A múlt század végén az emberi életbe berobbant géntechnológiák olyan mértékben megváltoztatták világunkat, hogy az már elképzelhetetlen nélkülük. Ezeknek a technológiáknak sikerült behatolniuk a kriminalisztikába is; a genetikai azonosítás évtizedek óta gyors és viszonylag olcsó módszer, amely lehetővé teszi a bűnözők felkutatását és tetteik felderítését anélkül, hogy elhagynák a laboratóriumot. Gyógyszerész végzettségűként nagyon érdekel a genetika, és szívesen tanulmányozom ezt a területet a különböző aspektusaiban. Ebben a kiadványban bemutatom a klasszikus genetikai megközelítéseket a kriminalisztika területén.
Egy kis történelem, avagy mi köze van a lovagokhoz?
150 évvel ezelőtt Johannes Friedrich Miescher fedezte fel a nukleinsavakat, egy olyan fogalmat, amely végül a feje tetejére állította a világot [1]. A 20. század közepére világossá vált, hogy a DNS és az RNS az örökletes információk hordozói; majd leírták szerkezetüket, és nem sokkal később számos olyan módszer jelent meg, amelyek lehetővé tették, hogy ezeket a molekulákat in vitro "felvágják" sejtes enzimek - restriktazok - segítségével [2]; PCR segítségével felerősítsék őket [3]; sőt, többféle szekvenálási módszerrel kiolvassák egyes gének és genomok szekvenciáját [4].
Kezdetben a genetikai anyaggal végzett munka szó szerint "a konyhában" zajlott, és nem mindig volt reprodukálható még a szomszédos tudományos laboratóriumban sem. De telt az idő, változtak a megközelítések, és a módszerek olyannyira standardizálódtak, hogy fokozatosan bekerültek az alkalmazott kutatásba, sőt a biotechnológiai termelésbe is.
1984-ben a tudományos közösséget az a hír kavarta fel, hogy a tudósoknak sikerült izolálniuk és leolvasniuk a kihalt és csak múzeumi gyűjteményekben fennmaradt Burchell-zebra DNS-töredékét [5]. Egy évvel később Svante Pääbo svéd genetikus megerősítette, hogy múzeumi és régészeti anyagokat is fel lehet használni az alapvető tudományos kutatásokban, miután először egyiptomi múmiák genetikai anyagát elemezte. Évekkel később kiderült, hogy az általa elemzett minták modern genetikai anyaggal szennyezettek [6], de a szekvenálási módszerek fejlődése mégis lehetővé tette, hogy akár minimális mennyiségű, rosszul megőrződött DNS-sel is dolgozzanak.
A törvényszéki orvosszakértők is érdeklődtek a genetikai anyag elemzésének új technikái iránt. Tény, hogy az akkoriban megszokott klasszikus daktiloszkópia és vércsoportelemzés módszereinek megvoltak a korlátai, és bizonyos esetekben félresikerültek.
1984-ben Sir Alec John Jeffreys brit tudós (3. ábra) kifejlesztett és bemutatott egy olyan módszert, amellyel egy személyt genetikai anyagának felhasználásával lehetett azonosítani. Később ezt a megközelítést DNS-azonosításnak nevezték el, és világszerte elnyerte a kriminológusok szeretetét és tiszteletét. Jeffreys-t munkájáért lovaggá ütötték.
Egy kis történelem, avagy mi köze van a lovagokhoz?
150 évvel ezelőtt Johannes Friedrich Miescher fedezte fel a nukleinsavakat, egy olyan fogalmat, amely végül a feje tetejére állította a világot [1]. A 20. század közepére világossá vált, hogy a DNS és az RNS az örökletes információk hordozói; majd leírták szerkezetüket, és nem sokkal később számos olyan módszer jelent meg, amelyek lehetővé tették, hogy ezeket a molekulákat in vitro "felvágják" sejtes enzimek - restriktazok - segítségével [2]; PCR segítségével felerősítsék őket [3]; sőt, többféle szekvenálási módszerrel kiolvassák egyes gének és genomok szekvenciáját [4].
Kezdetben a genetikai anyaggal végzett munka szó szerint "a konyhában" zajlott, és nem mindig volt reprodukálható még a szomszédos tudományos laboratóriumban sem. De telt az idő, változtak a megközelítések, és a módszerek olyannyira standardizálódtak, hogy fokozatosan bekerültek az alkalmazott kutatásba, sőt a biotechnológiai termelésbe is.
1984-ben a tudományos közösséget az a hír kavarta fel, hogy a tudósoknak sikerült izolálniuk és leolvasniuk a kihalt és csak múzeumi gyűjteményekben fennmaradt Burchell-zebra DNS-töredékét [5]. Egy évvel később Svante Pääbo svéd genetikus megerősítette, hogy múzeumi és régészeti anyagokat is fel lehet használni az alapvető tudományos kutatásokban, miután először egyiptomi múmiák genetikai anyagát elemezte. Évekkel később kiderült, hogy az általa elemzett minták modern genetikai anyaggal szennyezettek [6], de a szekvenálási módszerek fejlődése mégis lehetővé tette, hogy akár minimális mennyiségű, rosszul megőrződött DNS-sel is dolgozzanak.
A törvényszéki orvosszakértők is érdeklődtek a genetikai anyag elemzésének új technikái iránt. Tény, hogy az akkoriban megszokott klasszikus daktiloszkópia és vércsoportelemzés módszereinek megvoltak a korlátai, és bizonyos esetekben félresikerültek.
1984-ben Sir Alec John Jeffreys brit tudós (3. ábra) kifejlesztett és bemutatott egy olyan módszert, amellyel egy személyt genetikai anyagának felhasználásával lehetett azonosítani. Később ezt a megközelítést DNS-azonosításnak nevezték el, és világszerte elnyerte a kriminológusok szeretetét és tiszteletét. Jeffreys-t munkájáért lovaggá ütötték.
DNS-daktiloszkópia: előnyök és hátrányok
A bűncselekmények helyszínén nyert biológiai minták genetikai elemzése nagyban megkönnyítette a nyomozók munkáját. Ma már megbízható eszköz áll rendelkezésükre az elkövető vagy az áldozat azonosításához, a megdönthetetlen bizonyítékok megszerzéséhez és a bűncselekmények felderítéséhez.
A genetikai ujjlenyomatvétel fő előnyei közé tartozik, hogy kis mennyiségű biológiai anyaggal is képes dolgozni, valamint a nagy pontosság, amely lehetővé teszi az egyén azonosítását - ha az elemzés minden követelménye teljesül, megbízhatósága meghaladja a 99%-ot. Ez a megközelítés az egyik legfontosabbá vált a bűncselekmények felderítésében [7].
Fontos megjegyezni, hogy a klasszikus DNS-daktiloszkópiai módszerek nem teszik lehetővé az egypetéjű ikrek azonosítását, akiknek genetikai profilja azonos, mivel ugyanabból a megtermékenyített petesejtből keletkeznek.
A DNS-elemzéshez mindenekelőtt magára a DnA-ra van szükség, de a kémiai és termikus tényezőknek kitett biológiai mintákból korántsem mindig lehet jó minőségű genetikai anyagot kinyerni. A környezetbe kerülve ez a molekula kémiai reakciókba lép, megsemmisül (fragmentálódik) és módosul, bár kedvező körülmények között több ezer évig fennmaradhat [8].
Ismeretes, hogy az emberi ősök legősibb genetikai anyagát az Ibériai-félsziget (Sierra de Atapuerca) területén mintegy 430 ezer évvel ezelőtt élt humanoid rokonaink csontmaradványaiból nyerték ki [9]. Egyes barlangok sajátos mikroklímája alacsony páratartalom- és hőmérsékleti értékekkel jelentősen megnöveli a genetikai anyag élettartamát. A bűncselekmény helyszínén talált mintákban azonban a DNS gyakran minimális mennyiségben van jelen, és a régészeti mintákhoz hasonlóan erősen degradálódik.
Európában és az Egyesült Államokban felhívják a figyelmet a genetikai ujjlenyomatvétel egy másik hátrányára, amely a személy magánéletébe való beavatkozással és a magánélet megsértésével kapcsolatos.
Az emberi jogi aktivisták attól tartanak, hogy a bűnözők és a bűncselekmény gyanúsítottjainak genetikai adatai harmadik személyek kezébe kerülhetnek, majd visszaélhetnek velük [10]. Például a kínai Hszincsiang tartományban már ismertek olyan esetek, amikor a genetikai információkat a muszlim kisebbségek ellenőrzésére használták fel.
Az Egyesült Államok is azt tervezi, hogy szisztematikusan összegyűjti a szövetségi őrizetben lévő bevándorlók DNS-profiljait [11]. Nyilvánvaló, hogy az emberi jogi aktivisták félelmei nem alaptalanok, és valós alapjuk van.
A genetikai ujjlenyomatvétel fő előnyei közé tartozik, hogy kis mennyiségű biológiai anyaggal is képes dolgozni, valamint a nagy pontosság, amely lehetővé teszi az egyén azonosítását - ha az elemzés minden követelménye teljesül, megbízhatósága meghaladja a 99%-ot. Ez a megközelítés az egyik legfontosabbá vált a bűncselekmények felderítésében [7].
Fontos megjegyezni, hogy a klasszikus DNS-daktiloszkópiai módszerek nem teszik lehetővé az egypetéjű ikrek azonosítását, akiknek genetikai profilja azonos, mivel ugyanabból a megtermékenyített petesejtből keletkeznek.
A DNS-elemzéshez mindenekelőtt magára a DnA-ra van szükség, de a kémiai és termikus tényezőknek kitett biológiai mintákból korántsem mindig lehet jó minőségű genetikai anyagot kinyerni. A környezetbe kerülve ez a molekula kémiai reakciókba lép, megsemmisül (fragmentálódik) és módosul, bár kedvező körülmények között több ezer évig fennmaradhat [8].
Ismeretes, hogy az emberi ősök legősibb genetikai anyagát az Ibériai-félsziget (Sierra de Atapuerca) területén mintegy 430 ezer évvel ezelőtt élt humanoid rokonaink csontmaradványaiból nyerték ki [9]. Egyes barlangok sajátos mikroklímája alacsony páratartalom- és hőmérsékleti értékekkel jelentősen megnöveli a genetikai anyag élettartamát. A bűncselekmény helyszínén talált mintákban azonban a DNS gyakran minimális mennyiségben van jelen, és a régészeti mintákhoz hasonlóan erősen degradálódik.
Európában és az Egyesült Államokban felhívják a figyelmet a genetikai ujjlenyomatvétel egy másik hátrányára, amely a személy magánéletébe való beavatkozással és a magánélet megsértésével kapcsolatos.
Az emberi jogi aktivisták attól tartanak, hogy a bűnözők és a bűncselekmény gyanúsítottjainak genetikai adatai harmadik személyek kezébe kerülhetnek, majd visszaélhetnek velük [10]. Például a kínai Hszincsiang tartományban már ismertek olyan esetek, amikor a genetikai információkat a muszlim kisebbségek ellenőrzésére használták fel.
Az Egyesült Államok is azt tervezi, hogy szisztematikusan összegyűjti a szövetségi őrizetben lévő bevándorlók DNS-profiljait [11]. Nyilvánvaló, hogy az emberi jogi aktivisták félelmei nem alaptalanok, és valós alapjuk van.
Hogyan működik
A DNS-daktiloszkópia módszerei az emberi genetikai variabilitáson alapulnak. A DNS-ben található nukleotidcserék (a populációban való gyakoriságtól függően ezeket DNS-polimorfizmusoknak vagy mutációknak is nevezik) egyénileg különbözővé tesznek bennünket. Ezek a különbségek pedig mind a nukleáris, mind a mitokondriális genomban megtalálhatók, azokban a kis kör alakú DNS-molekulákban, amelyek a sejtek energia-"gyárainak", a mitokondriumoknak a működését szabályozzák.
.
Meg kell jegyezni, hogy a DNS-polimorfizmusok mindannyiunk genomjában megtalálhatók - ezek válnak egyedi DNS-vonalkódunkká. Ezek közül néhány súlyos betegségeket okozhat [12], de a legtöbb esetben nincs hatással életfunkcióinkra.
A modern DNS-daktiloszkópiás módszerek a genom különböző régióiban található genetikai variánsokat használják. Például a tandemismétlődések - rövid ismétlődő genomszekvenciák, amelyek száma két véletlenszerűen kiválasztott egyednél eltérő [13] -elemzése lehetővé teszi az egyértelmű apasági vizsgálatot vagy további bizonyítékok megtalálását egy bűncselekmény gyanúsítottja ellen.
Az Y-kromoszómális DNS-markerek segítségével meghatározható egy személy neme. A genetikai markerek információt nyújtanak az egyén rokonainak etnikai hovatartozásáról, szemszínéről vagy hajszínéről.
Ezenkívül az epigenetikai információk (pl. a DNS-metiláció) lehetővé teszik az egyes sejtek, szövetek és a szervezet egészének biológiai korának becslését [14]. Ebben a cikkben a genetikai elemzés fenti módszereiről fogok bővebben beszélni. Az epigenetikai módszerek alkalmazása a gyógyszeriparban pedig a következő publikációm témája lesz.
Az Y-kromoszómális DNS-markerek segítségével meghatározható egy személy neme. A genetikai markerek információt nyújtanak az egyén rokonainak etnikai hovatartozásáról, szemszínéről vagy hajszínéről.
Ezenkívül az epigenetikai információk (pl. a DNS-metiláció) lehetővé teszik az egyes sejtek, szövetek és a szervezet egészének biológiai korának becslését [14]. Ebben a cikkben a genetikai elemzés fenti módszereiről fogok bővebben beszélni. Az epigenetikai módszerek alkalmazása a gyógyszeriparban pedig a következő publikációm témája lesz.
DNS gyűjtése és izolálása biológiai anyagból
A DNS kivonása és elemzése törvényszéki mintákból első pillantásra a művészethez hasonlítható. Néha elképzelhetetlen, hogy néhány csepp vér vagy egy bőrdarab az áldozat körme alatt a bűnügyi nyomozás legfontosabb bizonyítékává válhat.
Valójában a helyszínelő igazságügyi szakértők tevékenysége finomhangolt, és egyetlen forgatókönyvet követ, amelynek egyik fő célja a DNS-kivonásra alkalmas biológiai anyag megtalálása. Erre a célra bármilyen biológiai szövet és emberi váladék felhasználható .
- Csontmaradványok
- Fogak
- Hajhagymák
- Vér
- Hámsejtek
- Izzadság
- Nyál
- Spermaminták
- ürülék stb.
A bizonyítékraktárban lévő biomassza évtizedekig is eltarthat. Gyakran előfordul, hogy a vizsgáló az anyagnak csak egy részét veszi el vizsgálatra, annyit, amennyire a DNS-kivonáshoz szüksége van. Ha például a késen vérnyomok vannak, a szakértő nem mossa le az összes vért, hanem közvetlenül a DNS-kivonás előtt egy kis öblítést végez. Ez nyomokat hagy a késen, amelyek segítségével több évtizeddel később is elvégezhető az újbóli vizsgálat.
A sejtmagban a DNS szoros kapcsolatban áll számos szerves molekulával, amelyek szükségesek a hatékony működéséhez. A genetikai elemzéshez azonban a szénhidrátokat, lipideket és fehérjéket el kell távolítani a vizsgálati mintából, ami csökkentheti az alkalmazott módszerek hatékonyságát, és következésképpen befolyásolhatja a bűnök oldhatóságát.A DNS extrakció kevés időt vesz igénybe, köszönhetően a különféle kereskedelmi készleteknek és a kifejezetten nukleinsav extrakcióra tervezett rendszereknek (pl. a Thermo Fisher Scientific AutoMate Express DNS Extraction System). Ezenkívül a nagy törvényszéki központokban, ahol naponta több ezer elemzést végeznek, ez a folyamat teljesen automatizált, és robotok részvételével, egy operátor felügyelete mellett zajlik.
A robotizált rendszereket egyébként nemcsak a törvényszéki laboratóriumokban, hanem számos orvosi és biotechnológiai központban is széles körben használják, lehetővé téve a folyamat felgyorsítását, a munkaköltségek csökkentését és a hibalehetőségek jelentős csökkentését.
A DNS extrakció után egy speciális vegyületben oldják fel, ahol szükség esetén évekig (-20°C-on vagy -80°C-on) tárolható.
Genetikai elemzés
Közvetlenül a DnA extrakció után a szakembernek szembe kell néznie az elemzés további módjaival. A DNS-azonosítás bevezetése óta a kriminalisztikában a molekuláris biológiai technikák annyira megváltoztak, hogy több lehetséges változat is létezik. További történetünkben rávilágítunk a DNS-elemzés különböző technikáira, amelyeket a törvényszéki szakértők a gyakorlatban alkalmaznak.
Restrikciós töredékhosszúságú polimorfizmus (RFLP-elemzés)
Az RFLP-elemzés történelmileg az egyik első DNS-azonosítási módszer. Alapja speciális sejtenzimek, restrikciós enzimek használata. A restrikciós enzimek képesek felismerni bizonyos helyeket a nukleinsavmolekulán és ezeken a helyeken keresztül elvágni azt. Eddig több ezer ilyen enzimet írtak le. A DnA molekula restrikciós enzimekkel történő elvágása után a kapott fragmentumok hosszát gélelektroforézissel értékelik (9. ábra).
Közvetlenül a DnA extrakció után a szakembernek szembe kell néznie az elemzés további módjaival. A DNS-azonosítás bevezetése óta a kriminalisztikában a molekuláris biológiai technikák annyira megváltoztak, hogy több lehetséges változat is létezik. További történetünkben rávilágítunk a DNS-elemzés különböző technikáira, amelyeket a törvényszéki szakértők a gyakorlatban alkalmaznak.
Restrikciós töredékhosszúságú polimorfizmus (RFLP-elemzés)
Az RFLP-elemzés történelmileg az egyik első DNS-azonosítási módszer. Alapja speciális sejtenzimek, restrikciós enzimek használata. A restrikciós enzimek képesek felismerni bizonyos helyeket a nukleinsavmolekulán és ezeken a helyeken keresztül elvágni azt. Eddig több ezer ilyen enzimet írtak le. A DnA molekula restrikciós enzimekkel történő elvágása után a kapott fragmentumok hosszát gélelektroforézissel értékelik (9. ábra).
Mivel teljesen azonos emberi genom nem létezik (kivéve az egypetéjű ikreket), a kapott DNS-fragmensek hosszprofiljának különbsége vagy hasonlósága jó marker lehet mind a személyazonosításhoz, mind a rokonság meghatározásához.
Ez a módszer azonban DNS-fragmentációval jár, ezért érzékeny az eredeti genetikai anyag minőségére és mennyiségére. Ezért az RFLP-elemzést jelenleg gyakorlatilag nem alkalmazzák - ellentétben más módszerekkel, amelyekről alább lesz szó.
A genomban található tandem ismétlődések számának elemzése
A tandem ismétlődések ugyanazon rövid DnA-szekvencia egymás után ismétlődő másolatai [15]. A törvényszéki kutatók számára érdekes ismétlődések közé tartoznak a változó számú tandemismétlődéssel rendelkező lókuszok (VNTR) és a rövid tandemismétlődések (STR). Ezeket miniszatelliteknek, illetve mikroszatelliteknek is nevezik.
A módszer lényege az ilyen rövid ismétlődő szekvenciákat tartalmazó DNS-töredékek PCR-amplifikációja, amelyek hossza két véletlenszerűen kiválasztott egyénnél eltérő. Az amplifikációt követően a kapott fragmentumok hosszát gélelektroforézissel vagy kapilláris elektroforézissel értékelik.
Erre a célra a Termo Fisher Scientific cég Quantifiler DNA Quantification Kit és a QuantStudio rendszer használható. A QuantStudio egy kompakt, sokféle funkcióval rendelkező, asztali műszer.
Az előző módszerhez hasonlóan az STR-mérés fő azonosító tényezője a kapott fragmentumok hossza, amely minden egyén esetében egyedi, és az elemzett helyen lévő ismétlődések számától függ. Az STR-analízist nagy pontosság és gyorsaság, valamint alacsony költség jellemzi. Az elemzés fontos feltétele a genetikai anyag minősége.
Ez a módszer azonban DNS-fragmentációval jár, ezért érzékeny az eredeti genetikai anyag minőségére és mennyiségére. Ezért az RFLP-elemzést jelenleg gyakorlatilag nem alkalmazzák - ellentétben más módszerekkel, amelyekről alább lesz szó.
A genomban található tandem ismétlődések számának elemzése
A tandem ismétlődések ugyanazon rövid DnA-szekvencia egymás után ismétlődő másolatai [15]. A törvényszéki kutatók számára érdekes ismétlődések közé tartoznak a változó számú tandemismétlődéssel rendelkező lókuszok (VNTR) és a rövid tandemismétlődések (STR). Ezeket miniszatelliteknek, illetve mikroszatelliteknek is nevezik.
A módszer lényege az ilyen rövid ismétlődő szekvenciákat tartalmazó DNS-töredékek PCR-amplifikációja, amelyek hossza két véletlenszerűen kiválasztott egyénnél eltérő. Az amplifikációt követően a kapott fragmentumok hosszát gélelektroforézissel vagy kapilláris elektroforézissel értékelik.
Erre a célra a Termo Fisher Scientific cég Quantifiler DNA Quantification Kit és a QuantStudio rendszer használható. A QuantStudio egy kompakt, sokféle funkcióval rendelkező, asztali műszer.
Az előző módszerhez hasonlóan az STR-mérés fő azonosító tényezője a kapott fragmentumok hossza, amely minden egyén esetében egyedi, és az elemzett helyen lévő ismétlődések számától függ. Az STR-analízist nagy pontosság és gyorsaság, valamint alacsony költség jellemzi. Az elemzés fontos feltétele a genetikai anyag minősége.
Az STR-analízis csaknem húsz évvel ezelőtt jelent meg a gyakorlati kriminalisztikában, de a mai napig a személyek azonosításának fő módszere. A gyanúsítottak és bűnözők DNS-elemzésének eredményeit - a genetikai profilokat - a kriminológusok speciális adatbázisokba viszik be.
Ezért, amikor a bűncselekmények helyszínein olyan biológiai nyomokat találnak, amelyekből a DNS izolálható, lehetővé vált minden olyan személy azonosítása, aki már a bűnüldöző szervek tudomására jutott. Ugyanezeket a markereket használják az eltűnt személyek felkutatására és az apaság megállapítására.
Ezért, amikor a bűncselekmények helyszínein olyan biológiai nyomokat találnak, amelyekből a DNS izolálható, lehetővé vált minden olyan személy azonosítása, aki már a bűnüldöző szervek tudomására jutott. Ugyanezeket a markereket használják az eltűnt személyek felkutatására és az apaság megállapítására.
Az egyedek azonosítására tervezett rendszerek általában egyszerre több genomi lókusz (10-24) elemzését teszik lehetővé, beleértve az amelogenin fehérje génjét, amely alapján a nemet meghatározzák. Az amelogenin gén az X és az Y kromoszómán is megtalálható, de méretben különbözik, ami lehetővé teszi a személy nemének meghatározását.
A nagy áteresztőképességű szekvenálási technológiák alkalmazásának köszönhetően a törvényszéki orvostudomány hatékony eszközhöz jutott, amely új lehetőségeket nyitott meg a nukleáris és a mitokondriális genom több helyének (lókuszának) egyidejű elemzésére.
E módszerek fontos előnye, hogy még az egypetéjű ikreket is meg tudják különböztetni (szomatikus mutációk alapján), ami az RFLP- vagy STR-elemzéssel lehetetlen.
A nagy áteresztőképességű szekvenálási technológiák alkalmazásának köszönhetően a törvényszéki orvostudomány hatékony eszközhöz jutott, amely új lehetőségeket nyitott meg a nukleáris és a mitokondriális genom több helyének (lókuszának) egyidejű elemzésére.
E módszerek fontos előnye, hogy még az egypetéjű ikreket is meg tudják különböztetni (szomatikus mutációk alapján), ami az RFLP- vagy STR-elemzéssel lehetetlen.
A kiadvány második részében ismertetjük, hogyan használhatók a fent leírt módszerek droglaborok és drogkereskedők azonosítására, és hogyan lehet a nyomok eltüntetésével összezavarni a törvényszékieket.
Olvassa el a II. részt
