Las tecnologías genéticas, que irrumpieron en la vida humana a finales del siglo pasado, han cambiado nuestro mundo hasta tal punto que ya es inimaginable sin ellas. Estas tecnologías también han conseguido penetrar en la medicina forense; desde hace décadas, la identificación genética se utiliza como un método rápido y relativamente barato que permite encontrar a los criminales y resolver sus actos sin salir del laboratorio. Como farmacólogo de formación, me interesa mucho la genética y estoy deseoso de estudiar este campo en sus diversos aspectos. En esta publicación les presentaré los enfoques genéticos clásicos en el campo de la medicina forense.
Un poco de historia o ¿qué tiene que ver con los caballeros?
Hace 150 años Johannes Friedrich Miescher descubrió los ácidos nucleicos, un concepto que acabó poniendo el mundo patas arriba [1]. A mediados del siglo XX quedó claro que el ADN y el ARN eran portadores de información hereditaria; después se describió su estructura y, un poco más tarde, aparecieron numerosos métodos que permitían "cortar" estas moléculas in vitro mediante enzimas celulares -restrictasas [2]; amplificarlas mediante PCR [3]; e incluso leer la secuencia de genes y genomas específicos utilizando múltiples métodos de secuenciación [4].
Al principio, el trabajo con material genético se realizaba literalmente "en la cocina" y no siempre podía reproducirse ni siquiera en el laboratorio científico vecino. Pero el tiempo pasó, los enfoques cambiaron y los métodos se estandarizaron hasta tal punto que se introdujeron gradualmente en la investigación aplicada e incluso en la producción biotecnológica.
En 1984, la comunidad científica se conmovió con la noticia de que unos científicos habían conseguido aislar y leer un fragmento de ADN de la cebra Burchell, extinguida y que sólo sobrevive en colecciones de museos [5]. Un año después, el genetista sueco Svante Pääbo confirmó la posibilidad de utilizar material museístico y arqueológico para la investigación científica fundamental, tras haber analizado por primera vez el material genético de momias egipcias. Años más tarde, resultó que las muestras que analizó estaban contaminadas con material genético moderno [6], pero el desarrollo de los métodos de secuenciación permitió trabajar incluso con cantidades mínimas de ADN mal conservado.
Los forenses también se interesaron por las nuevas técnicas de análisis del material genético. Y es que los métodos clásicos de dactiloscopia y análisis de grupos sanguíneos, habituales en aquella época, tenían sus limitaciones y, en algunos casos, fallaban.
En 1984, el científico británico Sir Alec John Jeffreys (Figura 3) desarrolló y presentó un método para identificar a una persona utilizando su material genético. Más tarde este método se denominó identificación por ADN, ganándose el cariño y el respeto de criminólogos de todo el mundo. Jeffreys fue nombrado caballero por su trabajo.
Un poco de historia o ¿qué tiene que ver con los caballeros?
Hace 150 años Johannes Friedrich Miescher descubrió los ácidos nucleicos, un concepto que acabó poniendo el mundo patas arriba [1]. A mediados del siglo XX quedó claro que el ADN y el ARN eran portadores de información hereditaria; después se describió su estructura y, un poco más tarde, aparecieron numerosos métodos que permitían "cortar" estas moléculas in vitro mediante enzimas celulares -restrictasas [2]; amplificarlas mediante PCR [3]; e incluso leer la secuencia de genes y genomas específicos utilizando múltiples métodos de secuenciación [4].
Al principio, el trabajo con material genético se realizaba literalmente "en la cocina" y no siempre podía reproducirse ni siquiera en el laboratorio científico vecino. Pero el tiempo pasó, los enfoques cambiaron y los métodos se estandarizaron hasta tal punto que se introdujeron gradualmente en la investigación aplicada e incluso en la producción biotecnológica.
En 1984, la comunidad científica se conmovió con la noticia de que unos científicos habían conseguido aislar y leer un fragmento de ADN de la cebra Burchell, extinguida y que sólo sobrevive en colecciones de museos [5]. Un año después, el genetista sueco Svante Pääbo confirmó la posibilidad de utilizar material museístico y arqueológico para la investigación científica fundamental, tras haber analizado por primera vez el material genético de momias egipcias. Años más tarde, resultó que las muestras que analizó estaban contaminadas con material genético moderno [6], pero el desarrollo de los métodos de secuenciación permitió trabajar incluso con cantidades mínimas de ADN mal conservado.
Los forenses también se interesaron por las nuevas técnicas de análisis del material genético. Y es que los métodos clásicos de dactiloscopia y análisis de grupos sanguíneos, habituales en aquella época, tenían sus limitaciones y, en algunos casos, fallaban.
En 1984, el científico británico Sir Alec John Jeffreys (Figura 3) desarrolló y presentó un método para identificar a una persona utilizando su material genético. Más tarde este método se denominó identificación por ADN, ganándose el cariño y el respeto de criminólogos de todo el mundo. Jeffreys fue nombrado caballero por su trabajo.
Dactiloscopia de ADN: ventajas e inconvenientes
El análisis genético de muestras biológicas obtenidas en el lugar del delito ha simplificado enormemente el trabajo de los investigadores. Ahora disponen de una herramienta fiable para identificar al autor o a la víctima, obtener pruebas irrefutables y resolver delitos.
Las principales ventajas de la dactiloscopia genética son la capacidad de trabajar incluso con pequeñas cantidades de material biológico y la gran precisión que permite la identificación de un individuo: si se cumplen todos los requisitos para el análisis, su fiabilidad supera el 99%. Este método se ha convertido en uno de los más importantes en la investigación de delitos [7].
Es importante señalar que los métodos clásicos de dactiloscopia de ADN no permiten identificar a gemelos idénticos cuyo perfil genético sea el mismo, ya que se forman a partir del mismo óvulo fecundado.
Para el análisis del ADN se necesita, en primer lugar, el propio ADN, pero no siempre es posible extraer material genético de alta calidad de muestras biológicas que han estado expuestas a factores químicos y térmicos. Una vez en el medio ambiente, esta molécula entra en reacciones químicas, se destruye (fragmenta) y se modifica, aunque en condiciones favorables puede persistir durante miles de años [8].
Se sabe que el material genético más antiguo de los antepasados humanos se extrajo de los restos óseos de nuestros parientes humanoides que vivieron en el territorio de la Península Ibérica (Sierra de Atapuerca) hace unos 430 mil años [9]. El microclima específico de algunas cuevas, con valores bajos de humedad y temperatura, aumenta significativamente la vida útil del material genético. Sin embargo, el ADN de las muestras encontradas en la escena del crimen suele estar representado en cantidades mínimas y, al igual que en las muestras arqueológicas, está muy degradado.
En Europa y Estados Unidos se llama la atención sobre otra desventaja de la toma de huellas genéticas, relacionada con la interferencia en la intimidad de las personas y la violación de la privacidad.
Los activistas de derechos humanos temen que la información genética de delincuentes y sospechosos de delitos pueda caer en manos de terceros y luego ser utilizada indebidamente [10]. Por ejemplo, ya se conocen casos de uso de información genética para controlar a minorías musulmanas en la provincia china de Xinjiang.
Estados Unidos también planea recopilar sistemáticamente perfiles de ADN de inmigrantes bajo custodia federal [11]. Obviamente, los temores de los activistas de derechos humanos no son infundados y tienen un fundamento real.
Las principales ventajas de la dactiloscopia genética son la capacidad de trabajar incluso con pequeñas cantidades de material biológico y la gran precisión que permite la identificación de un individuo: si se cumplen todos los requisitos para el análisis, su fiabilidad supera el 99%. Este método se ha convertido en uno de los más importantes en la investigación de delitos [7].
Es importante señalar que los métodos clásicos de dactiloscopia de ADN no permiten identificar a gemelos idénticos cuyo perfil genético sea el mismo, ya que se forman a partir del mismo óvulo fecundado.
Para el análisis del ADN se necesita, en primer lugar, el propio ADN, pero no siempre es posible extraer material genético de alta calidad de muestras biológicas que han estado expuestas a factores químicos y térmicos. Una vez en el medio ambiente, esta molécula entra en reacciones químicas, se destruye (fragmenta) y se modifica, aunque en condiciones favorables puede persistir durante miles de años [8].
Se sabe que el material genético más antiguo de los antepasados humanos se extrajo de los restos óseos de nuestros parientes humanoides que vivieron en el territorio de la Península Ibérica (Sierra de Atapuerca) hace unos 430 mil años [9]. El microclima específico de algunas cuevas, con valores bajos de humedad y temperatura, aumenta significativamente la vida útil del material genético. Sin embargo, el ADN de las muestras encontradas en la escena del crimen suele estar representado en cantidades mínimas y, al igual que en las muestras arqueológicas, está muy degradado.
En Europa y Estados Unidos se llama la atención sobre otra desventaja de la toma de huellas genéticas, relacionada con la interferencia en la intimidad de las personas y la violación de la privacidad.
Los activistas de derechos humanos temen que la información genética de delincuentes y sospechosos de delitos pueda caer en manos de terceros y luego ser utilizada indebidamente [10]. Por ejemplo, ya se conocen casos de uso de información genética para controlar a minorías musulmanas en la provincia china de Xinjiang.
Estados Unidos también planea recopilar sistemáticamente perfiles de ADN de inmigrantes bajo custodia federal [11]. Obviamente, los temores de los activistas de derechos humanos no son infundados y tienen un fundamento real.
Cómo funciona
Los métodos de dactiloscopia de ADN se basan en la variabilidad genética humana. Las sustituciones de nucleótidos en el ADN (según su frecuencia en la población, también se denominan polimorfismos o mutaciones del ADN) nos hacen individualmente diferentes. Y estas diferencias pueden encontrarse tanto en el genoma nuclear como en el mitocondrial, pequeñas moléculas circulares de ADN que regulan el funcionamiento de las mitocondrias, las "fábricas" de energía de las células.
Cabe señalar que en el genoma de cada uno de nosotros pueden encontrarse polimorfismos de ADN, que se convierten en nuestro código de barras de ADN único. Algunos de ellos pueden causar enfermedades graves [12], pero en la mayoría de los casos no tienen ningún efecto sobre nuestras funciones vitales.
Los métodos modernos de dactiloscopia del ADN utilizan diversas variantes genéticas en diferentes regiones del genoma. Por ejemplo, el análisis de repeticiones en tándem -secuencias repetitivas cortas del genoma cuyo número difiere en dos individuos muestreados al azar [13]- permite realizar una prueba de paternidad clara o encontrar pruebas adicionales contra un sospechoso de un delito.
Los marcadores de ADN cromosómico Y pueden utilizarse para determinar el sexo de una persona. Los marcadores genéticos proporcionan información sobre la etnia de los parientes de un individuo, su color de ojos o de pelo.
Además, la información epigenética (por ejemplo, la metilación del ADN) permite estimar la edad biológica de células individuales, tejidos y del organismo en su conjunto [14]. En este artículo hablaré más sobre los métodos de análisis genético mencionados. Y el uso de métodos epigenéticos en el negocio de los medicamentos será el tema de mi próxima publicación.
Los marcadores de ADN cromosómico Y pueden utilizarse para determinar el sexo de una persona. Los marcadores genéticos proporcionan información sobre la etnia de los parientes de un individuo, su color de ojos o de pelo.
Además, la información epigenética (por ejemplo, la metilación del ADN) permite estimar la edad biológica de células individuales, tejidos y del organismo en su conjunto [14]. En este artículo hablaré más sobre los métodos de análisis genético mencionados. Y el uso de métodos epigenéticos en el negocio de los medicamentos será el tema de mi próxima publicación.
Extracción y aislamiento de ADN a partir de material biológico
La extracción y el análisis de ADN a partir de muestras forenses es, a primera vista, comparable al arte. A veces es imposible imaginar que unas gotas de sangre o un trozo de piel bajo las uñas de una víctima puedan convertirse en las pruebas más importantes de una investigación criminal.
De hecho, las actuaciones de los especialistas forenses en el lugar del delito están afinadas y siguen un mismo escenario, uno de cuyos objetivos principales es encontrar material biológico apto para la extracción de ADN. Cualquier tejido biológico y las secreciones humanas pueden utilizarse para este fin .
- Restos óseos
- Dientes
- Folículos pilosos
- Sangre
- Células epiteliales
- Sudor
- Saliva
- Muestras de esperma
- Excrementos, etc.
El material biológico en el almacén de pruebas puede durar décadas. A menudo, el examinador sólo toma una parte del material para examinarlo, tanto como necesite para la extracción de ADN. Por ejemplo, si hay restos de sangre en el cuchillo, el experto no lava toda la sangre, sino que hace un pequeño enjuague justo antes de la extracción de ADN. Esto deja rastros en el cuchillo, que pueden utilizarse para realizar un nuevo examen varias décadas después.
En el núcleo celular, el ADN está en estrecho contacto con numerosas moléculas orgánicas necesarias para su funcionamiento eficaz. Sin embargo, para el análisis genético, es necesario eliminar los hidratos de carbono, los lípidos y las proteínas de la muestra de análisis, lo que puede reducir la eficacia de los métodos utilizados y, en consecuencia, afectar a la resolución de los delitos.La extracción de ADN requiere poco tiempo gracias a la existencia de diversos kits y sistemas comerciales diseñados específicamente para la extracción de ácidos nucleicos (por ejemplo, el sistema de extracción de ADN AutoMate Express de Thermo Fisher Scientific). Además, en los grandes centros forenses con miles de análisis al día, este proceso está totalmente automatizado y se lleva a cabo con la participación de robots bajo la supervisión de un operador.
Por cierto, los sistemas robotizados se utilizan ampliamente no sólo en los laboratorios forenses, sino también en muchos centros médicos y de biotecnología, lo que permite acelerar el proceso, reducir el coste del trabajo y disminuir considerablemente la posibilidad de error.
Tras la extracción, el ADN se disuelve en un compuesto especial, donde puede almacenarse durante años (a -20°C o -80°C) si es necesario.
Análisis genético
Inmediatamente después de la extracción del ADN, el especialista se enfrenta a la cuestión de cómo analizarlo. Desde la introducción de la identificación del ADN en la medicina forense, las técnicas de biología molecular han cambiado tanto que existen diversas variantes posibles. En el siguiente artículo destacaremos las distintas técnicas de análisis del ADN que utilizan los expertos forenses en su práctica.
Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (análisis RFLP)
El análisis RFLP es históricamente uno de los primeros métodos de identificación del ADN. Se basa en el uso de enzimas celulares especiales, las restrictasas. Las enzimas de restricción pueden reconocer determinados sitios en una molécula de ácido nucleico y cortarla a través de estos sitios. Hasta la fecha se han descrito varios miles de enzimas de este tipo. Tras cortar la molécula de DnA con enzimas de restricción, las longitudes de los fragmentos obtenidos se evalúan mediante electroforesis en gel (Figura 9).
Inmediatamente después de la extracción del ADN, el especialista se enfrenta a la cuestión de cómo analizarlo. Desde la introducción de la identificación del ADN en la medicina forense, las técnicas de biología molecular han cambiado tanto que existen diversas variantes posibles. En el siguiente artículo destacaremos las distintas técnicas de análisis del ADN que utilizan los expertos forenses en su práctica.
Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (análisis RFLP)
El análisis RFLP es históricamente uno de los primeros métodos de identificación del ADN. Se basa en el uso de enzimas celulares especiales, las restrictasas. Las enzimas de restricción pueden reconocer determinados sitios en una molécula de ácido nucleico y cortarla a través de estos sitios. Hasta la fecha se han descrito varios miles de enzimas de este tipo. Tras cortar la molécula de DnA con enzimas de restricción, las longitudes de los fragmentos obtenidos se evalúan mediante electroforesis en gel (Figura 9).
Dado que no existen genomas humanos completamente idénticos (salvo en el caso de gemelos idénticos), la diferencia o similitud en los perfiles de longitud de los fragmentos de ADN resultantes puede ser un buen marcador tanto para la identificación personal como para la determinación del parentesco.
Sin embargo, este método implica la fragmentación del ADN y, por tanto, es sensible a la calidad y cantidad del material genético original. Por este motivo, el análisis RFLP no se utiliza prácticamente en la actualidad, a diferencia de otros métodos, que se analizarán más adelante.
Análisis del número de repeticiones en tándem en el genoma
Las repeticiones en tándem son copias de la misma secuencia corta de ADN repetida una tras otra [15]. Las repeticiones que interesan a los científicos forenses incluyen loci con un número variable de repeticiones en tándem (VNTR) y repeticiones cortas en tándem (STR). También se denominan minisatélites y microsatélites, respectivamente.
La esencia de este método es la amplificación por PCR de fragmentos de ADN que contienen estas secuencias repetitivas cortas cuyas longitudes son diferentes en dos individuos muestreados aleatoriamente. Tras la amplificación, la longitud de los fragmentos obtenidos se evalúa mediante electroforesis en gel o electroforesis capilar.
Para ello se puede utilizar el kit de cuantificación de ADN Quantifiler y el sistema QuantStudio de Termo Fisher Scientific. El QuantStudio es un instrumento compacto de sobremesa con una amplia gama de funciones.
Al igual que con el método anterior, el principal factor de identificación del ensayo STR es la longitud de los fragmentos obtenidos, que es única para cada individuo y depende del número de repeticiones en el sitio analizado. El análisis de STR se caracteriza por su gran precisión y rapidez, así como por su bajo coste. La calidad del material genético es una condición importante para el análisis.
Sin embargo, este método implica la fragmentación del ADN y, por tanto, es sensible a la calidad y cantidad del material genético original. Por este motivo, el análisis RFLP no se utiliza prácticamente en la actualidad, a diferencia de otros métodos, que se analizarán más adelante.
Análisis del número de repeticiones en tándem en el genoma
Las repeticiones en tándem son copias de la misma secuencia corta de ADN repetida una tras otra [15]. Las repeticiones que interesan a los científicos forenses incluyen loci con un número variable de repeticiones en tándem (VNTR) y repeticiones cortas en tándem (STR). También se denominan minisatélites y microsatélites, respectivamente.
La esencia de este método es la amplificación por PCR de fragmentos de ADN que contienen estas secuencias repetitivas cortas cuyas longitudes son diferentes en dos individuos muestreados aleatoriamente. Tras la amplificación, la longitud de los fragmentos obtenidos se evalúa mediante electroforesis en gel o electroforesis capilar.
Para ello se puede utilizar el kit de cuantificación de ADN Quantifiler y el sistema QuantStudio de Termo Fisher Scientific. El QuantStudio es un instrumento compacto de sobremesa con una amplia gama de funciones.
Al igual que con el método anterior, el principal factor de identificación del ensayo STR es la longitud de los fragmentos obtenidos, que es única para cada individuo y depende del número de repeticiones en el sitio analizado. El análisis de STR se caracteriza por su gran precisión y rapidez, así como por su bajo coste. La calidad del material genético es una condición importante para el análisis.
El análisis de STR apareció en la práctica forense hace casi veinte años, pero a día de hoy sigue siendo el principal método de identificación de individuos. Los criminólogos introducen los resultados de los análisis de ADN de sospechosos y delincuentes -perfiles genéticos- en bases de datos especiales.
Por lo tanto, cuando en el lugar del delito se encuentran rastros biológicos de los que se puede aislar ADN, es posible identificar a todas las personas que ya han llamado la atención de las fuerzas del orden. Los mismos marcadores se utilizan para buscar a personas desaparecidas y establecer la paternidad.
Por lo tanto, cuando en el lugar del delito se encuentran rastros biológicos de los que se puede aislar ADN, es posible identificar a todas las personas que ya han llamado la atención de las fuerzas del orden. Los mismos marcadores se utilizan para buscar a personas desaparecidas y establecer la paternidad.
Por regla general, los sistemas diseñados para identificar individuos permiten analizar varios loci del genoma (10-24) a la vez, incluido el gen de la proteína amelogenina, por el que se determina el sexo. El gen de la amelogenina se encuentra tanto en el cromosoma X como en el Y, pero difiere en tamaño, lo que permite determinar el sexo de una persona.
Gracias al uso de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, los forenses han obtenido una herramienta eficaz que ha abierto nuevas oportunidades para el análisis simultáneo de múltiples sitios (loci) de los genomas nuclear y mitocondrial.
Una ventaja importante de estos métodos es la capacidad de distinguir incluso gemelos idénticos (por mutaciones somáticas), lo que resulta imposible con los análisis RFLP o STR.
Gracias al uso de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, los forenses han obtenido una herramienta eficaz que ha abierto nuevas oportunidades para el análisis simultáneo de múltiples sitios (loci) de los genomas nuclear y mitocondrial.
Una ventaja importante de estos métodos es la capacidad de distinguir incluso gemelos idénticos (por mutaciones somáticas), lo que resulta imposible con los análisis RFLP o STR.
La segunda parte de esta publicación describirá cómo pueden utilizarse los métodos descritos para identificar laboratorios de drogas y narcotraficantes, y cómo se puede confundir a los forenses limpiando sus huellas.
Leer PARTE II
