Resumen.
La realización de un estudio sobre los efectos proinflamatorios de la mefedrona y la identificación de sus características etológicas constituyen una etapa obligatoria en la investigación de la 4-MMC, considerada una de las sustancias psicoactivas más populares en términos de uso recreativo. La administración, el transporte y la concentración de la mefedrona en sus tejidos diana dependen no sólo de la dosis administrada, sino también de otros muchos factores: la distribución de la sustancia, el grado y la velocidad de absorción, la vía del metabolismo y la excreción. A lo largo del estudio, es importante determinar la proporción de la sustancia distribuida en los tejidos diana o los fluidos biológicos con los que se transporta, de modo que se pueda averiguar qué parte de la sustancia administrada sufre biotransformación y qué parte llega a la circulación sanguínea sistémica sin cambios. Asimismo, en la fase de pruebas preclínicas, además de estudiar los principales mecanismos de acción, es necesario realizar un amplio cribado fenotípico, necesario para conocer en profundidad la farmacodinámica y los efectos secundarios de la sustancia. Uno de los aspectos importantes de dicho cribado es el estudio de las propiedades psicoactivas de la sustancia.
Objetivos del estudio.
1. 1. Determinar patrones cognitivos, motivacionales y conductuales en ratas a las que se administró 4-metilmetacatinona.
2. Estudiar la función endotelial mediante la realización de pruebas farmacológicas vasculares utilizando el bloqueo de la síntesis de NO bajo el control ecográfico de la velocidad del flujo sanguíneo en la arteria femoral de rata y la monitorización por flujometría Doppler láser de la hemodinámica general y la velocidad de la microcirculación en el músculo medial.
3. 3. Identificar y evaluar las actividades proinflamatorias e inmunorreguladoras de la 4-metilmetacatinona utilizando el modelo de edema de la pata inducido por formalina y el ensayo NBT.
Materiales y métodos.
El estudio se realizó en 40 ratas Wistar macho de 180-200 g de peso. Se identificaron 4 grupos: 1) Grupo control (ratas intactas); 2) Ratas, a las que se administró mefedrona por vía intraperitoneal cada 48 horas a una dosis de 5 mg/kg disuelta en solución de NaCl 0,9 (0,5 ml). 3) Ratas a las que se administró mefedrona por vía oral (a través de una sonda) cada 48 horas a una dosis de 5 mg/kg disuelta en solución de NaCl 0,9 (0,5 ml). 4) Ratas a las que se administró mefedrona por vía intraperitoneal cada 48 horas a una dosis de 5 mg/kg disuelta en solución de NaCl 0,9 (0,5 ml) antes de la administración de formalina para el modelo de edema de la pata inducido por formalina.
Descripción y discusión del estudio.
Determinación de patrones cognitivos motivacionales y conductuales en ratas a las que se administró 4-metilmetacatinona. Para lograrlo, se formularon los siguientes objetivos: Evaluar la influencia de la 4-metilmetacatinona en el nivel de excitación, ansiedad y resistencia al estrés en ratas. Para determinar el estado psicoemocional de los animales estudiados, utilizamos un protocolo de prueba de Hall mejorado, que consiste en colocar un objeto en una arena estandarizada y registrar indicadores de actividad utilizando el complejo de software y hardware PANLAB Harvard Apparatus. Se seleccionaron como unidades de evaluación actos conductuales discretos registrados mediante el complejo de software y hardware.
El estudio se llevó a cabo con 30 ratas (Grupos 1, 2 y 3 respectivamente). Antes del experimento, los animales se mantuvieron en un vivario de laboratorio de 10 individuos en una jaula, con un régimen inconverso de 12 horas, a una temperatura ambiente de 22-24 °C y una humedad del 60%, con una dieta estándar. Los experimentos se llevaron a cabo en verano. Se comprobó la normalidad de la distribución de los resultados obtenidos mediante el criterio de Shapiro-Wilk y se procesaron por métodos de estadística variacional utilizando la prueba t de Student y el paquete informático STATISTICA. La figura muestra esquemáticamente el diseño del experimento. Se registraron la actividad horizontal, la reacción de acicalamiento, la actividad de búsqueda, la actividad locomotora, la micción y la defecación para evaluar el comportamiento exploratorio. El experimento se llevó a cabo en una habitación oscura, aislada de ruidos extraños y de la luz solar, en un período de 10 a 14 horas. El campo abierto era un área cuadrada de 150x150 cm de tamaño con lados de 30 cm de altura. La temperatura de la sala se mantuvo en 23 grados centígrados. Después de cada animal, se desinfectaba el campo abierto para desodorizarlo. Antes del estudio de cada grupo, se liberó un animal cero en el campo abierto.
El día 21, las ratas fueron retiradas del experimento. Tras anestesiar a las ratas, se aisló la arteria carótida derecha en una plataforma fija, se expuso el músculo medial del muslo y se cateterizó la vena femoral izquierda. El estudio multicomponente de los parámetros hemodinámicos se investigó mediante el método de pruebas de provocación especializadas que implicaban la administración de acetilcolina y nitroprusiato sódico (NO) en el catéter femoral. Los parámetros (presión arterial sistólica, presión arterial diastólica, frecuencia cardiaca) se registraron mediante un sensor TDS. El sensor se instaló sobre el tercio medio de la arteria femoral derecha y se registraron los siguientes indicadores: velocidad sistólica (VS) y diastólica (VD) máximas, velocidad media (QAs) y volumétrica (QAM) del flujo sanguíneo, índice de pulsación (PL, índice de Gosling) e índice de resistividad (RI, índice de Pourcelot). Para medir la velocidad de las células sanguíneas en los vasos del lecho microcirculatorio, se utilizó una sonda-sensor en forma de aguja, que se colocó en el tercio inferior del músculo ancho medial del muslo. Se inyectaron agentes vasoactivos (acetilcolina - 40 mcg/kg, nitroprusiato sódico - 30 mcg/ kg) a través de un catéter insertado en la vena femoral izquierda secuencialmente a intervalos de 15 minutos. De este modo, existía la posibilidad de monitorizar en paralelo los parámetros hemodinámicos y de microcirculación en un sistema de tres niveles (circulación central - sistema vascular elástico - sistema vascular periférico). El procesamiento estadístico de los resultados se realizó con el programa STATISTICA 10. A continuación se calculó el coeficiente de disfunción endotelial (QED). El análisis estadístico se llevó a cabo mediante la prueba de rangos de Spearman, el cálculo de la fiabilidad entre los grupos se realizó mediante la prueba t paramétrica de Student.
Los diagramas presentados muestran que la influencia de la mefedrona sobre el comportamiento animal corresponde a sus efectos principales, asociados a su mecanismo de acción conocido. Así, el diagrama 1 ilustra un aumento significativo de la actividad motora horizontal en comparación con el grupo de control. El diagrama 2 muestra que los actos de acicalamiento se reducen significativamente. Este fenómeno está causado por una disminución de la influencia motivacional con respecto a la necesidad presente. El diagrama 3 visualiza claramente un aumento de los actos de defecación y micción, que es uno de los efectos frecuentes de la ingesta de 4-mmc. Un aumento de la actividad horizontal puede indicar efectos ansiolíticos, ansiógenos, de agitación o un aumento de la actividad motora sin componente emocional (excitación motora). Las reacciones de acicalamiento también pueden interpretarse de forma ambigua, ya que la frecuencia de los actos de acicalamiento aumenta tanto en un entorno estresante como en uno favorable. Las manifestaciones de actividad exploratoria, así como la frecuencia de micciones y defecaciones, pueden interpretarse de forma más inequívoca. Utilizando este algoritmo, puede concluirse que el efecto farmacodinámico relativo a la mayor actividad nerviosa puede interpretarse como excitación motora con un componente emocional.
El grupo de control demostró el mismo tipo de respuestas a la introducción de ACH y NO, que se manifestaron como un descenso de la presión arterial sistólica, diastólica y media, una disminución de la velocidad lineal de la microcirculación, así como de la velocidad diastólica del movimiento sanguíneo en la arteria femoral (en adelante FA), (indicadores de datos - Vd, Vad); 2) un aumento de la velocidad sistólica del movimiento sanguíneo en FA (VS, Vas), los índices de Purcello y Gosling. Los parámetros volvieron a sus valores originales al cabo de 2 minutos.
Se realizó un tratamiento estadístico adicional al determinar un número de valores a lo largo del tiempo para cada muestra, que se expresaron en porcentaje. El criterio de Spearman, utilizado para el análisis estadístico, mostró la mejor expresión de la diferencia necesaria en los parámetros estadísticamente importantes. El mayor grado de correlación (p<0,05) se determinó entre el índice de presión arterial media (en lo sucesivo, DAM), la velocidad lineal de microcirculación, la velocidad sistólica y la diferencia de velocidad sistólica-diastólica en la arteria femoral. Otros parámetros ecográficos demostraron una correlación baja y menos fiable con la dinámica de la presión arterial y la velocidad de la microcirculación. El estudio de los 4-mmc administrados por vía oral reveló un aumento estadísticamente significativo de los indicadores de TAE, DAD y del coeficiente de disfunción endotelial (QED) en comparación con el grupo de control. Los indicadores de velocidad sistólica máxima (VS) y diastólica máxima (VD) se reducen significativamente durante las pruebas de provocación en las ratas del grupo 3, en las que se administró mefedrona por vía oral.
La eficacia de los factores de relajación dependientes del endotelio liberados y activados por la administración de acetilcolina se reduce cuantitativa y cualitativamente. El efecto mediado por NO en respuesta a la prueba de provocación con ACH disminuye, debido al efecto negativo del 4-mmc sobre la producción y expresión tanto de este factor como de la actividad de la guanilato ciclasa. La relajación dependiente del endotelio de los vasos microcirculatorios inducida por la ACH, mediada a través de receptores muscarínicos, también se ve alterada debido a la degeneración de la actividad del receptor, y también debido a una disminución de la densidad de receptores en la superficie de los endoteliocitos. Es probable que el mecanismo de reducción de la reacción dependiente del endotelio mediada por ACH en respuesta al consumo de mefedrona esté causado por un aumento significativo de la formación de radicales libres (tanto superóxido como hidroxilo) en el estado hipóxico de la célula, que interactúan con NO2 y NO3.
Se produjo una disminución estadísticamente significativa de la actividad metabólica de los neutrófilos en un 38,4% (Me = 13,1 con un rango intercuartílico de 10,3 a 15,9 con una diferencia de 5,3 a p=0,002; z = 3,008) en comparación con los indicadores del grupo de control. En el estudio de la capacidad de absorción de la fagocitosis con la adición de látex, los indicadores aumentaron de 13,1 Me a 16,5 Me, con un aumento porcentual del 18,2% para el Grupo 3 (administración intraperitoneal), sin embargo, la diferencia porcentual en comparación con el grupo control es del 18,0%, lo que constituye una prueba significativa y estadísticamente fiable de la acción inmunosupresora. Asimismo, se observó una disminución estadísticamente significativa de la fagocitosis espontánea en el Grupo 3, que se redujo en un 25,3% (a p>0,0001, z=2,84) en comparación con los animales intactos.
La realización de un estudio sobre los efectos proinflamatorios de la mefedrona y la identificación de sus características etológicas constituyen una etapa obligatoria en la investigación de la 4-MMC, considerada una de las sustancias psicoactivas más populares en términos de uso recreativo. La administración, el transporte y la concentración de la mefedrona en sus tejidos diana dependen no sólo de la dosis administrada, sino también de otros muchos factores: la distribución de la sustancia, el grado y la velocidad de absorción, la vía del metabolismo y la excreción. A lo largo del estudio, es importante determinar la proporción de la sustancia distribuida en los tejidos diana o los fluidos biológicos con los que se transporta, de modo que se pueda averiguar qué parte de la sustancia administrada sufre biotransformación y qué parte llega a la circulación sanguínea sistémica sin cambios. Asimismo, en la fase de pruebas preclínicas, además de estudiar los principales mecanismos de acción, es necesario realizar un amplio cribado fenotípico, necesario para conocer en profundidad la farmacodinámica y los efectos secundarios de la sustancia. Uno de los aspectos importantes de dicho cribado es el estudio de las propiedades psicoactivas de la sustancia.
Objetivos del estudio.
1. 1. Determinar patrones cognitivos, motivacionales y conductuales en ratas a las que se administró 4-metilmetacatinona.
2. Estudiar la función endotelial mediante la realización de pruebas farmacológicas vasculares utilizando el bloqueo de la síntesis de NO bajo el control ecográfico de la velocidad del flujo sanguíneo en la arteria femoral de rata y la monitorización por flujometría Doppler láser de la hemodinámica general y la velocidad de la microcirculación en el músculo medial.
3. 3. Identificar y evaluar las actividades proinflamatorias e inmunorreguladoras de la 4-metilmetacatinona utilizando el modelo de edema de la pata inducido por formalina y el ensayo NBT.
Materiales y métodos.
El estudio se realizó en 40 ratas Wistar macho de 180-200 g de peso. Se identificaron 4 grupos: 1) Grupo control (ratas intactas); 2) Ratas, a las que se administró mefedrona por vía intraperitoneal cada 48 horas a una dosis de 5 mg/kg disuelta en solución de NaCl 0,9 (0,5 ml). 3) Ratas a las que se administró mefedrona por vía oral (a través de una sonda) cada 48 horas a una dosis de 5 mg/kg disuelta en solución de NaCl 0,9 (0,5 ml). 4) Ratas a las que se administró mefedrona por vía intraperitoneal cada 48 horas a una dosis de 5 mg/kg disuelta en solución de NaCl 0,9 (0,5 ml) antes de la administración de formalina para el modelo de edema de la pata inducido por formalina.
Descripción y discusión del estudio.
Determinación de patrones cognitivos motivacionales y conductuales en ratas a las que se administró 4-metilmetacatinona. Para lograrlo, se formularon los siguientes objetivos: Evaluar la influencia de la 4-metilmetacatinona en el nivel de excitación, ansiedad y resistencia al estrés en ratas. Para determinar el estado psicoemocional de los animales estudiados, utilizamos un protocolo de prueba de Hall mejorado, que consiste en colocar un objeto en una arena estandarizada y registrar indicadores de actividad utilizando el complejo de software y hardware PANLAB Harvard Apparatus. Se seleccionaron como unidades de evaluación actos conductuales discretos registrados mediante el complejo de software y hardware.
El estudio se llevó a cabo con 30 ratas (Grupos 1, 2 y 3 respectivamente). Antes del experimento, los animales se mantuvieron en un vivario de laboratorio de 10 individuos en una jaula, con un régimen inconverso de 12 horas, a una temperatura ambiente de 22-24 °C y una humedad del 60%, con una dieta estándar. Los experimentos se llevaron a cabo en verano. Se comprobó la normalidad de la distribución de los resultados obtenidos mediante el criterio de Shapiro-Wilk y se procesaron por métodos de estadística variacional utilizando la prueba t de Student y el paquete informático STATISTICA. La figura muestra esquemáticamente el diseño del experimento. Se registraron la actividad horizontal, la reacción de acicalamiento, la actividad de búsqueda, la actividad locomotora, la micción y la defecación para evaluar el comportamiento exploratorio. El experimento se llevó a cabo en una habitación oscura, aislada de ruidos extraños y de la luz solar, en un período de 10 a 14 horas. El campo abierto era un área cuadrada de 150x150 cm de tamaño con lados de 30 cm de altura. La temperatura de la sala se mantuvo en 23 grados centígrados. Después de cada animal, se desinfectaba el campo abierto para desodorizarlo. Antes del estudio de cada grupo, se liberó un animal cero en el campo abierto.
El día 21, las ratas fueron retiradas del experimento. Tras anestesiar a las ratas, se aisló la arteria carótida derecha en una plataforma fija, se expuso el músculo medial del muslo y se cateterizó la vena femoral izquierda. El estudio multicomponente de los parámetros hemodinámicos se investigó mediante el método de pruebas de provocación especializadas que implicaban la administración de acetilcolina y nitroprusiato sódico (NO) en el catéter femoral. Los parámetros (presión arterial sistólica, presión arterial diastólica, frecuencia cardiaca) se registraron mediante un sensor TDS. El sensor se instaló sobre el tercio medio de la arteria femoral derecha y se registraron los siguientes indicadores: velocidad sistólica (VS) y diastólica (VD) máximas, velocidad media (QAs) y volumétrica (QAM) del flujo sanguíneo, índice de pulsación (PL, índice de Gosling) e índice de resistividad (RI, índice de Pourcelot). Para medir la velocidad de las células sanguíneas en los vasos del lecho microcirculatorio, se utilizó una sonda-sensor en forma de aguja, que se colocó en el tercio inferior del músculo ancho medial del muslo. Se inyectaron agentes vasoactivos (acetilcolina - 40 mcg/kg, nitroprusiato sódico - 30 mcg/ kg) a través de un catéter insertado en la vena femoral izquierda secuencialmente a intervalos de 15 minutos. De este modo, existía la posibilidad de monitorizar en paralelo los parámetros hemodinámicos y de microcirculación en un sistema de tres niveles (circulación central - sistema vascular elástico - sistema vascular periférico). El procesamiento estadístico de los resultados se realizó con el programa STATISTICA 10. A continuación se calculó el coeficiente de disfunción endotelial (QED). El análisis estadístico se llevó a cabo mediante la prueba de rangos de Spearman, el cálculo de la fiabilidad entre los grupos se realizó mediante la prueba t paramétrica de Student.
Los diagramas presentados muestran que la influencia de la mefedrona sobre el comportamiento animal corresponde a sus efectos principales, asociados a su mecanismo de acción conocido. Así, el diagrama 1 ilustra un aumento significativo de la actividad motora horizontal en comparación con el grupo de control. El diagrama 2 muestra que los actos de acicalamiento se reducen significativamente. Este fenómeno está causado por una disminución de la influencia motivacional con respecto a la necesidad presente. El diagrama 3 visualiza claramente un aumento de los actos de defecación y micción, que es uno de los efectos frecuentes de la ingesta de 4-mmc. Un aumento de la actividad horizontal puede indicar efectos ansiolíticos, ansiógenos, de agitación o un aumento de la actividad motora sin componente emocional (excitación motora). Las reacciones de acicalamiento también pueden interpretarse de forma ambigua, ya que la frecuencia de los actos de acicalamiento aumenta tanto en un entorno estresante como en uno favorable. Las manifestaciones de actividad exploratoria, así como la frecuencia de micciones y defecaciones, pueden interpretarse de forma más inequívoca. Utilizando este algoritmo, puede concluirse que el efecto farmacodinámico relativo a la mayor actividad nerviosa puede interpretarse como excitación motora con un componente emocional.
El grupo de control demostró el mismo tipo de respuestas a la introducción de ACH y NO, que se manifestaron como un descenso de la presión arterial sistólica, diastólica y media, una disminución de la velocidad lineal de la microcirculación, así como de la velocidad diastólica del movimiento sanguíneo en la arteria femoral (en adelante FA), (indicadores de datos - Vd, Vad); 2) un aumento de la velocidad sistólica del movimiento sanguíneo en FA (VS, Vas), los índices de Purcello y Gosling. Los parámetros volvieron a sus valores originales al cabo de 2 minutos.
Se realizó un tratamiento estadístico adicional al determinar un número de valores a lo largo del tiempo para cada muestra, que se expresaron en porcentaje. El criterio de Spearman, utilizado para el análisis estadístico, mostró la mejor expresión de la diferencia necesaria en los parámetros estadísticamente importantes. El mayor grado de correlación (p<0,05) se determinó entre el índice de presión arterial media (en lo sucesivo, DAM), la velocidad lineal de microcirculación, la velocidad sistólica y la diferencia de velocidad sistólica-diastólica en la arteria femoral. Otros parámetros ecográficos demostraron una correlación baja y menos fiable con la dinámica de la presión arterial y la velocidad de la microcirculación. El estudio de los 4-mmc administrados por vía oral reveló un aumento estadísticamente significativo de los indicadores de TAE, DAD y del coeficiente de disfunción endotelial (QED) en comparación con el grupo de control. Los indicadores de velocidad sistólica máxima (VS) y diastólica máxima (VD) se reducen significativamente durante las pruebas de provocación en las ratas del grupo 3, en las que se administró mefedrona por vía oral.
La eficacia de los factores de relajación dependientes del endotelio liberados y activados por la administración de acetilcolina se reduce cuantitativa y cualitativamente. El efecto mediado por NO en respuesta a la prueba de provocación con ACH disminuye, debido al efecto negativo del 4-mmc sobre la producción y expresión tanto de este factor como de la actividad de la guanilato ciclasa. La relajación dependiente del endotelio de los vasos microcirculatorios inducida por la ACH, mediada a través de receptores muscarínicos, también se ve alterada debido a la degeneración de la actividad del receptor, y también debido a una disminución de la densidad de receptores en la superficie de los endoteliocitos. Es probable que el mecanismo de reducción de la reacción dependiente del endotelio mediada por ACH en respuesta al consumo de mefedrona esté causado por un aumento significativo de la formación de radicales libres (tanto superóxido como hidroxilo) en el estado hipóxico de la célula, que interactúan con NO2 y NO3.
Se produjo una disminución estadísticamente significativa de la actividad metabólica de los neutrófilos en un 38,4% (Me = 13,1 con un rango intercuartílico de 10,3 a 15,9 con una diferencia de 5,3 a p=0,002; z = 3,008) en comparación con los indicadores del grupo de control. En el estudio de la capacidad de absorción de la fagocitosis con la adición de látex, los indicadores aumentaron de 13,1 Me a 16,5 Me, con un aumento porcentual del 18,2% para el Grupo 3 (administración intraperitoneal), sin embargo, la diferencia porcentual en comparación con el grupo control es del 18,0%, lo que constituye una prueba significativa y estadísticamente fiable de la acción inmunosupresora. Asimismo, se observó una disminución estadísticamente significativa de la fagocitosis espontánea en el Grupo 3, que se redujo en un 25,3% (a p>0,0001, z=2,84) en comparación con los animales intactos.
- Cuando se administró mefedrona a los animales de experimentación, se registró un cambio estadísticamente significativo en los actos conductuales analizados. Este hecho indica la presencia de actividad psicotrópica específica de este compuesto asociada con niveles excesivamente elevados de excitación y ansiedad, sin embargo, con una menor resistencia al estrés. Así, los resultados del estudio en esta etapa ampliaron la información sobre el perfil de acción del compuesto. Los efectos psicotrópicos observados del 4-mmc profundizan en la comprensión de su actividad farmacológica y deberían ser objeto de nuevos estudios.
- La persistencia de los parámetros elevados de la presión arterial en los estados iniciales de las ratas del Grupo 3 (mefedrona), así como sus indicadores relativos tras las pruebas de provocación, se deben a una alteración no sólo de la expresión del NO (uno de los principales factores vasodilatadores que regulan el trabajo de los vasos microcirculatorios), sino también de las prostaciclinas y de los factores de hiperpolarización endotelial (EDHF). Los resultados del estudio en esta fase confirmaron la hipótesis teórica sobre el excesivo efecto negativo de la mefedrona tanto sobre el endotelio de los vasos microcirculatorios como sobre la viabilidad del sistema cardiovascular en su conjunto. Los datos obtenidos pueden utilizarse en la planificación de estudios preclínicos para ampliar el espectro de complicaciones asociadas al consumo de 4-mmc, así como para construir un algoritmo de recomendaciones clínicas para la corrección farmacológica de estas complicadas afecciones.
- Teniendo en cuenta que la mefedrona probablemente reduce la permeabilidad a la perfusión de la pared celular y la función de transporte de las proteínas, afecta tanto a la difusión pasiva y facilitada como al transporte activo, afecta a los patrones cognitivos de cierta manera (incluidos los fenómenos retardados) y también tiene la capacidad de influir positivamente en el componente de coagulación de la hemostasia (hipercoagulación), cabe suponer que la actividad de la COX-2 es predominante como enzima principal que desempeña un papel en la inducción de la fase alternativa de la inflamación. Así pues, el uso de inhibidores selectivos de la COX-2 para el tratamiento de enfermedades inflamatorias en pacientes que utilizan 4-mmc es el más preferible y justificado. Sin embargo, para una definición precisa del tratamiento farmacológico dirigido a aliviar los procesos inflamatorios asociados al uso de 4-mmc, son necesarios estudios preclínicos adicionales.
- Los resultados de la tercera fase del estudio demostraron una disminución de la actividad metabólica y de absorción de los neutrófilos en las ratas pertenecientes al grupo 3 (administración intraperitoneal de 4-mmc) en comparación con los indicadores de los animales del grupo de control. Esto define a la mefedrona como una sustancia con efecto inmunosupresor. Esta conclusión es la base para futuros estudios sobre inmunoterapia correctiva patogénica.
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