Bevezetés
Az L-fenilacetilkarbinol az efedrin szintézisében használt vegyület, amelyet maga is az amfetaminok prekurzoraként használnak. Ipari szinten a benzaldehid aerob erjesztésével szintetizálják pékélesztő (S. cerevisiae/SC) által. Bár a folyamat meglehetősen egyszerű, igényel némi felszerelést és tudást, különösen, ha a steril kultúrák fenntartásáról és a megfelelő növekedési feltételekről van szó. Ezért két különböző bonyolultságú módszert fogok ismertetni az L-PAC biotranszformációval történő előállítására. A táptalajt felhasználás előtt autoklávozással sterilizálni kell.
Első módszer:
Ezt a technikát "hanyag, de könnyű" technikának lehetne nevezni. Kevesebb felszerelést igényel, egyszerűbb, de kevésbé hatékony is, és alacsonyabb hozamot eredményez.
Eljárás:
500 ml steril 0,1 M pH 6-os citrátpufferben adjunk hozzá 44 g élesztőt és 55 g glükózt. Tegyük 30 °C-ra melegített vízfürdőbe. Inkubáljuk 40/50 percig.
Adjunk hozzá benzaldehidet (25 mmol) 5 ml etanolban és acetaldehidet (25 mmol). Inkubáljuk 60 percig.
Szűrjük át Celite-on.
Extraktáljuk 3*100 ml etil-acetáttal. Törjük meg az emulziót telített nátrium-klorid-oldattal, szárítsuk vízmentes nátrium-szulfáton, szűrjük, pároljuk el az oldószert. Ez az L-PAC.
Magyarázatok:
Citrát puffer: ezt a stabil pH fenntartására használjuk, mivel a sejt növekedése idővel csökkenti azt (nem jó). Ennek a puffernek az elkészítéséhez kövesse az ebben a számológépben megadott eljárásokat: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Ne felejtse el a pH-t 6-ra változtatni.
Hőmérséklet: lehetővé teszi az élesztő nagyobb anyagcsere-aktivitását.
Etanol: a benzaldehid és az acetaldehid feloldására szolgál, és növeli a biohasznosulást.
Acetaldehid: hidrogénakceptorként használják a benzaldehid helyett, így korlátozva a benzil-alkohol termelését.
Ez egy egyszerű eljárás, amelyet a standard steril technikákról való némi olvasás után szinte bárki követhet, de alacsonyabb hozamot ad, mint a másik (20-40% között). Javítható vagy jobb levegőztetéssel, vagy 150 fordulat/perc fordulatszámon történő orbitális rázással, vagy steril levegő pumpálásával a közegbe, percenként 1 liter levegővel literenként, vagy a sejtek alginátgyöngyökbe történő immobilizálásával. Ezt megnézheted a youtube-on, nagyon könnyű megcsinálni, és jelentősen növelheti a hozamot.
Második módszer:
Ez a protokoll fejlettebb, de helyesen végrehajtva akár 60-70%-kal is növelheti a hozamot. Ehhez azonban több anyagra lesz szükség. Bár nem tökéletes, de sokkal jobb.
Ezt a módszert a S. cerevisiae helyett a Candida utilis élesztőgombára tervezték. Használhatja helyette az SC-t, de a hozam csökkenését fogja tapasztalni. C. utilis itt vásárolható meg: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Eljárás:
A táptalaj 10g/L karbamidból (nitrogént hoz), 10g/L MgSO4-ból (magnéziumot és ként hoz) és 50-70g/L cukorból áll, melasz felhasználásával. Oldjuk fel megfelelő mennyiségű 0,1M pH 6-os citrátpufferben.
Előző nap oltsuk be az élesztő kiindulási kultúráját, és inkubáljuk 30°C-on egy éjszakán át.
Olvassuk le az optikai sűrűséget (abszorbancia) 595 nm-en. Beoltjuk a fermentációs reaktort a 0,4 OD értékre beállított kiindulási kultúránk 15%-os v/v mennyiségével. Példa: egy 1 literes tartály beoltásához, ha az OD-t 0,2-nél mértük, adjunk 300ml-t 700ml-hez. Ha az OD már 0,4, adjunk 150mL-t 850mL-hez stb... (240x106 sejt/ml az oltóanyagban, lásd a magyarázatot).
Inkubáljuk 30°C-on, vagy 150 rpm-es orbitális rázással, vagy 1 v/v/perc sebességgel steril levegőt pumpálva. Ha levegőt pumpálunk, akkor érdemes egy kis lassú keverést is beiktatni.
Inkubáljuk, amíg az OD el nem éri a 0,3 és 0,4 közötti értéket. Ennek 4-6 óráig kell tartania, lehet kevesebb vagy több is. Ellenőrizze az OD-t 30 percenként, amíg el nem éri a kívánt értéket.
A benzaldehid hozzáadása több adagban történik. Egy 50ml esetében a térfogatok 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Ugyanekkor adjon hozzá egy ekvivalens mennyiségű acetaldehidet. Várjon egy órát az egyes adagolások között.
Extraktáljuk 1:2 toluol/közepes v/v arányban, pároljuk be.
Magyarázat:
Optikai sűrűség: spektrofotométerrel mérjük. Itt az 595 nm-nél mért abszorbanciát olvassuk le, amely arányos az oldatban lévő sejtek számával. Ökölszabályként ne feledjük, hogy 0,1 OD=60x10^6 sejt/ml.
Általános megjegyzések:
A levegőztetéshez kis léptékben jobb a 150 rpm-es orbitális rázás. Nagyobb léptékben buborékos levegőre lesz szükség, amelyet szűrőn keresztül vezetünk.
A második protokollban a benzaldehid hozzáadása több dózisban történik a hozam növelése érdekében. Ez tovább javítható a benzaldehid folyamatos, csökkenő ütemben történő befecskendezésével, de ez amatőr környezetben bonyolult.
Helyettesített benzaldehidek is használhatók, és a megfelelő L-PAC analógot fogják eredményezni.
Végül a 2. módszer néhány elemét kölcsönveheti és beépítheti az 1. módszerbe, hogy a kísérleti tervet saját ízlése szerint alakítsa. Ne feledje, hogy más törzsek és fajok is felhasználhatók, jelentősen növelve a hozamokat. További információért lásd: "L-fenil-acetil-karbinol (L-PAC) előállítása különböző új élesztőtörzsekkel melaszban és cukornádlében, mint termelési közegben" (Ravi et al.).
Az L-fenilacetilkarbinol az efedrin szintézisében használt vegyület, amelyet maga is az amfetaminok prekurzoraként használnak. Ipari szinten a benzaldehid aerob erjesztésével szintetizálják pékélesztő (S. cerevisiae/SC) által. Bár a folyamat meglehetősen egyszerű, igényel némi felszerelést és tudást, különösen, ha a steril kultúrák fenntartásáról és a megfelelő növekedési feltételekről van szó. Ezért két különböző bonyolultságú módszert fogok ismertetni az L-PAC biotranszformációval történő előállítására. A táptalajt felhasználás előtt autoklávozással sterilizálni kell.
Első módszer:
Ezt a technikát "hanyag, de könnyű" technikának lehetne nevezni. Kevesebb felszerelést igényel, egyszerűbb, de kevésbé hatékony is, és alacsonyabb hozamot eredményez.
Eljárás:
500 ml steril 0,1 M pH 6-os citrátpufferben adjunk hozzá 44 g élesztőt és 55 g glükózt. Tegyük 30 °C-ra melegített vízfürdőbe. Inkubáljuk 40/50 percig.
Adjunk hozzá benzaldehidet (25 mmol) 5 ml etanolban és acetaldehidet (25 mmol). Inkubáljuk 60 percig.
Szűrjük át Celite-on.
Extraktáljuk 3*100 ml etil-acetáttal. Törjük meg az emulziót telített nátrium-klorid-oldattal, szárítsuk vízmentes nátrium-szulfáton, szűrjük, pároljuk el az oldószert. Ez az L-PAC.
Magyarázatok:
Citrát puffer: ezt a stabil pH fenntartására használjuk, mivel a sejt növekedése idővel csökkenti azt (nem jó). Ennek a puffernek az elkészítéséhez kövesse az ebben a számológépben megadott eljárásokat: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Ne felejtse el a pH-t 6-ra változtatni.
Hőmérséklet: lehetővé teszi az élesztő nagyobb anyagcsere-aktivitását.
Etanol: a benzaldehid és az acetaldehid feloldására szolgál, és növeli a biohasznosulást.
Acetaldehid: hidrogénakceptorként használják a benzaldehid helyett, így korlátozva a benzil-alkohol termelését.
Ez egy egyszerű eljárás, amelyet a standard steril technikákról való némi olvasás után szinte bárki követhet, de alacsonyabb hozamot ad, mint a másik (20-40% között). Javítható vagy jobb levegőztetéssel, vagy 150 fordulat/perc fordulatszámon történő orbitális rázással, vagy steril levegő pumpálásával a közegbe, percenként 1 liter levegővel literenként, vagy a sejtek alginátgyöngyökbe történő immobilizálásával. Ezt megnézheted a youtube-on, nagyon könnyű megcsinálni, és jelentősen növelheti a hozamot.
Második módszer:
Ez a protokoll fejlettebb, de helyesen végrehajtva akár 60-70%-kal is növelheti a hozamot. Ehhez azonban több anyagra lesz szükség. Bár nem tökéletes, de sokkal jobb.
Ezt a módszert a S. cerevisiae helyett a Candida utilis élesztőgombára tervezték. Használhatja helyette az SC-t, de a hozam csökkenését fogja tapasztalni. C. utilis itt vásárolható meg: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Eljárás:
A táptalaj 10g/L karbamidból (nitrogént hoz), 10g/L MgSO4-ból (magnéziumot és ként hoz) és 50-70g/L cukorból áll, melasz felhasználásával. Oldjuk fel megfelelő mennyiségű 0,1M pH 6-os citrátpufferben.
Előző nap oltsuk be az élesztő kiindulási kultúráját, és inkubáljuk 30°C-on egy éjszakán át.
Olvassuk le az optikai sűrűséget (abszorbancia) 595 nm-en. Beoltjuk a fermentációs reaktort a 0,4 OD értékre beállított kiindulási kultúránk 15%-os v/v mennyiségével. Példa: egy 1 literes tartály beoltásához, ha az OD-t 0,2-nél mértük, adjunk 300ml-t 700ml-hez. Ha az OD már 0,4, adjunk 150mL-t 850mL-hez stb... (240x106 sejt/ml az oltóanyagban, lásd a magyarázatot).
Inkubáljuk 30°C-on, vagy 150 rpm-es orbitális rázással, vagy 1 v/v/perc sebességgel steril levegőt pumpálva. Ha levegőt pumpálunk, akkor érdemes egy kis lassú keverést is beiktatni.
Inkubáljuk, amíg az OD el nem éri a 0,3 és 0,4 közötti értéket. Ennek 4-6 óráig kell tartania, lehet kevesebb vagy több is. Ellenőrizze az OD-t 30 percenként, amíg el nem éri a kívánt értéket.
A benzaldehid hozzáadása több adagban történik. Egy 50ml esetében a térfogatok 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Ugyanekkor adjon hozzá egy ekvivalens mennyiségű acetaldehidet. Várjon egy órát az egyes adagolások között.
Extraktáljuk 1:2 toluol/közepes v/v arányban, pároljuk be.
Magyarázat:
Optikai sűrűség: spektrofotométerrel mérjük. Itt az 595 nm-nél mért abszorbanciát olvassuk le, amely arányos az oldatban lévő sejtek számával. Ökölszabályként ne feledjük, hogy 0,1 OD=60x10^6 sejt/ml.
Általános megjegyzések:
A levegőztetéshez kis léptékben jobb a 150 rpm-es orbitális rázás. Nagyobb léptékben buborékos levegőre lesz szükség, amelyet szűrőn keresztül vezetünk.
A második protokollban a benzaldehid hozzáadása több dózisban történik a hozam növelése érdekében. Ez tovább javítható a benzaldehid folyamatos, csökkenő ütemben történő befecskendezésével, de ez amatőr környezetben bonyolult.
Helyettesített benzaldehidek is használhatók, és a megfelelő L-PAC analógot fogják eredményezni.
Végül a 2. módszer néhány elemét kölcsönveheti és beépítheti az 1. módszerbe, hogy a kísérleti tervet saját ízlése szerint alakítsa. Ne feledje, hogy más törzsek és fajok is felhasználhatók, jelentősen növelve a hozamokat. További információért lásd: "L-fenil-acetil-karbinol (L-PAC) előállítása különböző új élesztőtörzsekkel melaszban és cukornádlében, mint termelési közegben" (Ravi et al.).
