sanft und gleichmäßig durch die Säule zu eluieren (Abb.8 c und d). Je öfter der Druck ein- und ausgeschaltet wird, desto eher kann die Säule reißen. Am besten ist es, wenn der Druck die ganze Zeit über sanft und gleichmäßig gehalten werden kann.
Die optimale Tropfgeschwindigkeit während der Elution hängt von der Größe der Säule ab. Der ideale Elutionsmittelfluss liegt vor, wenn das Lösungsmittel im zylindrischen Teil der Säule über dem Adsorptionsmittel mit 5 cm pro Minute abtropft. Daher sollte die Tropfgeschwindigkeit bei einer schmalen Säule langsamer sein als bei einer breiteren Säule. Die Tropfgeschwindigkeit bei einer 1-Zoll-Säule sollte so hoch sein, dass einzelne Tropfen kaum noch zu unterscheiden sind. Ein Flüssigkeitsstrom, der bei dieser Säulengröße aus dem Absperrhahn fließt, ist etwas zu schnell.
a-c) Sammeln von Fraktionen, d) Betrieb einer Säule
Sammeln derFraktionen
19) Beginnen Sie sofort mit dem Auffangen der Elutionsflüssigkeit in Reagenzgläsern auf einem Gestell (Abb.9 a). Siehe Abb.1 für Empfehlungen zu den Volumina, die in jedem Reagenzglas gesammelt werden sollen.20) Wenn das erste Reagenzglas voll ist oder wenn eine bestimmte Menge an Flüssigkeit gesammelt wurde, wie von Ihrem Lehrer oder in Abb.1 empfohlen, bewegen Sie das Gestell, um mit dem Sammeln in einem anderen Reagenzglas zu beginnen (Abb.9 b und c). Füllen Sie die Röhrchen auf dem Gestell und halten Sie sie in der richtigen Reihenfolge.
Diese verschiedenen Röhrchen werden als "Fraktionen" bezeichnet. Das Ziel einer Säule ist es, so kleine Fraktionen zu sammeln, dass die meisten (oder einige) Fraktionen reines Material enthalten. Wenn die Trennung des Gemischs schwierig ist (wenn der ΔRf der Komponenten niedrig ist), kann es am besten sein, kleine Fraktionen zu sammeln (z. B. halbgefüllte Röhrchen).
Diese verschiedenen Röhrchen werden als "Fraktionen" bezeichnet. Das Ziel einer Säule ist es, so kleine Fraktionen zu sammeln, dass die meisten (oder einige) Fraktionen reines Material enthalten. Wenn die Trennung des Gemischs schwierig ist (wenn der ΔRf der Komponenten niedrig ist), kann es am besten sein, kleine Fraktionen zu sammeln (z. B. halbgefüllte Röhrchen).
a-c) Spülmaterial, das auf die Säulenspitze gespritzt wurde, d) Schüler, die eine Säule betreiben
21) Wenn die Flüssigkeit aus der Säule abläuft, spritzt sie oft auf die Außenseite der Säulenspitze, und wenn das Lösungsmittel verdampft, kann man einen Ring aus Material auf der Spitze sehen (einen Ring aus Feststoff, wenn die Komponente ein Feststoff ist, wie in Abb. 10 b, oder ölige Tröpfchen, wenn die Komponente eine Flüssigkeit ist). Wenn die Komponenten gefärbt sind, sollte die Säulenspitze gespült werden (Abb. 10 c), wenn es den Anschein hat, dass eine Komponente vollständig eluiert ist und bevor die andere Komponente hinzukommt.
22) Beobachten Sie regelmäßig den Eluentenstand und füllen Sie nach, bevor er unter die Sandschicht fällt.
22) Beobachten Sie regelmäßig den Eluentenstand und füllen Sie nach, bevor er unter die Sandschicht fällt.
a) Elution, b) Zugabe von Ethylacetat zur Erhöhung der Lösungsmittelpolarität, c) Lösungsmittelstand nähert sich der Sandschicht, d) Nachfüllen
Eventuell Erhöhung der Lösungsmittelpolarität
23) Ein Elutionsmittel kann für die gesamte Säule verwendet werden, insbesondere wenn die zu trennenden Komponenten ähnliche Rf-Werte aufweisen. Wenn die Komponenten jedoch sehr unterschiedliche Rf-Werte haben, kann die Polarität des Lösungsmittels erhöht werden, nachdem eine Komponente aus der Säule eluiert wurde (Abb. 11 a).
Die Erhöhung der Lösungsmittelpolarität führt dazu, dass die Komponenten "schneller" eluiert werden, was aus mehreren Gründen erwünscht ist. Erstens: Wenn eine Komponente die Säule bereits verlassen hat, hat die Säule ihre Aufgabe der Trennung bereits erledigt, so dass eine Beschleunigung des Prozesses keinen Einfluss auf die Reinheit der gesammelten Fraktionen hat. Zweitens: Je länger es dauert, eine Säule zu betreiben, desto breiter werden die Banden der Komponenten (aufgrund von Diffusion), und das Sammeln eines breiten Bandes von Material verbraucht (und verschwendet) eine Menge Lösungsmittel.
Die Erhöhung der Lösungsmittelpolarität führt dazu, dass die Komponenten "schneller" eluiert werden, was aus mehreren Gründen erwünscht ist. Erstens: Wenn eine Komponente die Säule bereits verlassen hat, hat die Säule ihre Aufgabe der Trennung bereits erledigt, so dass eine Beschleunigung des Prozesses keinen Einfluss auf die Reinheit der gesammelten Fraktionen hat. Zweitens: Je länger es dauert, eine Säule zu betreiben, desto breiter werden die Banden der Komponenten (aufgrund von Diffusion), und das Sammeln eines breiten Bandes von Material verbraucht (und verschwendet) eine Menge Lösungsmittel.
Enthält eine unvollständige Liste der eluotropen Reihen, eine Liste gebräuchlicher Lösungsmittel, die nach ihrer "Lösungskraft" in der Normalphasenchromatographie geordnet sind. Je polarer das Lösungsmittel ist, desto stärker steigt der Rf
24) Um die Polarität des Lösungsmittels zu erhöhen, kann das polare Lösungsmittel direkt in den Eluenten auf dem Säulenreservoir getropft werden (Abb.11 b). Wird beispielsweise ein Hexan-Ethylacetat-Gemisch verwendet, so würde die Zugabe von reinem Ethylacetat zu dem im Reservoir befindlichen Elutionsmittel dessen Polarität erhöhen. Wenn der Elutionsmittelstand zur Neige geht, könnte eine Lösung hergestellt werden, die einen höheren Anteil der polareren Komponente enthält. Wurde für die Säule beispielsweise zunächst ein Hexan-Ethylacetat-Gemisch im Verhältnis 4:1 verwendet, so wäre die Verwendung eines 1:1-Gemischs ein polareres Lösungsmittel.
25) Eluieren Sie die Säule wie zuvor mit dem polareren Lösungsmittel und achten Sie stets auf den Füllstand des Elutionsmittels und füllen Sie es nach (Abb. 11 d), bevor es unter die Sandschicht fällt.
26 ) Um die Polarität des Lösungsmittels zu erhöhen, kann das polare Lösungsmittel direkt in den Eluenten auf dem Säulenreservoir getropft werden (Abb. 11 b). Wird beispielsweise ein Hexan-Ethylacetat-Gemisch verwendet, kann durch Zugabe von reinem Ethylacetat zu dem im Reservoir befindlichen Elutionsmittel dessen Polarität erhöht werden. Wenn der Elutionsmittelstand zur Neige geht, könnte eine Lösung hergestellt werden, die einen höheren Anteil der polareren Komponente enthält. Wurde für die Säule beispielsweise zunächst ein Hexan-Ethylacetat-Gemisch im Verhältnis 4:1 verwendet, so wäre die Verwendung eines 1:1-Gemischs ein polareres Lösungsmittel.
27) Eluieren Sie die Säule wie zuvor mit dem polareren Lösungsmittel und achten Sie stets auf den Füllstand des Elutionsmittels und füllen Sie es nach (Abb. 11 d), bevor es unter die Sandschicht fällt.
25) Eluieren Sie die Säule wie zuvor mit dem polareren Lösungsmittel und achten Sie stets auf den Füllstand des Elutionsmittels und füllen Sie es nach (Abb. 11 d), bevor es unter die Sandschicht fällt.
26 ) Um die Polarität des Lösungsmittels zu erhöhen, kann das polare Lösungsmittel direkt in den Eluenten auf dem Säulenreservoir getropft werden (Abb. 11 b). Wird beispielsweise ein Hexan-Ethylacetat-Gemisch verwendet, kann durch Zugabe von reinem Ethylacetat zu dem im Reservoir befindlichen Elutionsmittel dessen Polarität erhöht werden. Wenn der Elutionsmittelstand zur Neige geht, könnte eine Lösung hergestellt werden, die einen höheren Anteil der polareren Komponente enthält. Wurde für die Säule beispielsweise zunächst ein Hexan-Ethylacetat-Gemisch im Verhältnis 4:1 verwendet, so wäre die Verwendung eines 1:1-Gemischs ein polareres Lösungsmittel.
27) Eluieren Sie die Säule wie zuvor mit dem polareren Lösungsmittel und achten Sie stets auf den Füllstand des Elutionsmittels und füllen Sie es nach (Abb. 11 d), bevor es unter die Sandschicht fällt.
a) Ursprüngliche TLC-Platte, b) Von der Säule gesammelte Fraktionen, c) Auftragen der Fraktionen auf eine TLC-Platte, d ) Eine visualisierte TLC-Platte mit den Proben der einzelnen Fraktionen
Auffinden und Konzentrieren des gewünschten Bestandteils
28) Um die gewünschte Komponente in den Reagenzglasfraktionen zu finden, ist es hilfreich, die Beziehung zwischen Rf und Elutionsreihenfolge in der Säulenchromatographie zu verstehen.Bei der Säulenchromatographie wird die Probe an der Spitze der Säule abgeschieden und nach unten eluiert, während bei der Dünnschichtchromatographie die Probe auf den Boden der Platte getupft wird und nach oben eluiert. Daher kann man sich eine Säule wie eine umgedrehte TLC-Platte vorstellen. Eine Verbindung mit einem höheren Rf-Wert läuft "schneller", d. h. sie landet auf einer TLC-Platte weiter oben und wird mit einer Säule zuerst gesammelt. In der in diesem Abschnitt dargestellten Säule ist die Komponente mit dem niedrigeren Rf-Wert (orangefarben auf der TLC-Platte in Abb. 13 a) die Komponente, die als zweite von der Säule gesammelt wird.
29) Bestimmen Sie zunächst, welche Reagenzgläser die gelöste Verbindung enthalten.
29) Bestimmen Sie zunächst, welche Reagenzgläser die gelöste Verbindung enthalten.
a) Tupfen Sie eine Probe jeder Fraktion auf eine TLC-Platte, die mit den Fraktionsnummern beschriftet ist, die der Reihenfolge entsprechen, in der sie gesammelt wurden (Abb. 13 c). Es kann sinnvoll sein, jede Probe 2-3 Mal übereinander zu geben, falls die Fraktionen verdünnt sind.
b) Wenn viele Fraktionen gesammelt wurden, so dass man zögert, jede Fraktion zu beproben, ist eine Methode zur Identifizierung farbloser Fraktionen, die eine Verbindung enthalten könnten, die Suche nach einer Spur von Rückständen, die die Reagenzgläser anführen. Nach dem Verdampfen bleiben manchmal ein fester Rückstand (Abb. 13) oder ölige Tröpfchen am oberen Rand des Reagenzglases zurück, die deutlich machen, dass diese Fraktionen mehr als nur Lösungsmittel enthalten. Entnehmen Sie alle Fraktionen in der Nähe der Röhrchen mit sichtbarem Rückstand.
c) Visualisieren Sie die fleckige TLC-Platte mit UV-Licht und/oder einem Farbstoff, um festzustellen, welche Fraktionen die Verbindung enthalten (Abb. 13 d)
a) Eluierte TLC-Platten der Fraktionen, die eine mögliche Verbindung enthalten, b) Kombinieren der Fraktionen, c) Spülen eines Fraktionsröhrchens
28) Führen Sie eine TLC aller Fraktionen durch, die eine Verbindung enthalten, und nehmen Sie bis zu fünf Proben auf eine 2,5 cm breite TLC-Platte auf. Falls vorhanden, können auch breitere TLC-Platten verwendet werden.
29) Identifizieren Sie die Verbindung mit dem gewünschten Rf-Wert durch Vergleich mit der ursprünglichen rohen TLC-Platte. Wählen Sie die Fraktionen aus, die die gewünschte Verbindung in reiner Form enthalten, wie es die eluierte TLC-Platte zeigt. Wenn z. B. die Verbindung mit dem höheren Rf-Wert in Abb. 15 a gewünscht wird, sollten die Fraktionen 6-10 beibehalten werden.
30) Geben Sie die reinen Fraktionen in einen Rundkolben geeigneter Größe (nicht mehr als halb voll, Abb. 15 b). Spülen Sie jedes Reagenzglas mit einer kleinen Menge Elutionsmittel (oder einem anderen Lösungsmittel, wenn die Löslichkeit ein Problem darstellt) und geben Sie die Spülung in den Rundkolben (Abb. 15 c).
31) Verdampfen Sie das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer, um die gereinigte Verbindung im Kolben zu belassen.
29) Identifizieren Sie die Verbindung mit dem gewünschten Rf-Wert durch Vergleich mit der ursprünglichen rohen TLC-Platte. Wählen Sie die Fraktionen aus, die die gewünschte Verbindung in reiner Form enthalten, wie es die eluierte TLC-Platte zeigt. Wenn z. B. die Verbindung mit dem höheren Rf-Wert in Abb. 15 a gewünscht wird, sollten die Fraktionen 6-10 beibehalten werden.
30) Geben Sie die reinen Fraktionen in einen Rundkolben geeigneter Größe (nicht mehr als halb voll, Abb. 15 b). Spülen Sie jedes Reagenzglas mit einer kleinen Menge Elutionsmittel (oder einem anderen Lösungsmittel, wenn die Löslichkeit ein Problem darstellt) und geben Sie die Spülung in den Rundkolben (Abb. 15 c).
31) Verdampfen Sie das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer, um die gereinigte Verbindung im Kolben zu belassen.
a) Trocknen der Säule mit Luftdruck, b) Trocknen der Säule auf dem Kopf stehend, c) Auffangen des Silica-Abfalls
Aufräumen der Säule
32) Um die Säule zu trocknen, lassen Sie den größten Teil des Eluenten aus der Säule in einen Abfallbehälter ab. Anschließend trocknen Sie die Säule mit einer der folgenden Methoden weiter.
a) Lassen Sie einen leichten Luftstrom durch die Säule strömen, um sie weiter zu trocknen, während Sie andere Dinge aufräumen (Abb. 16 a).
b ) Klemmen Sie die Säule kopfüber über einen großen Becher in den Abzug, so dass das Adsorptionsmittel nach dem Trocknen herunterfällt (Abb. 16 b). Dies wird sehr lange dauern (bis zur nächsten Unterrichtsstunde), ist aber eine Möglichkeit.
33) Wenn das Adsorptionsmittel trocken ist, kann es aus der Säule in einen Abfallbehälter im Abzug geschüttet werden (Abb. 16 c).
Sicherheitshinweis: Pulverförmige Adsorbentien sind lungenreizend, und ihre Gefährlichkeit wird noch verstärkt, wenn die Säule Restverbindungen enthält, die nun in die Lunge gelangen können. Das Schütten von Siliziumdioxid- oder Aluminiumoxidpulvern sollte immer im Abzug erfolgen.
34) Wenn der größte Teil des Adsorptionsmittels in einem Abfallbehälter aufgefangen wurde, spülen Sie die restlichen Feststoffe mit Wasser ins Waschbecken und die Säule anschließend mit Aceton in einen Abfallbecher. Reinigen Sie die Säule mit Wasser und Seife und trocknen Sie sie mit getrennten Absperrhahnteilen.
Sicherheitshinweis: Pulverförmige Adsorbentien sind lungenreizend, und ihre Gefährlichkeit wird noch verstärkt, wenn die Säule Restverbindungen enthält, die nun in die Lunge gelangen können. Das Schütten von Siliziumdioxid- oder Aluminiumoxidpulvern sollte immer im Abzug erfolgen.
34) Wenn der größte Teil des Adsorptionsmittels in einem Abfallbehälter aufgefangen wurde, spülen Sie die restlichen Feststoffe mit Wasser ins Waschbecken und die Säule anschließend mit Aceton in einen Abfallbecher. Reinigen Sie die Säule mit Wasser und Seife und trocknen Sie sie mit getrennten Absperrhahnteilen.
Fehlersuche
In der Säule sindLuftblasen zu sehen
Eine Luftblase ist eine leere Tasche, in der kein Gleichgewicht zwischen stationärer und mobiler Phase stattfindet, so dass sich die Komponenten schneller um eine Luftblase bewegen, als sie sollten. Dies kann zu ungleichmäßigen Elutionsbanden führen, die sich überlappen können, wenn die Trennung des Gemischs schwierig ist (wenn die Komponenten sehr enge Rf-Werte haben, wie in Abb. 17).
Wenn Luftblasen in der Säule zu sehen sind und der Sand oder die Probe noch nicht aufgetragen wurde, stoßen Sie die Säule beim Packen kräftig an, um alle Luftblasen zu entfernen. Wenden Sie sich an Ihren Ausbilder, wenn sich die Luftblasen nicht entfernen lassen, da Sie möglicherweise zu vorsichtig an die Aufgabe herangehen. Wenn der Sand oder die Probe bereits aufgetragen wurde, lassen Sie die Säule am besten so, wie sie ist, und hoffen, dass die Luftblasen die Trennung nicht beeinträchtigen.
Die Banden eluieren ungleichmäßig
Wenn die Komponenten eines Gemischs gefärbt sind, kann es offensichtlich sein, wenn die Banden schief eluieren. Dies ist höchstwahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die Säule leicht schräg eingespannt ist. Wenn die Säule schräg eingespannt ist, laufen die Komponenten schräg (Abb. 18). Dies kann zu Trennungsproblemen führen, wenn die Bauteile einen ähnlichen Rf-Wert haben.
Es gibt keine Möglichkeit, dieses Problem auf halbem Weg durch eine Säule zu lösen, aber wenn die Komponenten sehr unterschiedliche Rf-Werte haben, haben die schrägen Bänder möglicherweise keine Auswirkungen auf die Trennung. Achten Sie in Zukunft darauf, dass die Säule sowohl in der Seiten- als auch in der Vorderseiten-Rückseiten-Richtung perfekt vertikal ist.
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