Eelmise sajandi lõpus inimelu sisse murdnud geenitehnoloogiad on muutnud meie maailma sellisel määral, et see on ilma nendeta juba praegu kujuteldamatu. Need tehnoloogiad on suutnud tungida ka kohtuekspertiisi; aastakümneid on geneetilist identifitseerimist kasutatud kiire ja suhteliselt odava meetodina, mis võimaldab kurjategijate leidmist ja nende tegude lahendamist laborist lahkumata. Farmakoloogina tunnen ma suurt huvi geneetika vastu ja tahan seda valdkonda selle erinevates aspektides uurida. Käesolevas väljaandes tutvustan teile klassikalisi geneetilisi lähenemisviise kohtuekspertiisi valdkonnas.
Natuke ajalugu või mis on sellel pistmist rüütlitega?
150 aastat tagasi avastas Johannes Friedrich Miescher nukleiinhapped, mis lõpuks pööras maailma pea peale [1]. 20. sajandi keskpaigaks sai selgeks, et DNA ja RNA on päriliku teabe kandjad; seejärel kirjeldati nende struktuuri ning veidi hiljem ilmusid arvukad meetodid, mis võimaldasid neid molekule in vitro "lõigata" rakuensüümide - restriktaaside - abil [2]; võimendada neid PCR-i abil [3] ning isegi lugeda konkreetsete geenide ja genoomide järjestust, kasutades mitmeid sekveneerimismeetodeid [4].
Esialgu tehti tööd geneetilise materjaliga sõna otseses mõttes "köögis" ja seda ei saanud alati korrata isegi naaber teaduslikus laboris. Kuid aeg möödus, lähenemisviisid muutusid ja meetodid standardiseeriti sedavõrd, et need võeti järk-järgult kasutusele rakendusuuringutes ja isegi biotehnoloogilises tootmises.
1984. aastal äratas teadusringkonda uudis, et teadlastel õnnestus isoleerida ja lugeda välja surnud ja ainult muuseumikogudes säilinud Burchelli sebraloomade DNA-fragment [5]. Aasta hiljem kinnitas Rootsi geneetik Svante Pääbo, et muuseumide ja arheoloogilise materjali kasutamine teaduslikes alusuuringutes on võimalik, olles esimesena analüüsinud Egiptuse muumiate geneetilist materjali. Aastaid hiljem selgus, et tema analüüsitud proovid olid saastunud kaasaegse geneetilise materjaliga [6], kuid sekveneerimismeetodite areng võimaldas siiski töötada isegi minimaalsete koguste halvasti säilinud DNA-ga.
Ka kohtuekspertiisi teadlased olid huvitatud uutest geneetilise materjali analüüsi tehnikatest. Nimelt olid tollal tavapärased klassikalise daktüloskopeerimise ja veregrupianalüüsi meetodid piiratud ja mõnel juhul läksid nad valesti.
1984. aastal töötas briti teadlane Sir Alec John Jeffreys (joonis 3) välja ja esitas meetodi inimese identifitseerimiseks tema geneetilise materjali abil. Hiljem nimetati seda lähenemisviisi DNA-identifitseerimiseks, mis võitis kogu maailma kriminoloogide armastuse ja austuse. Jeffreys sai oma töö eest rüütliks.
Natuke ajalugu või mis on sellel pistmist rüütlitega?
150 aastat tagasi avastas Johannes Friedrich Miescher nukleiinhapped, mis lõpuks pööras maailma pea peale [1]. 20. sajandi keskpaigaks sai selgeks, et DNA ja RNA on päriliku teabe kandjad; seejärel kirjeldati nende struktuuri ning veidi hiljem ilmusid arvukad meetodid, mis võimaldasid neid molekule in vitro "lõigata" rakuensüümide - restriktaaside - abil [2]; võimendada neid PCR-i abil [3] ning isegi lugeda konkreetsete geenide ja genoomide järjestust, kasutades mitmeid sekveneerimismeetodeid [4].
Esialgu tehti tööd geneetilise materjaliga sõna otseses mõttes "köögis" ja seda ei saanud alati korrata isegi naaber teaduslikus laboris. Kuid aeg möödus, lähenemisviisid muutusid ja meetodid standardiseeriti sedavõrd, et need võeti järk-järgult kasutusele rakendusuuringutes ja isegi biotehnoloogilises tootmises.
1984. aastal äratas teadusringkonda uudis, et teadlastel õnnestus isoleerida ja lugeda välja surnud ja ainult muuseumikogudes säilinud Burchelli sebraloomade DNA-fragment [5]. Aasta hiljem kinnitas Rootsi geneetik Svante Pääbo, et muuseumide ja arheoloogilise materjali kasutamine teaduslikes alusuuringutes on võimalik, olles esimesena analüüsinud Egiptuse muumiate geneetilist materjali. Aastaid hiljem selgus, et tema analüüsitud proovid olid saastunud kaasaegse geneetilise materjaliga [6], kuid sekveneerimismeetodite areng võimaldas siiski töötada isegi minimaalsete koguste halvasti säilinud DNA-ga.
Ka kohtuekspertiisi teadlased olid huvitatud uutest geneetilise materjali analüüsi tehnikatest. Nimelt olid tollal tavapärased klassikalise daktüloskopeerimise ja veregrupianalüüsi meetodid piiratud ja mõnel juhul läksid nad valesti.
1984. aastal töötas briti teadlane Sir Alec John Jeffreys (joonis 3) välja ja esitas meetodi inimese identifitseerimiseks tema geneetilise materjali abil. Hiljem nimetati seda lähenemisviisi DNA-identifitseerimiseks, mis võitis kogu maailma kriminoloogide armastuse ja austuse. Jeffreys sai oma töö eest rüütliks.
DNA-daktüloskopeerimine: eelised ja puudused
Kuriteopaikades saadud bioloogiliste proovide geneetiline analüüs on oluliselt lihtsustanud uurijate tööd. Nüüd on neil olemas usaldusväärne vahend kurjategija või ohvri tuvastamiseks, vaieldamatute tõendite saamiseks ja kuritegude lahendamiseks.
Geneetiliste sõrmejälgede võtmise peamised eelised on võime töötada isegi väikeste koguste bioloogilise materjaliga ja suur täpsus, mis võimaldab isiku tuvastamist - kui kõik analüüsi nõuded on täidetud, ületab selle usaldusväärsus 99%. See lähenemisviis on muutunud üheks olulisemaks kuritegude uurimisel [7].
Oluline on märkida, et klassikalised DNA-daktüloskopeerimismeetodid ei võimalda tuvastada identsed kaksikud, kelle geneetiline profiil on sama, kuna nad on moodustatud samast viljastatud munarakkest.
DNA analüüsiks on vaja eelkõige DnAd ennast, kuid kaugeltki mitte alati on võimalik kvaliteetset geneetilist materjali eraldada bioloogilistest proovidest, mis on kokku puutunud keemiliste ja termiliste teguritega. Keskkonda sattudes satub see molekul keemilistesse reaktsioonidesse, hävitatakse (fragmenteeritakse) ja muudetakse, kuigi soodsates tingimustes võib see säilida tuhandeid aastaid [8].
On teada, et kõige vanem geneetiline materjal inimese esivanematest on saadud meie humanoidsete sugulaste luujäänustest, kes elasid Pürenee poolsaare (Sierra de Atapuerca) territooriumil umbes 430 tuhat aastat tagasi [9]. Mõnede koobaste spetsiifiline mikrokliima madala niiskuse ja temperatuuri väärtustega suurendab oluliselt geneetilise materjali eluiga. Kuriteopaigalt leitud proovides on DNA aga sageli esindatud minimaalses koguses ja sarnaselt arheoloogilistele proovidele on see tugevalt lagunenud.
Euroopas ja Ameerika Ühendriikides juhitakse tähelepanu geneetiliste sõrmejälgede võtmise teisele puudusele, mis on seotud sekkumisega isiku eraelu puutumatusse ja eraelu puutumatuse rikkumisega.
Inimõiguste kaitsjad kardavad, et kurjategijate ja kuriteos kahtlustatavate geneetiline teave võib sattuda kolmandate isikute kätte ja seejärel väärkasutada [10]. Näiteks on juba teada juhtumeid geneetilise teabe kasutamisest moslemivähemuste kontrollimiseks Hiina Xinjiangi provintsis.
Ka USA kavatseb süstemaatiliselt koguda föderaalselt kinnipeetavate sisserändajate DNA-profiile [11]. Ilmselgelt ei ole inimõiguste aktivistide hirmud alusetud ja neil on reaalne alus.
Geneetiliste sõrmejälgede võtmise peamised eelised on võime töötada isegi väikeste koguste bioloogilise materjaliga ja suur täpsus, mis võimaldab isiku tuvastamist - kui kõik analüüsi nõuded on täidetud, ületab selle usaldusväärsus 99%. See lähenemisviis on muutunud üheks olulisemaks kuritegude uurimisel [7].
Oluline on märkida, et klassikalised DNA-daktüloskopeerimismeetodid ei võimalda tuvastada identsed kaksikud, kelle geneetiline profiil on sama, kuna nad on moodustatud samast viljastatud munarakkest.
DNA analüüsiks on vaja eelkõige DnAd ennast, kuid kaugeltki mitte alati on võimalik kvaliteetset geneetilist materjali eraldada bioloogilistest proovidest, mis on kokku puutunud keemiliste ja termiliste teguritega. Keskkonda sattudes satub see molekul keemilistesse reaktsioonidesse, hävitatakse (fragmenteeritakse) ja muudetakse, kuigi soodsates tingimustes võib see säilida tuhandeid aastaid [8].
On teada, et kõige vanem geneetiline materjal inimese esivanematest on saadud meie humanoidsete sugulaste luujäänustest, kes elasid Pürenee poolsaare (Sierra de Atapuerca) territooriumil umbes 430 tuhat aastat tagasi [9]. Mõnede koobaste spetsiifiline mikrokliima madala niiskuse ja temperatuuri väärtustega suurendab oluliselt geneetilise materjali eluiga. Kuriteopaigalt leitud proovides on DNA aga sageli esindatud minimaalses koguses ja sarnaselt arheoloogilistele proovidele on see tugevalt lagunenud.
Euroopas ja Ameerika Ühendriikides juhitakse tähelepanu geneetiliste sõrmejälgede võtmise teisele puudusele, mis on seotud sekkumisega isiku eraelu puutumatusse ja eraelu puutumatuse rikkumisega.
Inimõiguste kaitsjad kardavad, et kurjategijate ja kuriteos kahtlustatavate geneetiline teave võib sattuda kolmandate isikute kätte ja seejärel väärkasutada [10]. Näiteks on juba teada juhtumeid geneetilise teabe kasutamisest moslemivähemuste kontrollimiseks Hiina Xinjiangi provintsis.
Ka USA kavatseb süstemaatiliselt koguda föderaalselt kinnipeetavate sisserändajate DNA-profiile [11]. Ilmselgelt ei ole inimõiguste aktivistide hirmud alusetud ja neil on reaalne alus.
Kuidas see toimib
DNA-daktüloskopeerimise meetodid põhinevad inimese geneetilisel varieeruvusel. Nukleotiidide asendused DNAs (sõltuvalt sagedusest populatsioonis nimetatakse neid ka DNA polümorfismideks või mutatsioonideks) muudavad meid individuaalselt erinevaks. Ja neid erinevusi võib leida nii tuuma- kui ka mitokondriogeneemides, väikestes ringikujulistes DNA-molekulides, mis reguleerivad mitokondrite, rakkude energia-"tehaste" toimimist.
.
Tuleb märkida, et DNA polümorfisme võib leida igaühe genoomist - need muutuvad meie unikaalseks DNA vöötkoodiks. Mõned neist võivad põhjustada tõsiseid haigusi [12], kuid enamasti ei mõjuta need meie elutähtsaid funktsioone.
Kaasaegsed DNA-daktüloskopeerimismeetodid kasutavad erinevaid geneetilisi variante genoomi eri piirkondades. Näiteks tandemkorduste - lühikeste korduvate genoomijärjestuste, mille arv erineb kahel juhuslikult valitud isikul [13] -analüüs võimaldab teha selget isaduse testi või leida lisatõendeid kuriteos kahtlustatava vastu.
Y-kromosomaalse DNA markerite abil saab määrata inimese sugu. Geneetilised markerid annavad teavet inimese sugulaste etnilise kuuluvuse, silmade või juuste värvi kohta.
Lisaks võimaldab epigeneetiline teave (nt DNA metülatsioon) hinnata üksikute rakkude, kudede ja organismi kui terviku bioloogilist vanust [14]. Käesolevas artiklis räägin lähemalt eespool nimetatud geneetilise analüüsi meetoditest. Ja epigeneetiliste meetodite kasutamine ravimitööstuses on minu järgmise väljaande teema.
Y-kromosomaalse DNA markerite abil saab määrata inimese sugu. Geneetilised markerid annavad teavet inimese sugulaste etnilise kuuluvuse, silmade või juuste värvi kohta.
Lisaks võimaldab epigeneetiline teave (nt DNA metülatsioon) hinnata üksikute rakkude, kudede ja organismi kui terviku bioloogilist vanust [14]. Käesolevas artiklis räägin lähemalt eespool nimetatud geneetilise analüüsi meetoditest. Ja epigeneetiliste meetodite kasutamine ravimitööstuses on minu järgmise väljaande teema.
DNA kogumine ja isoleerimine bioloogilisest materjalist
DNA ekstraheerimine ja analüüs kohtuekspertiisi proovidest on esmapilgul võrreldav kunstiga. Mõnikord on võimatu ette kujutada, et paar tilka verd või nahatükk ohvri küünte all võib muutuda kriminaaluurimise kõige olulisemaks tõendiks.
Tegelikult on kuriteopaiga kohtuekspertiisi spetsialistide tegevus peenhäälestatud ja järgib ühte stsenaariumi, mille üks peamisi eesmärke on DNA ekstraheerimiseks sobiva bioloogilise materjali leidmine. Selleks võib kasutada mis tahes bioloogilisi kudesid ja inimese eritisi .
- Luujäänused
- Hambad
- Juuksefolliikuleid
- Veri
- Epiteelirakud
- Higi
- Sülg
- Spermaproovid
- Väljaheited jne.
Biomaterjal võib tõendusmaterjali laos olla aastakümneid. Sageli võtab uurija uurimiseks ainult osa materjalist, nii palju, kui ta vajab DNA ekstraheerimiseks. Näiteks kui noal on vere jälgi, ei pese ekspert kogu verd maha, vaid teeb väikese loputuse vahetult enne DNA ekstraheerimist. See jätab noale jäljed, mida saab kasutada aastakümneid hiljem uuesti läbivaatuse tegemiseks.
.
Raku tuumas on DNA tihedas kontaktis paljude orgaaniliste molekulidega, mis on vajalikud selle tõhusaks toimimiseks. Geneetilise analüüsi jaoks tuleb aga uuritavast proovist eemaldada süsivesikud, lipiidid ja valgud, mis võivad vähendada kasutatavate meetodite tõhusust ja sellest tulenevalt mõjutada kuritegude lahustuvust.DNA ekstraheerimine võtab vähe aega tänu mitmesugustele kaubanduslikele komplektidele ja süsteemidele, mis on spetsiaalselt nukleiinhappe ekstraheerimiseks mõeldud (nt Thermo Fisher Scientific'i AutoMate Express DNA Extraction System). Lisaks sellele on suurtes kohtuekspertiisikeskustes, kus tehakse tuhandeid analüüse päevas, see protsess täielikult automatiseeritud ja toimub robotite osalusel operaatori järelevalve all.
Muide, robotisüsteeme kasutatakse laialdaselt mitte ainult kohtuekspertiisilaborites, vaid ka paljudes meditsiini- ja biotehnoloogiakeskustes, mis võimaldab protsessi kiirendada, vähendada töö maksumust ja oluliselt vähendada vigade võimalust.
Pärast ekstraheerimist lahustatakse DNA spetsiaalses ühendis, kus seda saab vajadusel aastaid säilitada (-20 °C või -80 °C juures).
Geneetiline analüüs
Kohe pärast DnA ekstraheerimist seisab spetsialist küsimuse ees, kuidas seda edasi analüüsida. Alates DNA identifitseerimise kasutuselevõtust kohtuekspertiisis on molekulaarbioloogilised meetodid muutunud nii palju, et võimalikke variante on mitu. Meie edasine lugu toob välja erinevad DNA-analüüsi tehnikad, mida kohtueksperdid oma praktikas kasutavad.
Restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfism (RFLP-analüüs)
RFLP-analüüs on ajalooliselt üks esimesi meetodeid DNA identifitseerimiseks. See põhineb spetsiaalsete rakuensüümide, restriktaaside kasutamisel. Restriktsiooniensüümid suudavad ära tunda teatud kohad nukleiinhappe molekulis ja lõigata seda läbi nende kohtade. Praeguseks on kirjeldatud mitu tuhat sellist ensüümi. Pärast DnA-molekuli lõikamist restriktsiooniensüümidega hinnatakse saadud fragmentide pikkust geelelektroforeesi abil (joonis 9).
Kohe pärast DnA ekstraheerimist seisab spetsialist küsimuse ees, kuidas seda edasi analüüsida. Alates DNA identifitseerimise kasutuselevõtust kohtuekspertiisis on molekulaarbioloogilised meetodid muutunud nii palju, et võimalikke variante on mitu. Meie edasine lugu toob välja erinevad DNA-analüüsi tehnikad, mida kohtueksperdid oma praktikas kasutavad.
Restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfism (RFLP-analüüs)
RFLP-analüüs on ajalooliselt üks esimesi meetodeid DNA identifitseerimiseks. See põhineb spetsiaalsete rakuensüümide, restriktaaside kasutamisel. Restriktsiooniensüümid suudavad ära tunda teatud kohad nukleiinhappe molekulis ja lõigata seda läbi nende kohtade. Praeguseks on kirjeldatud mitu tuhat sellist ensüümi. Pärast DnA-molekuli lõikamist restriktsiooniensüümidega hinnatakse saadud fragmentide pikkust geelelektroforeesi abil (joonis 9).
Kuna täielikult identset inimgenoomi ei ole (välja arvatud identsed kaksikud), võib saadud DNA-fragmentide pikkuse profiilide erinevus või sarnasus olla hea marker nii isiku tuvastamiseks kui ka suguluse määramiseks.
See meetod hõlmab siiski DNA fragmenteerimist ja on seetõttu tundlik algse geneetilise materjali kvaliteedi ja kvantiteedi suhtes. Seepärast ei kasutata RFLP-analüüsi praegu praktiliselt - erinevalt teistest meetoditest, mida käsitletakse allpool.
Tandemkorduste arvu analüüs genoomis
Tandemkordused on sama lühikese DnA järjestuse koopiad, mis korduvad üksteise järel [15]. Kohtuekspertiisi jaoks huvipakkuvate korduste hulka kuuluvad erineva arvu tandemkorduste (VNTR) ja lühikeste tandemkorduste (STR) lokatsioonid. Neid nimetatakse ka vastavalt minisatelliitideks ja mikrosatelliitideks.
Selle meetodi sisuks on neid lühikesi korduvaid järjestusi sisaldavate DNA-fragmentide PCR-amplitseerimine, mille pikkus on kahel juhuslikult valitud isendil erinev. Pärast amplifikatsiooni hinnatakse saadud fragmentide pikkust geelelektroforeesi või kapillaarelektroforeesi abil.
Selleks võib kasutada Termo Fisher Scientific'i Quantifiler DNA Quantification Kit'i ja QuantStudio süsteemi. QuantStudio on kompaktne ja paljude funktsioonidega töölaua seade.
Nagu ka eelmise meetodi puhul, on STR-analüüsi peamine identifitseerimistegur saadud fragmentide pikkus, mis on iga indiviidi puhul unikaalne ja sõltub korduste arvust analüüsitavas kohas. STR-analüüsi iseloomustab suur täpsus ja kiirus, samuti madal hind. Geneetilise materjali kvaliteet on analüüsi oluline tingimus.
See meetod hõlmab siiski DNA fragmenteerimist ja on seetõttu tundlik algse geneetilise materjali kvaliteedi ja kvantiteedi suhtes. Seepärast ei kasutata RFLP-analüüsi praegu praktiliselt - erinevalt teistest meetoditest, mida käsitletakse allpool.
Tandemkorduste arvu analüüs genoomis
Tandemkordused on sama lühikese DnA järjestuse koopiad, mis korduvad üksteise järel [15]. Kohtuekspertiisi jaoks huvipakkuvate korduste hulka kuuluvad erineva arvu tandemkorduste (VNTR) ja lühikeste tandemkorduste (STR) lokatsioonid. Neid nimetatakse ka vastavalt minisatelliitideks ja mikrosatelliitideks.
Selle meetodi sisuks on neid lühikesi korduvaid järjestusi sisaldavate DNA-fragmentide PCR-amplitseerimine, mille pikkus on kahel juhuslikult valitud isendil erinev. Pärast amplifikatsiooni hinnatakse saadud fragmentide pikkust geelelektroforeesi või kapillaarelektroforeesi abil.
Selleks võib kasutada Termo Fisher Scientific'i Quantifiler DNA Quantification Kit'i ja QuantStudio süsteemi. QuantStudio on kompaktne ja paljude funktsioonidega töölaua seade.
Nagu ka eelmise meetodi puhul, on STR-analüüsi peamine identifitseerimistegur saadud fragmentide pikkus, mis on iga indiviidi puhul unikaalne ja sõltub korduste arvust analüüsitavas kohas. STR-analüüsi iseloomustab suur täpsus ja kiirus, samuti madal hind. Geneetilise materjali kvaliteet on analüüsi oluline tingimus.
STR-analüüs ilmus praktilises kohtuekspertiisis peaaegu kakskümmend aastat tagasi, kuid on tänaseni peamine meetod isikute tuvastamiseks. Kahtlustatavate ja kurjategijate DNA-analüüsi tulemused - geneetilised profiilid - sisestavad kriminalistid spetsiaalsetesse andmebaasidesse.
Seega, kui kuriteopaikades leitakse bioloogilisi jälgi, millest on võimalik eraldada DNA-d, on võimalik tuvastada kõik inimesed, kes on juba sattunud õiguskaitseorganite tähelepanu alla. Samu markereid kasutatakse kadunud isikute otsimiseks ja isaduse tuvastamiseks.
Seega, kui kuriteopaikades leitakse bioloogilisi jälgi, millest on võimalik eraldada DNA-d, on võimalik tuvastada kõik inimesed, kes on juba sattunud õiguskaitseorganite tähelepanu alla. Samu markereid kasutatakse kadunud isikute otsimiseks ja isaduse tuvastamiseks.
Reeglina võimaldavad indiviidide identifitseerimiseks mõeldud süsteemid analüüsida korraga mitut genoomilokki (10-24), sealhulgas amelogeniini valgu geeni, mille alusel määratakse sugu. Amelogeniini geen leidub nii X- kui ka Y-kromosoomil, kuid erineb suuruse poolest, mis võimaldab määrata inimese sugu.
Tänu suure läbilaskevõimega sekveneerimistehnoloogiate kasutamisele on kohtuekspertiis saanud tõhusa vahendi, mis on avanud uued võimalused tuuma- ja mitokondriaalse genoomi mitme koha (lokkide) samaaegseks analüüsiks.
Nende meetodite oluline eelis on võime eristada isegi identsed kaksikud (somaatiliste mutatsioonide järgi), mis on RFLP- või STR-analüüsi puhul võimatu.
Tänu suure läbilaskevõimega sekveneerimistehnoloogiate kasutamisele on kohtuekspertiis saanud tõhusa vahendi, mis on avanud uued võimalused tuuma- ja mitokondriaalse genoomi mitme koha (lokkide) samaaegseks analüüsiks.
Nende meetodite oluline eelis on võime eristada isegi identsed kaksikud (somaatiliste mutatsioonide järgi), mis on RFLP- või STR-analüüsi puhul võimatu.
Käesoleva väljaande teises osas kirjeldatakse, kuidas eespool kirjeldatud meetodeid saab kasutada narkolaborite ja narkodiilerite tuvastamiseks ning kuidas saab jälgi puhastades kohtuekspertiisi segadusse ajada.
Lugege II OSA
