Introduzione
La cromatografia su colonna è un'estensione della cromatografia su strato sottile (TLC). Si presume che il lettore abbia una certa esperienza nella pratica di laboratorio e abbia avuto a che fare con la cromatografia su strato sottile. Invece di applicare un campione su un sottile strato di silice o di allumina, il campione viene depositato su un cilindro di adsorbente e il solvente viene continuamente applicato con pressione finché i componenti non defluiscono completamente dal cilindro. Con questa modifica, i componenti possono essere non solo separati, ma anche raccolti in contenitori diversi, consentendo la purificazione di miscele e la separazione di farmaci con inquinanti. La cromatografia su colonna (nota anche come "cromatografia flash") è spesso utilizzata in ambito di ricerca, come dimostra la sua frequente presenza nelle sezioni procedurali degli articoli delle riviste.
Discussione procedurale
Gli stessi principi di base della cromatografia su strato sottile (TLC) si applicano alla cromatografia su colonna. Infatti, prima di eseguire una colonna si esegue sempre una TLC per valutare la situazione e determinare il rapporto di solventi adeguato. Per ottenere una buona separazione, l'ideale è che il componente desiderato abbia un Rf intorno a 0,35 (leggere l'argomento Rf nella sezione TLC) e che sia separato dagli altri componenti di almeno 0,2 unità Rf. Se le macchie da separare sono molto vicine (se la differenza di Rf è < 0,2), è meglio se la parte centrale delle macchie ha un Rf di 0,35. Un Rf vicino a 0,35 è ideale perché è abbastanza lento da consentire l'equilibrio tra fase stazionaria e fase mobile, ma abbastanza veloce da minimizzare l'allargamento della banda dovuto alla diffusione.
Esistono alcune variabili che non sono applicabili alla TLC, ma che influenzano la separazione dei componenti nella cromatografia su colonna. Queste includono il diametro della colonna, la quantità di adsorbente utilizzato e la portata del solvente. La figura 1 mostra le raccomandazioni per le variabili in base al campione. 1 mostra raccomandazioni variabili in base alle dimensioni del campione e al grado di separazione tra i componenti. In tutti gli scenari, le colonne devono essere preparate tra i 12,5 e i 15 cm di altezza.
Esistono alcune variabili che non sono applicabili alla TLC, ma che influenzano la separazione dei componenti nella cromatografia su colonna. Queste includono il diametro della colonna, la quantità di adsorbente utilizzato e la portata del solvente. La figura 1 mostra le raccomandazioni per le variabili in base al campione. 1 mostra raccomandazioni variabili in base alle dimensioni del campione e al grado di separazione tra i componenti. In tutti gli scenari, le colonne devono essere preparate tra i 12,5 e i 15 cm di altezza.
Ad esempio, una colonna di 2,5 cm dovrebbe essere in grado di purificare circa 400 mg di materiale se la separazione è buona (ΔRf > 0,2, terza colonna nella Fig. 1), o circa 160 mg se la separazione è difficile (ΔRf > 0,1). La colonna dovrebbe poter essere preparata ed eluita con circa 200 ml di solvente e le frazioni possono essere raccolte con circa 10 ml di soluzione ciascuna.
Esistono numerose varianti su come eseguire fisicamente una colonna. Una grande differenza tra i metodi è il modo in cui viene preparata la colonna. Nel metodo "dry packing", la silice o l'allumina asciutte vengono aggiunte direttamente alla colonna e il solvente viene fatto passare a porzioni, poi a pressione. Nel metodo "wet packing", la colonna viene prima riempita con il solvente, poi la silice o l'allumina secca viene leggermente agitata e quindi impacchettata a pressione. Nel metodo "slurry", il solvente viene aggiunto alla silice o all'allumina in una beuta, versato sulla colonna come materiale fangoso e quindi impacchettato con pressione (la pressione può essere prodotta con una siringa).
È importante sapere che il calore viene liberato quando il solvente viene aggiunto alla silice o all'allumina (hanno un calore di solvatazione esotermico). In questa sezione viene presentato il metodo dello slurry, il cui motivo principale è che consente di effettuare questa fase esotermica in una beuta anziché sulla colonna. Se il calore viene liberato durante l'impaccamento della colonna, può generare bolle dovute all'ebollizione del solvente. Queste possono interferire con la separazione della colonna se non vengono adeguatamente rimosse e possono rompere il materiale adsorbente della colonna.
Esistono numerose varianti su come eseguire fisicamente una colonna. Una grande differenza tra i metodi è il modo in cui viene preparata la colonna. Nel metodo "dry packing", la silice o l'allumina asciutte vengono aggiunte direttamente alla colonna e il solvente viene fatto passare a porzioni, poi a pressione. Nel metodo "wet packing", la colonna viene prima riempita con il solvente, poi la silice o l'allumina secca viene leggermente agitata e quindi impacchettata a pressione. Nel metodo "slurry", il solvente viene aggiunto alla silice o all'allumina in una beuta, versato sulla colonna come materiale fangoso e quindi impacchettato con pressione (la pressione può essere prodotta con una siringa).
È importante sapere che il calore viene liberato quando il solvente viene aggiunto alla silice o all'allumina (hanno un calore di solvatazione esotermico). In questa sezione viene presentato il metodo dello slurry, il cui motivo principale è che consente di effettuare questa fase esotermica in una beuta anziché sulla colonna. Se il calore viene liberato durante l'impaccamento della colonna, può generare bolle dovute all'ebollizione del solvente. Queste possono interferire con la separazione della colonna se non vengono adeguatamente rimosse e possono rompere il materiale adsorbente della colonna.
Procedure passo-passo
a) TLC della miscela ferrocene/acetilferrocene, b) Cromatografia su colonna
La colonna illustrata in questa sezione mostra la purificazione di un campione di 0,20 g contenente una miscela di ferrocene e acetilferrocene (la TLC grezza è nella Fig.2 a). Le frazioni di circa 8 ml sono state raccolte in piccole provette e sono stati utilizzati circa 400 ml di eluente.
a) Lastra TLC della miscela di ferrocene/acetilferrocene grezzo prima dell'eluizione, b) Dopo l'eluizione, c) Colonna con fritta, d) Colonna con cotone incastrato sul fondo, e) Colonna priva del cuneo di cotone (dovrebbe essere inserito prima dell'uso)
Eseguire una TLC
1 ) Eseguire una TLC sul campione da purificare (Fig. 3 a e b) per determinare il solvente appropriato per la cromatografia. Il componente desiderato dovrebbe avere un Rf intorno a 0,35 e idealmente dovrebbe essere separato da tutti gli altri spot di almeno 0,2 unità Rf.
2 ) Preparare un batch di eluente che dia il valore Rf corretto. La quantità preparata dipende dalla quantità di campione, dalle dimensioni della colonna e dalla possibilità di cambiare la composizione del solvente a metà strada. (Vedere la Fig. 1 per le linee guida e la serie eluotropica per le tendenze della "potenza del solvente").
2 ) Preparare un batch di eluente che dia il valore Rf corretto. La quantità preparata dipende dalla quantità di campione, dalle dimensioni della colonna e dalla possibilità di cambiare la composizione del solvente a metà strada. (Vedere la Fig. 1 per le linee guida e la serie eluotropica per le tendenze della "potenza del solvente").
Preparare la colonna impaccata
3 ) Procurarsi una colonna appropriata (vedi Fig. 1) e assicurarsi che vicino al rubinetto di arresto ci sia qualcosa che permetta il passaggio di liquidi, ma non di solidi. Le colonne possono avere un disco sinterizzato (noto anche come "fritta"), Fig. 3 c), o un tappo di cotone o lana di vetro rimasto dall'utente precedente (Fig. 3 d). Se non è presente alcun disco o tappo (Fig.3 e), incastrare un piccolo batuffolo di cotone o lana di vetro sul fondo della colonna utilizzando un'asta lunga.
a) Versare la silice a 12,5-15 cm di altezza nella cappa di aspirazione, b) Versare la silice in una beuta, c e d) Creare uno slurry.
Nota di sicurezza: la silice e l'allumina in polvere sono irritanti per i polmoni e devono sempre essere maneggiate con cura in una cappa di aspirazione. La polvere versata deve essere eliminata strofinandola con un panno di carta bagnato (se bagnato, le particelle fini sono meno dispersive).
5 ) Nella cappa di aspirazione, versare l'adsorbente misurato nella colonna in una beuta (Fig. 4 b), quindi aggiungere un po' di eluente (Fig. 4 c). Creare uno slurry sciolto facendo ruotare e mescolando con una bacchetta di vetro (Fig. 4 d) fino a quando tutto l'adsorbente è completamente bagnato, le bolle di gas vengono rilasciate e la consistenza è un po' densa, ma colabile.
a) Versamento dello slurry nella colonna, b) Risciacquo del matraccio, c) Adsorbente aderito ai lati della colonna, d) Risciacquo dell'adsorbente aggrappato
6 ) Mettere un becher o una beuta sotto la colonna bloccata e aprire il rubinetto. Con un rapido movimento, agitare e versare lo slurry di silice o allumina nella colonna usando un imbuto a bocca larga (Fig. 5 a). Utilizzare immediatamente altro eluente per risciacquare lo slurry residuo dalla beuta (Fig. 5 b) e sulla colonna.
7 ) Sciacquare immediatamente la silice o l'allumina dai lati del serbatoio della colonna usando l'eluente e un movimento rotatorio di una pipetta Pasteur (Fig. 5 c e d). Se lasciato asciugare, l'adsorbente si aggrapperà al vetro e non sarà più facile risciacquarlo.
7 ) Sciacquare immediatamente la silice o l'allumina dai lati del serbatoio della colonna usando l'eluente e un movimento rotatorio di una pipetta Pasteur (Fig. 5 c e d). Se lasciato asciugare, l'adsorbente si aggrapperà al vetro e non sarà più facile risciacquarlo.
a) Muovere la colonna per rimuovere le bolle d'aria, b) Applicare la pressione dell'aria, c) Aggiungere la sabbia, d) Risciacquare la sabbia dai lati
8 ) Sbattete con forza la colonna usando un anello di sughero o le vostre nocche (Fig. 6 a) per eliminare eventuali bolle d'aria nella colonna (che potrebbero causare una cattiva separazione o la rottura dell'adsorbente nella colonna) e per favorire una deposizione uniforme dell'adsorbente.
9) Applicare una leggera pressione d'aria sulla parte superiore della colonna (Fig. 6 b) per comprimerla, fermandosi quando il livello dell'eluente si trova a 1 cm dalla parte superiore della colonna. Se si utilizza un adattatore a T con la linea dell'aria come nella Fig. 6 b, è possibile ottenere un controllo fine del flusso d'aria regolando la pinza sul tubo di gomma. Durante l'intero processo di eluizione, mantenere la colonna bianca di adsorbente bagnata, con il livello dell'eluente sopra la parte superiore della silice o dell'allumina. Rompere delicatamente il sigillo per interrompere l'applicazione della pressione e chiudere il rubinetto d'arresto per evitare che il liquido fuoriesca ulteriormente.
10 ) Aggiungere un sottile strato di sabbia (Fig. 6 c), alto circa 0,5 cm. Sciacquare i lati della colonna con l'eluente con un movimento rotatorio per staccare la sabbia dai lati del vetro (Fig. 6 d). Aprire il rubinetto d'arresto e far gocciolare il liquido fino a quando non si trova appena sopra lo strato di sabbia. Applicare una pressione d'aria se il gocciolamento è troppo lento.
9) Applicare una leggera pressione d'aria sulla parte superiore della colonna (Fig. 6 b) per comprimerla, fermandosi quando il livello dell'eluente si trova a 1 cm dalla parte superiore della colonna. Se si utilizza un adattatore a T con la linea dell'aria come nella Fig. 6 b, è possibile ottenere un controllo fine del flusso d'aria regolando la pinza sul tubo di gomma. Durante l'intero processo di eluizione, mantenere la colonna bianca di adsorbente bagnata, con il livello dell'eluente sopra la parte superiore della silice o dell'allumina. Rompere delicatamente il sigillo per interrompere l'applicazione della pressione e chiudere il rubinetto d'arresto per evitare che il liquido fuoriesca ulteriormente.
10 ) Aggiungere un sottile strato di sabbia (Fig. 6 c), alto circa 0,5 cm. Sciacquare i lati della colonna con l'eluente con un movimento rotatorio per staccare la sabbia dai lati del vetro (Fig. 6 d). Aprire il rubinetto d'arresto e far gocciolare il liquido fino a quando non si trova appena sopra lo strato di sabbia. Applicare una pressione d'aria se il gocciolamento è troppo lento.
Aggiungere il campione
Una volta che il campione è stato applicato alla colonna, c'è una corsa contro il tempo, poiché la diffusione inizierà ad allargare il materiale. Non si dovrebbe applicare un campione finché non si è pronti a completare la colonna immediatamente e nella sua interezza. Questo processo può richiedere da 15 a 90 minuti! Se si usano le provette per raccogliere le frazioni, queste devono essere disposte in un rack prima di aggiungere il campione e l'altezza della colonna deve essere regolata in modo che il rack delle provette possa scorrere sotto di essa.
a) Sciogliere un solido con una piccola quantità di diclorometano, b) Applicare il campione, c) Risciacquare il campione nel matraccio, d) Applicare la pressione per spingere il campione sulla colonna appena oltre lo strato di sabbia.
11 ) Se il campione grezzo è un liquido, utilizzarlo direttamente (passare al punto 13).
12 ) Se il campione grezzo è un solido, fare una delle seguenti operazioni.
12 ) Se il campione grezzo è un solido, fare una delle seguenti operazioni.
a) Situazione ideale: sciogliere il solido nella quantità minima di eluente (qualche ml al massimo).
b) Se il solido non è particolarmente solubile o non si scioglie in pochi ml di eluente, scioglierlo nella quantità minima di diclorometano (pochi ml al massimo, Fig.7 a).
c) Se il solido è insolubile nell'eluente, è possibile anche una procedura alternativa. Sciogliere il solido in un matraccio a fondo tondo con pochi ml di un solvente a basso punto di ebollizione (ad es. diclorometano o acetone). Aggiungere al matraccio circa 1 g di silice o allumina, quindi rimuovere il solvente sull'evaporatore rotante per lasciare un solido che contiene il campione depositato sull'adsorbente. Con un centimetro di eluente appoggiato sulla colonna impaccata (se si usa questo metodo, non si aggiunge lo strato di sabbia), versare il campione adsorbito con la silice sulla colonna usando un imbuto a bocca larga. Se la polvere rimane attaccata al vetro, risciacquare con altro eluente (passare al punto 15).
13) Aggiungere delicatamente il campione alla colonna con la pipetta, facendo gocciolare il liquido o la soluzione direttamente sulla sabbia con la punta della pipetta il più vicino possibile, non lungo i lati (Fig.7 b). Fare attenzione a non spruzzare il liquido con forza, in modo da provocare delle impronte nella sabbia o nella colonna di silice/allumina.
14) Risciacquare il contenitore del campione con un po' di solvente (o diclorometano se usato, Fig.7 c) e aggiungere il risciacquo alla colonna usando la stessa pipetta (per risciacquare anche la pipetta).
15) Aprire il rubinetto d'arresto e far gocciolare il liquido fino a quando il campione non supera lo strato di sabbia (Fig. 7 d) e finisce nell'area bianca della colonna (applicare la pressione dell'aria se questa operazione richiede più di 20 secondi).
16 ) Risciacquare delicatamente i lati della colonna con un movimento rotatorio utilizzando 1-2 pipette piene di eluente per risciacquare eventuali schizzi di campione. Anche in questo caso, lasciare sgocciolare il liquido (o applicare una pressione d'aria) finché il campione non viene spinto nell'adsorbente bianco.
Ripetere la fase di risciacquo fino a quando non si è certi che l'intero campione sia depositato sull'adsorbente. Se una parte del campione si trova ancora nello strato di sabbia, potrebbe dissolversi nell'eluente quando si aggiunge altro solvente, con conseguente perdita di resa. Se il composto è colorato, il risciacquo deve essere completamente chiaro.
14) Risciacquare il contenitore del campione con un po' di solvente (o diclorometano se usato, Fig.7 c) e aggiungere il risciacquo alla colonna usando la stessa pipetta (per risciacquare anche la pipetta).
15) Aprire il rubinetto d'arresto e far gocciolare il liquido fino a quando il campione non supera lo strato di sabbia (Fig. 7 d) e finisce nell'area bianca della colonna (applicare la pressione dell'aria se questa operazione richiede più di 20 secondi).
16 ) Risciacquare delicatamente i lati della colonna con un movimento rotatorio utilizzando 1-2 pipette piene di eluente per risciacquare eventuali schizzi di campione. Anche in questo caso, lasciare sgocciolare il liquido (o applicare una pressione d'aria) finché il campione non viene spinto nell'adsorbente bianco.
Ripetere la fase di risciacquo fino a quando non si è certi che l'intero campione sia depositato sull'adsorbente. Se una parte del campione si trova ancora nello strato di sabbia, potrebbe dissolversi nell'eluente quando si aggiunge altro solvente, con conseguente perdita di resa. Se il composto è colorato, il risciacquo deve essere completamente chiaro.
a e b) Riempimento del serbatoio del solvente, c e d) Eluizione della colonna
Riempire con l'eluente ed eluire la colonna
17) Aggiungere delicatamente altro eluente con la pipetta (Fig. 8 a), facendo roteare i lati, e poi quando lo strato di sabbia non sarà più disturbato dalle aggiunte, versare con cautela quantità maggiori (Fig. 8 b) dell'eluente preparato per riempire il serbatoio (o riempire con la quantità necessaria). L'eluente pulito raccolto durante il confezionamento della colonna può essere riutilizzato.
18 ) Utilizzare la pressione dell'aria per eluire delicatamente e costantemente il campione attraverso la colonna (Fig. 8 c e d). Più volte la pressione viene avviata e interrotta, più è probabile che la colonna si rompa. È meglio se la pressione può essere mantenuta dolce e costante per tutto il tempo.
La velocità di gocciolamento ottimale durante l'eluizione dipende dalle dimensioni della colonna. Il flusso ideale di eluente si ha quando il solvente nella sezione cilindrica della colonna sopra l'adsorbente scende a 5 cm al minuto. Pertanto, la velocità di gocciolamento dovrebbe essere più lenta con una colonna stretta rispetto a una colonna più larga. La velocità di gocciolamento per una colonna di un pollice dovrebbe essere tale da permettere di distinguere a malapena le singole gocce. Un flusso di liquido che fuoriesce dal rubinetto con una colonna di queste dimensioni è leggermente troppo veloce.
18 ) Utilizzare la pressione dell'aria per eluire delicatamente e costantemente il campione attraverso la colonna (Fig. 8 c e d). Più volte la pressione viene avviata e interrotta, più è probabile che la colonna si rompa. È meglio se la pressione può essere mantenuta dolce e costante per tutto il tempo.
La velocità di gocciolamento ottimale durante l'eluizione dipende dalle dimensioni della colonna. Il flusso ideale di eluente si ha quando il solvente nella sezione cilindrica della colonna sopra l'adsorbente scende a 5 cm al minuto. Pertanto, la velocità di gocciolamento dovrebbe essere più lenta con una colonna stretta rispetto a una colonna più larga. La velocità di gocciolamento per una colonna di un pollice dovrebbe essere tale da permettere di distinguere a malapena le singole gocce. Un flusso di liquido che fuoriesce dal rubinetto con una colonna di queste dimensioni è leggermente troppo veloce.
a-c) Raccolta delle frazioni, d) Esecuzione della colonna
Raccolta delle frazioni
19 ) Iniziare immediatamente a raccogliere il liquido di eluizione in provette su un rack (Fig. 9 a). Vedere la Fig. 1 per le raccomandazioni sui volumi da raccogliere in ciascuna provetta.20 ) Quando la prima provetta si riempie, o se è stata raccolta una certa quantità di liquido come raccomandato dall'istruttore o dalla Fig. 1, spostare il rack per iniziare a raccogliere in un'altra provetta (Fig. 9 b e c). Riempire e tenere in ordine le provette sul rack.
Queste diverse provette sono chiamate "frazioni". L'obiettivo di una colonna è quello di raccogliere frazioni sufficientemente piccole in modo che la maggior parte (o alcune) delle frazioni contengano materiale puro. Se la separazione della miscela è difficile (se il ΔRf dei componenti è basso), può essere meglio raccogliere frazioni piccole (ad esempio, provette riempite a metà).
Queste diverse provette sono chiamate "frazioni". L'obiettivo di una colonna è quello di raccogliere frazioni sufficientemente piccole in modo che la maggior parte (o alcune) delle frazioni contengano materiale puro. Se la separazione della miscela è difficile (se il ΔRf dei componenti è basso), può essere meglio raccogliere frazioni piccole (ad esempio, provette riempite a metà).
a-c) Materiale di risciacquo spruzzato sulla punta della colonna, d) Studenti che eseguono una colonna
21 ) Quando il liquido defluisce dalla colonna, spesso schizza all'esterno del puntale della colonna e quando il solvente evapora si può vedere un anello di materiale sul puntale (si vedrà un anello di solido se il componente è un solido come nella Fig.10 b, o goccioline oleose se il componente è un liquido). Se i componenti sono colorati, il puntale della colonna deve essere risciacquato (Fig.10 c) quando sembra che un componente sia completamente eluito e prima che si avvicini l'altro componente.
22 ) Tenere d'occhio periodicamente il livello dell'eluente e riempirlo prima che scenda sotto lo strato di sabbia.
22 ) Tenere d'occhio periodicamente il livello dell'eluente e riempirlo prima che scenda sotto lo strato di sabbia.
a) Eluizione, b) Aggiunta di acetato di etile per aumentare la polarità del solvente, c) Il livello del solvente si avvicina allo strato di sabbia, d) Riempimento
Aumentare eventualmente la polarità del solvente
23) Si può utilizzare un unico eluente per tutta la colonna, soprattutto se i componenti da separare hanno valori Rf simili. Tuttavia, se i componenti hanno valori Rf molto diversi, la polarità del solvente può essere aumentata dopo che un componente ha eluito dalla colonna (Fig. 11 a).
Aumentando la polarità del solvente, i componenti viaggiano "più velocemente". Ci sono diverse ragioni per cui si desidera un'eluizione più rapida. In primo luogo, se un componente è già uscito dalla colonna, la colonna ha già svolto il suo lavoro di separazione, quindi accelerare il processo non influirà sulla purezza delle frazioni raccolte. In secondo luogo, più tempo è necessario per eseguire una colonna, più ampie saranno le bande di componenti (a causa della diffusione) e la raccolta di un'ampia banda di materiale utilizzerà (e sprecherà) molto solvente.
Aumentando la polarità del solvente, i componenti viaggiano "più velocemente". Ci sono diverse ragioni per cui si desidera un'eluizione più rapida. In primo luogo, se un componente è già uscito dalla colonna, la colonna ha già svolto il suo lavoro di separazione, quindi accelerare il processo non influirà sulla purezza delle frazioni raccolte. In secondo luogo, più tempo è necessario per eseguire una colonna, più ampie saranno le bande di componenti (a causa della diffusione) e la raccolta di un'ampia banda di materiale utilizzerà (e sprecherà) molto solvente.
Contiene un elenco parziale della serie eluotropica, un elenco di solventi comuni classificati in base al loro "potere solvente" nella cromatografia in fase normale. Il solvente più polare provoca l'aumento più drastico di Rf
24 ) Per aumentare la polarità del solvente, il solvente polare può essere gocciolato direttamente nell'eluente sul serbatoio della colonna (Fig. 11 b). Ad esempio, se si utilizza una miscela esano:acetato di etile, l'aggiunta di acetato di etile puro all'eluente attualmente nel serbatoio ne aumenterà la polarità. Se il livello dell'eluente si sta esaurendo, si può preparare una soluzione che contenga una percentuale maggiore del componente più polare. Ad esempio, se la colonna ha utilizzato prima una miscela 4:1 di esani:acetato di etile, utilizzando una miscela 1:1 si otterrebbe un solvente più polare.
25 ) Eluire la colonna con il solvente più polare come prima, ricordando sempre di osservare il livello dell'eluente e di riempirlo (Fig. 11 d) prima che scenda sotto lo strato di sabbia.
26 ) Per aumentare la polarità del solvente, il solvente polare può essere gocciolato direttamente nell'eluente sul serbatoio della colonna (Fig. 11 b). Ad esempio, se si utilizza una miscela esano:acetato di etile, l'aggiunta di acetato di etile puro all'eluente attualmente nel serbatoio ne aumenterà la polarità. Se il livello dell'eluente si sta esaurendo, si può preparare una soluzione che contenga una percentuale maggiore del componente più polare. Ad esempio, se la colonna ha utilizzato prima una miscela 4:1 di esani:acetato di etile, utilizzando una miscela 1:1 si otterrebbe un solvente più polare.
27 ) Eluire la colonna con il solvente più polare come prima, ricordando sempre di osservare il livello dell'eluente e di riempirlo (Fig. 11 d) prima che scenda sotto lo strato di sabbia.
25 ) Eluire la colonna con il solvente più polare come prima, ricordando sempre di osservare il livello dell'eluente e di riempirlo (Fig. 11 d) prima che scenda sotto lo strato di sabbia.
26 ) Per aumentare la polarità del solvente, il solvente polare può essere gocciolato direttamente nell'eluente sul serbatoio della colonna (Fig. 11 b). Ad esempio, se si utilizza una miscela esano:acetato di etile, l'aggiunta di acetato di etile puro all'eluente attualmente nel serbatoio ne aumenterà la polarità. Se il livello dell'eluente si sta esaurendo, si può preparare una soluzione che contenga una percentuale maggiore del componente più polare. Ad esempio, se la colonna ha utilizzato prima una miscela 4:1 di esani:acetato di etile, utilizzando una miscela 1:1 si otterrebbe un solvente più polare.
27 ) Eluire la colonna con il solvente più polare come prima, ricordando sempre di osservare il livello dell'eluente e di riempirlo (Fig. 11 d) prima che scenda sotto lo strato di sabbia.
a) Piastra TLC originale, b) Frazioni raccolte dalla colonna, c) Frazioni spottate su una piastra TLC, d) Una piastra TLC visualizzata dei campioni di ciascuna frazione
Trovare e concentrare il componente desiderato
28 ) Per trovare il componente desiderato nelle frazioni della provetta, è utile comprendere la relazione tra Rf e ordine di eluizione nella cromatografia su colonna.Nella cromatografia su colonna, il campione viene depositato sulla colonna ed eluito verso il basso, mentre nella cromatografia su strato sottile il campione viene depositato sul fondo della piastra ed eluito verso l'alto. Pertanto, una colonna può essere considerata come una piastra TLC capovolta. Un composto con un Rf più elevato scorre "più velocemente", cioè finisce più in alto su una piastra TLC e viene raccolto per primo con una colonna. Nella colonna illustrata in questa sezione, il componente con Rf più basso (arancione sulla piastra TLC nella Fig.13 a), è il componente raccolto per secondo dalla colonna.
29) Determinare innanzitutto quali provette contengono il composto disciolto.
29) Determinare innanzitutto quali provette contengono il composto disciolto.
a) Posizionare un campione di ogni frazione su una piastra TLC etichettata con i numeri delle frazioni corrispondenti all'ordine in cui sono state raccolte (Fig. 13 c). Può essere meglio macchiare ogni campione 2-3 volte l'uno sull'altro, nel caso in cui le frazioni siano diluite.
b) Se sono state raccolte molte frazioni e si esita a campionare ogni frazione, un metodo per identificare le frazioni incolori che possono contenere composti è quello di cercare un accenno di residuo nelle provette. Dopo l'evaporazione, a volte sulla parte superiore della provetta rimane un residuo solido (Fig. 13) o goccioline oleose, che rendono evidente che quelle frazioni non contengono solo solvente. Campionare tutte le frazioni vicino alle provette contenenti residui visibili.
c) Visualizzare la piastra TLC macchiata usando la luce UV e/o un colorante per determinare quali frazioni contengono il composto (Fig.13 d).
a) Piastre TLC eluite di frazioni contenenti un possibile composto, b) Combinazione di frazioni, c) Risciacquo di una provetta di frazione
28) Eseguire una TLC di tutte le frazioni che contengono composti, macchiando fino a cinque campioni per ogni piastra TLC larga 2,5 cm. Se disponibili, si possono usare piastre TLC più larghe.
29 ) Identificare il composto con l'Rf desiderato per confronto con la piastra TLC grezza originale. Scegliere di conservare le frazioni che presentano il composto desiderato in forma pura, come evidenziato dalla piastra TLC eluita. Ad esempio, se nella Fig. 15 a si desidera il composto con Rf più alto, si devono conservare le frazioni 6-10.
30 ) Unire le frazioni pure in un matraccio a fondo tondo di dimensioni adeguate (non più di metà, Fig. 15 b). Sciacquare ogni provetta con una piccola quantità di eluente (o altro solvente se la solubilità è un problema) e aggiungere il risciacquo al matraccio a fondo tondo (Fig. 15 c).
31 ) Far evaporare il solvente sull'evaporatore rotante per lasciare il composto purificato nella beuta.
29 ) Identificare il composto con l'Rf desiderato per confronto con la piastra TLC grezza originale. Scegliere di conservare le frazioni che presentano il composto desiderato in forma pura, come evidenziato dalla piastra TLC eluita. Ad esempio, se nella Fig. 15 a si desidera il composto con Rf più alto, si devono conservare le frazioni 6-10.
30 ) Unire le frazioni pure in un matraccio a fondo tondo di dimensioni adeguate (non più di metà, Fig. 15 b). Sciacquare ogni provetta con una piccola quantità di eluente (o altro solvente se la solubilità è un problema) e aggiungere il risciacquo al matraccio a fondo tondo (Fig. 15 c).
31 ) Far evaporare il solvente sull'evaporatore rotante per lasciare il composto purificato nella beuta.
a) Uso della pressione dell'aria per asciugare la colonna, b) Lasciare asciugare la colonna a testa in giù, c) Raccogliere la silice di scarto.
Pulizia della colonna
32 ) Per asciugare la colonna, applicare la pressione dell'aria per scaricare la maggior parte dell'eluente dalla colonna in un contenitore di scarto. Quindi asciugare ulteriormente la colonna utilizzando uno dei seguenti metodi.
a) Lasciare un leggero flusso d'aria attraverso la colonna per asciugarla ulteriormente mentre si puliscono altre cose (Fig.16 a).
b ) Bloccare la colonna a testa in giù su un grande becher di scarto nella cappa di aspirazione, in modo che l'adsorbente cada quando si è asciugato (Fig. 16 b). Questa operazione richiederà molto tempo (fino alla prossima lezione), ma è un'opzione.
33 ) Una volta asciutto, l'adsorbente può essere versato dalla colonna in un contenitore per rifiuti nella cappa (Fig. 16 c).
Nota di sicurezza: gli adsorbenti in polvere sono irritanti per i polmoni e la loro pericolosità aumenta se la colonna contiene composti residui che possono entrare nei polmoni. Il versamento di polveri di silice o allumina deve sempre essere effettuato nella cappa di aspirazione.
34 ) Quando la maggior parte dell'adsorbente è stata raccolta in un contenitore di rifiuti, usare l'acqua per sciacquare ogni residuo solido nel lavandino e poi sciacquare la colonna con acetone in un becher di scarto. Pulire poi la colonna con acqua e sapone e asciugarla con le parti del rubinetto separate.
Nota di sicurezza: gli adsorbenti in polvere sono irritanti per i polmoni e la loro pericolosità aumenta se la colonna contiene composti residui che possono entrare nei polmoni. Il versamento di polveri di silice o allumina deve sempre essere effettuato nella cappa di aspirazione.
34 ) Quando la maggior parte dell'adsorbente è stata raccolta in un contenitore di rifiuti, usare l'acqua per sciacquare ogni residuo solido nel lavandino e poi sciacquare la colonna con acetone in un becher di scarto. Pulire poi la colonna con acqua e sapone e asciugarla con le parti del rubinetto separate.
Risoluzione dei problemi
Si vedono bolle d'aria nella colonna
Una bolla d'aria è una sacca vuota in cui non avviene l'equilibrio tra fase stazionaria e mobile, quindi i componenti si muovono più velocemente di quanto dovrebbero intorno a una bolla d'aria. Questo può portare a bande di eluizione non uniformi, che possono causare sovrapposizioni se la separazione della miscela è difficile (se i componenti hanno valori Rf molto vicini, come nella Fig.17).
Se si vedono bolle d'aria nella colonna e la sabbia o il campione non sono ancora stati applicati, dare alla colonna una buona spinta durante il confezionamento per rimuovere tutte le bolle d'aria. Se le bolle non si spostano, rivolgersi all'istruttore, perché è possibile che si stia affrontando il compito con troppa delicatezza. Se la sabbia o il campione sono già stati applicati, è meglio lasciare la colonna così com'è e sperare che le bolle d'aria non influiscano sulla separazione.
Le bande eluiscono in modo non uniforme
Se i componenti di una miscela sono colorati, può essere evidente quando le bande eluiscono in modo irregolare. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che la colonna è stata bloccata con una leggera diagonale. Se la colonna è bloccata in modo obliquo, i componenti eluiscono in modo obliquo (Fig. 18). Ciò può causare problemi di separazione se i componenti hanno una Rf simile.
Non c'è modo di risolvere questo problema a metà colonna, ma se i componenti hanno valori di Rf molto diversi, le bande inclinate potrebbero non avere alcun effetto sulla separazione. In futuro, accertarsi che la colonna sia perfettamente verticale sia in direzione laterale che anteriore e posteriore.
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