Le tecnologie genetiche, che hanno fatto irruzione nella vita umana alla fine del secolo scorso, hanno cambiato il nostro mondo a tal punto che è già inimmaginabile senza di esse. Queste tecnologie sono riuscite a penetrare anche nella medicina legale; per decenni l'identificazione genetica è stata utilizzata come metodo veloce e relativamente economico che permette di trovare i criminali e risolvere i loro atti senza lasciare il laboratorio. Come farmacologo di formazione, sono molto interessato alla genetica e sono desideroso di studiare questo campo nei suoi vari aspetti. In questa pubblicazione vi presenterò gli approcci genetici classici nel campo della medicina legale.
Un po' di storia o cosa c'entra con i cavalieri?
150 anni fa Johannes Friedrich Miescher scoprì gli acidi nucleici, un concetto che finì per stravolgere il mondo [1]. Verso la metà del XX secolo divenne chiaro che il DNA e l'RNA erano portatori di informazioni ereditarie; poi fu descritta la loro struttura e, poco dopo, apparvero numerosi metodi che permettevano di "tagliare" queste molecole in vitro usando enzimi cellulari - le restringasi [2]; di amplificarle usando la PCR [3]; e persino di leggere la sequenza di geni e genomi specifici usando metodi di sequenziamento multipli [4].
Inizialmente, il lavoro con il materiale genetico veniva eseguito letteralmente "in cucina" e non sempre poteva essere riprodotto nemmeno nel vicino laboratorio scientifico. Ma il tempo è passato, gli approcci sono cambiati e i metodi sono stati standardizzati a tal punto da essere gradualmente introdotti nella ricerca applicata e persino nella produzione biotecnologica.
Nel 1984, la comunità scientifica fu scossa dalla notizia che gli scienziati erano riusciti a isolare e leggere un frammento di DNA della zebra di Burchell, estinta e presente solo nelle collezioni dei musei [5]. Un anno dopo, il genetista svedese Svante Pääbo confermò la possibilità di utilizzare materiale museale e archeologico per la ricerca scientifica fondamentale, avendo analizzato per primo il materiale genetico delle mummie egizie. Anni dopo, si scoprì che i campioni analizzati erano contaminati da materiale genetico moderno [6], ma lo sviluppo dei metodi di sequenziamento rese comunque possibile lavorare con quantità anche minime di DNA mal conservato.
Anche gli scienziati forensi si interessarono alle nuove tecniche di analisi del materiale genetico. Il fatto è che i metodi della dattiloscopia classica e dell'analisi del gruppo sanguigno, che erano abituali all'epoca, avevano i loro limiti e in alcuni casi facevano cilecca.
Nel 1984, lo scienziato britannico Sir Alec John Jeffreys (Figura 3) sviluppò e presentò un metodo per identificare una persona utilizzando il suo materiale genetico. In seguito questo approccio è stato chiamato identificazione del DNA, conquistando l'amore e il rispetto dei criminologi di tutto il mondo. Jeffreys fu nominato cavaliere per il suo lavoro.
Un po' di storia o cosa c'entra con i cavalieri?
150 anni fa Johannes Friedrich Miescher scoprì gli acidi nucleici, un concetto che finì per stravolgere il mondo [1]. Verso la metà del XX secolo divenne chiaro che il DNA e l'RNA erano portatori di informazioni ereditarie; poi fu descritta la loro struttura e, poco dopo, apparvero numerosi metodi che permettevano di "tagliare" queste molecole in vitro usando enzimi cellulari - le restringasi [2]; di amplificarle usando la PCR [3]; e persino di leggere la sequenza di geni e genomi specifici usando metodi di sequenziamento multipli [4].
Inizialmente, il lavoro con il materiale genetico veniva eseguito letteralmente "in cucina" e non sempre poteva essere riprodotto nemmeno nel vicino laboratorio scientifico. Ma il tempo è passato, gli approcci sono cambiati e i metodi sono stati standardizzati a tal punto da essere gradualmente introdotti nella ricerca applicata e persino nella produzione biotecnologica.
Nel 1984, la comunità scientifica fu scossa dalla notizia che gli scienziati erano riusciti a isolare e leggere un frammento di DNA della zebra di Burchell, estinta e presente solo nelle collezioni dei musei [5]. Un anno dopo, il genetista svedese Svante Pääbo confermò la possibilità di utilizzare materiale museale e archeologico per la ricerca scientifica fondamentale, avendo analizzato per primo il materiale genetico delle mummie egizie. Anni dopo, si scoprì che i campioni analizzati erano contaminati da materiale genetico moderno [6], ma lo sviluppo dei metodi di sequenziamento rese comunque possibile lavorare con quantità anche minime di DNA mal conservato.
Anche gli scienziati forensi si interessarono alle nuove tecniche di analisi del materiale genetico. Il fatto è che i metodi della dattiloscopia classica e dell'analisi del gruppo sanguigno, che erano abituali all'epoca, avevano i loro limiti e in alcuni casi facevano cilecca.
Nel 1984, lo scienziato britannico Sir Alec John Jeffreys (Figura 3) sviluppò e presentò un metodo per identificare una persona utilizzando il suo materiale genetico. In seguito questo approccio è stato chiamato identificazione del DNA, conquistando l'amore e il rispetto dei criminologi di tutto il mondo. Jeffreys fu nominato cavaliere per il suo lavoro.
Dattiloscopia del DNA: vantaggi e svantaggi
L'analisi genetica di campioni biologici ottenuti sulle scene del crimine ha semplificato notevolmente il lavoro degli investigatori. Essi dispongono ora di uno strumento affidabile per identificare il colpevole o la vittima, ottenere prove inconfutabili e risolvere i crimini.
I principali vantaggi della dattiloscopia genetica sono la capacità di lavorare anche con piccole quantità di materiale biologico e l'elevata accuratezza che consente l'identificazione di un individuo - se tutti i requisiti per l'analisi sono soddisfatti, la sua affidabilità supera il 99%. Questo approccio è diventato uno dei più importanti nelle indagini sui crimini [7].
È importante notare che i metodi classici di dattiloscopia del DNA non permettono di identificare gemelli identici il cui profilo genetico è lo stesso, poiché sono formati dallo stesso ovulo fecondato.
Per l'analisi del DNA è necessario innanzitutto il DnA stesso, ma non è sempre possibile estrarre materiale genetico di alta qualità da campioni biologici che sono stati esposti a fattori chimici e termici. Una volta nell'ambiente, questa molecola entra in reazioni chimiche, viene distrutta (frammentata) e modificata, anche se in condizioni favorevoli può persistere per migliaia di anni [8].
È noto che il materiale genetico più antico degli antenati dell'uomo è stato estratto dai resti ossei dei nostri parenti umanoidi che vivevano sul territorio della penisola iberica (Sierra de Atapuerca) circa 430 mila anni fa [9]. Il microclima specifico di alcune grotte, con bassi valori di umidità e temperatura, aumenta notevolmente la durata del materiale genetico. Tuttavia, il DNA nei campioni rinvenuti sulla scena del crimine è spesso rappresentato in quantità minime e, come nei campioni archeologici, è gravemente degradato.
In Europa e negli Stati Uniti si richiama l'attenzione su un altro svantaggio della rilevazione delle impronte genetiche, legato all'interferenza con la sfera privata di una persona e alla violazione della privacy.
Gli attivisti per i diritti umani temono che le informazioni genetiche dei criminali e dei sospetti criminali possano cadere nelle mani di terzi e quindi essere utilizzate in modo improprio [10]. Ad esempio, sono già noti casi di utilizzo di informazioni genetiche per controllare le minoranze musulmane nella provincia cinese dello Xinjiang.
Anche gli Stati Uniti stanno pianificando di raccogliere sistematicamente i profili del DNA degli immigrati in custodia federale [11]. Ovviamente, i timori degli attivisti per i diritti umani non sono infondati e hanno basi reali.
I principali vantaggi della dattiloscopia genetica sono la capacità di lavorare anche con piccole quantità di materiale biologico e l'elevata accuratezza che consente l'identificazione di un individuo - se tutti i requisiti per l'analisi sono soddisfatti, la sua affidabilità supera il 99%. Questo approccio è diventato uno dei più importanti nelle indagini sui crimini [7].
È importante notare che i metodi classici di dattiloscopia del DNA non permettono di identificare gemelli identici il cui profilo genetico è lo stesso, poiché sono formati dallo stesso ovulo fecondato.
Per l'analisi del DNA è necessario innanzitutto il DnA stesso, ma non è sempre possibile estrarre materiale genetico di alta qualità da campioni biologici che sono stati esposti a fattori chimici e termici. Una volta nell'ambiente, questa molecola entra in reazioni chimiche, viene distrutta (frammentata) e modificata, anche se in condizioni favorevoli può persistere per migliaia di anni [8].
È noto che il materiale genetico più antico degli antenati dell'uomo è stato estratto dai resti ossei dei nostri parenti umanoidi che vivevano sul territorio della penisola iberica (Sierra de Atapuerca) circa 430 mila anni fa [9]. Il microclima specifico di alcune grotte, con bassi valori di umidità e temperatura, aumenta notevolmente la durata del materiale genetico. Tuttavia, il DNA nei campioni rinvenuti sulla scena del crimine è spesso rappresentato in quantità minime e, come nei campioni archeologici, è gravemente degradato.
In Europa e negli Stati Uniti si richiama l'attenzione su un altro svantaggio della rilevazione delle impronte genetiche, legato all'interferenza con la sfera privata di una persona e alla violazione della privacy.
Gli attivisti per i diritti umani temono che le informazioni genetiche dei criminali e dei sospetti criminali possano cadere nelle mani di terzi e quindi essere utilizzate in modo improprio [10]. Ad esempio, sono già noti casi di utilizzo di informazioni genetiche per controllare le minoranze musulmane nella provincia cinese dello Xinjiang.
Anche gli Stati Uniti stanno pianificando di raccogliere sistematicamente i profili del DNA degli immigrati in custodia federale [11]. Ovviamente, i timori degli attivisti per i diritti umani non sono infondati e hanno basi reali.
Come funziona
I metodi di dattiloscopia del DNA si basano sulla variabilità genetica umana. Le sostituzioni nucleotidiche nel DNA (a seconda della frequenza nella popolazione, sono chiamate anche polimorfismi del DNA o mutazioni) ci rendono individualmente diversi. Queste differenze si trovano sia nel genoma nucleare che in quello mitocondriale, piccole molecole circolari di DNA che regolano il funzionamento dei mitocondri, le "fabbriche" di energia delle cellule.
Va notato che i polimorfismi del DNA si trovano nel genoma di ognuno di noi - diventano il nostro codice a barre del DNA unico. Alcuni di essi possono causare gravi malattie [12], ma nella maggior parte dei casi non hanno alcun effetto sulle nostre funzioni vitali.
I moderni metodi di dattiloscopia del DNA utilizzano una serie di varianti genetiche in diverse regioni del genoma. Ad esempio, l'analisi delle ripetizioni tandem - brevi sequenze ripetitive del genoma il cui numero differisce in due individui campionati a caso [13] - consente di effettuare un chiaro test di paternità o di trovare ulteriori prove contro un sospetto criminale.
I marcatori del DNA del cromosoma Y possono essere utilizzati per determinare il sesso di una persona. I marcatori genetici forniscono informazioni sull'etnia dei parenti di un individuo, sul colore degli occhi o dei capelli.
Inoltre, le informazioni epigenetiche (ad esempio, la metilazione del DNA) consentono di stimare l'età biologica di singole cellule, tessuti e dell'organismo nel suo complesso [14]. In questo articolo parlerò più diffusamente dei suddetti metodi di analisi genetica. L'uso dei metodi epigenetici nel settore farmaceutico sarà l'oggetto della mia prossima pubblicazione.
I marcatori del DNA del cromosoma Y possono essere utilizzati per determinare il sesso di una persona. I marcatori genetici forniscono informazioni sull'etnia dei parenti di un individuo, sul colore degli occhi o dei capelli.
Inoltre, le informazioni epigenetiche (ad esempio, la metilazione del DNA) consentono di stimare l'età biologica di singole cellule, tessuti e dell'organismo nel suo complesso [14]. In questo articolo parlerò più diffusamente dei suddetti metodi di analisi genetica. L'uso dei metodi epigenetici nel settore farmaceutico sarà l'oggetto della mia prossima pubblicazione.
Raccolta e isolamento del DNA da materiale biologico
L'estrazione e l'analisi del DNA da campioni forensi è, a prima vista, paragonabile all'arte. A volte è impossibile immaginare che poche gocce di sangue o un pezzo di pelle sotto le unghie di una vittima possano diventare la prova più importante in un'indagine criminale.
In realtà, le azioni degli specialisti forensi della scena del crimine sono ben calibrate e seguono un unico scenario, uno dei cui obiettivi principali è trovare materiale biologico adatto all'estrazione del DNA. A questo scopo possono essere utilizzati tutti i tessuti biologici e le secrezioni umane .
- Resti ossei
- Denti
- Follicoli di capelli
- Sangue
- Cellule epiteliali
- Sudore
- Saliva
- Campioni di sperma
- Escrementi, ecc.
Il materiale biologico nel magazzino delle prove può durare decenni. Spesso l'esaminatore preleva solo una parte del materiale da esaminare, quanto basta per l'estrazione del DNA. Ad esempio, se ci sono tracce di sangue sul coltello, l'esperto non lava via tutto il sangue, ma fa un piccolo risciacquo appena prima dell'estrazione del DNA. In questo modo rimangono tracce sul coltello, che possono essere utilizzate per condurre un nuovo esame diversi decenni dopo.
Nel nucleo della cellula, il DNA è in stretto contatto con numerose molecole organiche necessarie per il suo efficace funzionamento. Tuttavia, per l'analisi genetica, è necessario rimuovere carboidrati, lipidi e proteine dal campione in esame, il che può ridurre l'efficienza dei metodi utilizzati e, di conseguenza, influire sulla risolvibilità dei crimini.L'estrazione del DNA richiede poco tempo grazie a una varietà di kit commerciali e sistemi specificamente progettati per l'estrazione degli acidi nucleici (ad esempio, il sistema di estrazione del DNA AutoMate Express di Thermo Fisher Scientific). Inoltre, nei grandi centri forensi con migliaia di analisi al giorno, questo processo è completamente automatizzato ed eseguito con la partecipazione di robot sotto la supervisione di un operatore.
Tra l'altro, i sistemi robotizzati sono ampiamente utilizzati non solo nei laboratori forensi, ma anche in molti centri medici e di biotecnologia, consentendo di accelerare il processo, ridurre il costo del lavoro e diminuire in modo significativo la possibilità di errore.
Dopo l'estrazione, il DNA viene disciolto in un composto speciale, dove può essere conservato per anni (a -20°C o -80°C) se necessario.
Analisi genetica
Subito dopo l'estrazione del DnA, lo specialista si trova di fronte alla questione delle ulteriori modalità di analisi. Dall'introduzione dell'identificazione del DNA nella medicina legale, le tecniche di biologia molecolare sono cambiate a tal punto che esistono diverse varianti possibili. La nostra storia metterà in evidenza le diverse tecniche di analisi del DNA che gli esperti forensi utilizzano nella loro pratica.
Polimorfismo di lunghezza del frammento di restrizione (analisi RFLP)
L'analisi RFLP è storicamente uno dei primi metodi di identificazione del DNA. Si basa sull'uso di speciali enzimi cellulari, le restrictasi. Gli enzimi di restrizione sono in grado di riconoscere determinati siti su una molecola di acido nucleico e di tagliarla attraverso questi siti. Ad oggi sono state descritte diverse migliaia di enzimi di questo tipo. Dopo aver tagliato la molecola di DnA con gli enzimi di restrizione, la lunghezza dei frammenti ottenuti viene valutata mediante elettroforesi su gel (Figura 9).
Subito dopo l'estrazione del DnA, lo specialista si trova di fronte alla questione delle ulteriori modalità di analisi. Dall'introduzione dell'identificazione del DNA nella medicina legale, le tecniche di biologia molecolare sono cambiate a tal punto che esistono diverse varianti possibili. La nostra storia metterà in evidenza le diverse tecniche di analisi del DNA che gli esperti forensi utilizzano nella loro pratica.
Polimorfismo di lunghezza del frammento di restrizione (analisi RFLP)
L'analisi RFLP è storicamente uno dei primi metodi di identificazione del DNA. Si basa sull'uso di speciali enzimi cellulari, le restrictasi. Gli enzimi di restrizione sono in grado di riconoscere determinati siti su una molecola di acido nucleico e di tagliarla attraverso questi siti. Ad oggi sono state descritte diverse migliaia di enzimi di questo tipo. Dopo aver tagliato la molecola di DnA con gli enzimi di restrizione, la lunghezza dei frammenti ottenuti viene valutata mediante elettroforesi su gel (Figura 9).
Poiché non esistono genomi umani completamente identici (ad eccezione dei gemelli identici), la differenza o la somiglianza dei profili di lunghezza dei frammenti di DNA risultanti può essere un buon marcatore sia per l'identificazione personale che per la determinazione della parentela.
Tuttavia, questo metodo prevede la frammentazione del DNA ed è quindi sensibile alla qualità e alla quantità del materiale genetico originale. Per questo motivo, l'analisi RFLP non è attualmente utilizzata in pratica, a differenza di altri metodi che verranno discussi di seguito.
Analisi del numero di ripetizioni tandem nel genoma
Le ripetizioni tandem sono copie della stessa breve sequenza DnA ripetute una dopo l'altra [15]. Le ripetizioni che sono di interesse per gli scienziati forensi includono loci con un numero variabile di ripetizioni tandem (VNTR) e ripetizioni tandem corte (STR). Sono anche chiamati rispettivamente minisatelliti e microsatelliti.
L'essenza di questo metodo è l'amplificazione PCR di frammenti di DNA contenenti queste brevi sequenze ripetitive la cui lunghezza è diversa in due individui campionati a caso. Dopo l'amplificazione, la lunghezza dei frammenti ottenuti viene valutata mediante elettroforesi su gel o capillare.
A questo scopo si possono utilizzare il Quantifiler DNA Quantification Kit e il sistema QuantStudio di Termo Fisher Scientific. Il QuantStudio è uno strumento da banco compatto con un'ampia gamma di funzioni.
Come per il metodo precedente, il principale fattore di identificazione del test STR è la lunghezza dei frammenti ottenuti, che è unica per ogni individuo e dipende dal numero di ripetizioni nel sito analizzato. L'analisi STR è caratterizzata da un'elevata accuratezza e velocità, oltre che da un basso costo. La qualità del materiale genetico è una condizione importante per l'analisi.
Tuttavia, questo metodo prevede la frammentazione del DNA ed è quindi sensibile alla qualità e alla quantità del materiale genetico originale. Per questo motivo, l'analisi RFLP non è attualmente utilizzata in pratica, a differenza di altri metodi che verranno discussi di seguito.
Analisi del numero di ripetizioni tandem nel genoma
Le ripetizioni tandem sono copie della stessa breve sequenza DnA ripetute una dopo l'altra [15]. Le ripetizioni che sono di interesse per gli scienziati forensi includono loci con un numero variabile di ripetizioni tandem (VNTR) e ripetizioni tandem corte (STR). Sono anche chiamati rispettivamente minisatelliti e microsatelliti.
L'essenza di questo metodo è l'amplificazione PCR di frammenti di DNA contenenti queste brevi sequenze ripetitive la cui lunghezza è diversa in due individui campionati a caso. Dopo l'amplificazione, la lunghezza dei frammenti ottenuti viene valutata mediante elettroforesi su gel o capillare.
A questo scopo si possono utilizzare il Quantifiler DNA Quantification Kit e il sistema QuantStudio di Termo Fisher Scientific. Il QuantStudio è uno strumento da banco compatto con un'ampia gamma di funzioni.
Come per il metodo precedente, il principale fattore di identificazione del test STR è la lunghezza dei frammenti ottenuti, che è unica per ogni individuo e dipende dal numero di ripetizioni nel sito analizzato. L'analisi STR è caratterizzata da un'elevata accuratezza e velocità, oltre che da un basso costo. La qualità del materiale genetico è una condizione importante per l'analisi.
L'analisi STR è apparsa nella pratica forense quasi vent'anni fa, ma a tutt'oggi rimane il metodo principale per identificare gli individui. I risultati dell'analisi del DNA di sospetti e criminali - i profili genetici - vengono inseriti dai criminologi in speciali database.
Pertanto, quando sulle scene del crimine vengono rinvenute tracce biologiche dalle quali è possibile isolare il DNA, è diventato possibile identificare tutte le persone che sono già state oggetto di attenzione da parte delle forze dell'ordine. Gli stessi marcatori vengono utilizzati per la ricerca di persone scomparse e per stabilire la paternità.
Pertanto, quando sulle scene del crimine vengono rinvenute tracce biologiche dalle quali è possibile isolare il DNA, è diventato possibile identificare tutte le persone che sono già state oggetto di attenzione da parte delle forze dell'ordine. Gli stessi marcatori vengono utilizzati per la ricerca di persone scomparse e per stabilire la paternità.
Di norma, i sistemi progettati per l'identificazione degli individui consentono l'analisi di diversi loci del genoma (10-24) contemporaneamente, tra cui il gene della proteina amelogenina, attraverso il quale viene determinato il sesso. Il gene dell'amelogenina si trova sia sul cromosoma X che sul cromosoma Y, ma ha dimensioni diverse, il che consente di determinare il sesso di una persona.
Grazie all'uso di tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento, la medicina legale ha ottenuto uno strumento efficace che ha aperto nuove opportunità per l'analisi simultanea di più siti (loci) del genoma nucleare e mitocondriale.
Un importante vantaggio di questi metodi è la capacità di distinguere anche i gemelli identici (per mutazioni somatiche), cosa impossibile con l'analisi RFLP o STR.
Grazie all'uso di tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento, la medicina legale ha ottenuto uno strumento efficace che ha aperto nuove opportunità per l'analisi simultanea di più siti (loci) del genoma nucleare e mitocondriale.
Un importante vantaggio di questi metodi è la capacità di distinguere anche i gemelli identici (per mutazioni somatiche), cosa impossibile con l'analisi RFLP o STR.
La seconda parte di questa pubblicazione descriverà come i metodi sopra descritti possano essere utilizzati per identificare laboratori e spacciatori di droga e come sia possibile confondere la polizia scientifica ripulendo le proprie tracce.
Leggi la PARTE II
