Įvadas
L-fenilacetilkarbinolis yra junginys, naudojamas efedrino, kuris pats yra naudojamas kaip amfetaminų pirmtakas, sintezėje. Pramoniniu būdu jis sintetinamas kepimo mielėms (S. cerevisiae/SC) aerobiškai fermentuojant benzaldehidą. Nors procesas gana paprastas, jam gali prireikti šiek tiek įrangos ir žinių, ypač kalbant apie sterilių kultūrų palaikymą ir tinkamas augimo sąlygas. Todėl paaiškinsiu du skirtingo sudėtingumo L-PAC gamybos biotransformacijos būdu metodus. Auginimo terpė prieš naudojimą turėtų būti sterilizuojama autoklavu.
Pirmasis metodas:
Šį metodą būtų galima apibūdinti kaip "netvarkingą, bet lengvą". Jam reikia mažiau įrangos, jis yra paprastesnis, tačiau taip pat mažiau veiksmingas ir dėl jo išeiga bus mažesnė.
Procedūra:
Į 500 ml sterilaus 0,1M pH 6 citrato buferinio tirpalo įpilkite 44 g mielių ir 55 g g gliukozės. Įdėkite į 30 °C temperatūros vandens vonią. Inkubuojama 40/50 minučių.
Įpilkite benzaldehido (25 mmol) į 5 ml etanolio ir acetaldehido (25 mmol). Inkubuokite 60 minučių.
Filtruokite per Celitą.
Ekstrahuokite 3*100 ml etilacetato. Emulsiją suskaidykite soties natrio chlorido tirpalu, išdžiovinkite virš bevandenio natrio sulfato, filtruokite, išgarinkite tirpiklį. Tai yra jūsų L-PAC.
Paaiškinimai:
Citratinis buferis: jis naudojamas stabiliam pH palaikyti, nes ląstelės augimas jį mažina (tai nėra gerai). Norėdami paruošti šį buferį, vadovaukitės šioje skaičiuoklėje pateiktomis procedūromis: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Nepamirškite pakeisti pH į 6.
Temperatūra: užtikrina didesnį mielių medžiagų apykaitos aktyvumą.
Etanolis: naudojamas benzaldehidui ir acetaldehidui ištirpinti ir padidina jų biologinį prieinamumą.
Acetaldehidas: naudojamas kaip vandenilio akceptorius vietoj benzaldehido, taip apribojant benzilo alkoholio gamybą.
Tai lengva procedūra, kurią gali atlikti beveik kiekvienas, šiek tiek paskaitęs apie standartinius sterilius metodus, tačiau gaunama mažesnė išeiga nei kitoje procedūroje (20-40 %). Ją galima pagerinti geriau vėdinant, naudojant orbitinį purtymą 150 aps/min. greičiu arba pumpuojant sterilų orą į terpę, 1 l oro litrui terpės per minutę, arba imobilizuojant ląsteles alginato rutuliukuose. Tai galima rasti youtube, tai labai paprasta ir gali gerokai padidinti derlių.
Antrasis metodas:
Šis protokolas yra sudėtingesnis, tačiau, jei jis atliekamas teisingai, išeiga gali padidėti iki 60 ar 70 %. Tačiau jam reikės daugiau medžiagos. Nors jis nėra tobulas, tačiau yra daug geresnis.
Šis metodas buvo sukurtas mielėms Candida utilis, o ne S. cerevisiae. Vietoj jų galite naudoti SC, tačiau išeiga sumažės. C. utilis galite įsigyti čia: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procedūra
Augimo terpę sudaro 10 g/l karbamido (azoto), 10 g/l MgSO4 (magnio ir sieros) ir nuo 50 iki 70 g/l cukraus (melasa). Ištirpinama atitinkamame 0,1M pH 6 citrato buferinės terpės kiekyje.
Išvakarėse paskiepykite pradinę mielių kultūrą ir inkubuokite 30 °C temperatūroje per naktį.
Nuskaitykite optinį tankį (absorbciją) esant 595 nm. Inokuliuokite fermentacijos reaktorių 15 % v/v pradinės kultūros, sureguliuotos iki 0,4 OD. Pavyzdys: norint užkrėsti 1 l talpyklą, jei buvo išmatuotas 0,2 OD, į 700 ml įpilkite 300 ml. Jei OD jau yra 0,4, į 850 ml įpilkite 150 ml ir t. t. (240x106 ląstelių/ml inokuliate, žr. paaiškinimus).
Inkubuokite 30 °C temperatūroje, kratydami orbitiniu būdu 150 apsukų per minutę greičiu arba pumpuodami sterilų orą 1 v/v/min greičiu. Jei siurbiate orą, galbūt norėsite lėtai maišyti.
Inkubuokite, kol OD pasieks 0,3-0,4. Tai turėtų užtrukti 4-6 valandas, gali būti ir mažiau, ir daugiau. Kas 30 minučių tikrinkite OD, kol pasieksite norimą vertę.
Benzaldehidas pridedamas keliomis dozėmis. 50 ml tirpalo tūris yra 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Tuo pačiu metu įpilkite lygiavertį acetaldehido tūrį. Tarp kiekvieno papildymo palaukite vieną valandą.
Ekstrahuokite naudodami 1:2 tolueną ir mediumą v/v, išgarinkite.
Paaiškinimas:
Optinis tankis: matuojamas spektrofotometru. Čia nuskaitome absorbciją 595 nm, kuri yra proporcinga ląstelių skaičiui tirpale. Kaip taisyklę, atminkite, kad 0,1 OD=60x10^6 ląstelių/ml
Bendrosios pastabos:
Aeracijai mažais kiekiais geriau naudoti orbitinį purtymą 150 aps/min greičiu. Didesniu mastu reikės burbuliuoti per filtrą praleidžiamą orą.
Antrajame protokole benzaldehidas pridedamas keliomis dozėmis, kad padidėtų išeiga. Tai galima dar labiau pagerinti nuolat mažėjančiu greičiu švirkščiant benzaldehidą, tačiau mėgėjiškai tai padaryti sudėtinga.
Galima naudoti pakeistus benzaldehidus ir gauti atitinkamą L-PAC analogą.
Galiausiai galite pasiskolinti kai kuriuos 2 metodo elementus ir įtraukti juos į 1 metodą, kad galėtumėte pritaikyti eksperimentinį planą pagal savo poreikius. Žinokite, kad galima naudoti kitas padermes ir rūšis, taip gerokai padidinant išeigą. Daugiau informacijos žr. Ravi et al. straipsnyje "L-fenil acetil karbinolio (L-PAC) gamyba naudojant skirtingus naujus mielių štamus melasoje ir cukranendrių sultyse kaip gamybos terpėje".
L-fenilacetilkarbinolis yra junginys, naudojamas efedrino, kuris pats yra naudojamas kaip amfetaminų pirmtakas, sintezėje. Pramoniniu būdu jis sintetinamas kepimo mielėms (S. cerevisiae/SC) aerobiškai fermentuojant benzaldehidą. Nors procesas gana paprastas, jam gali prireikti šiek tiek įrangos ir žinių, ypač kalbant apie sterilių kultūrų palaikymą ir tinkamas augimo sąlygas. Todėl paaiškinsiu du skirtingo sudėtingumo L-PAC gamybos biotransformacijos būdu metodus. Auginimo terpė prieš naudojimą turėtų būti sterilizuojama autoklavu.
Pirmasis metodas:
Šį metodą būtų galima apibūdinti kaip "netvarkingą, bet lengvą". Jam reikia mažiau įrangos, jis yra paprastesnis, tačiau taip pat mažiau veiksmingas ir dėl jo išeiga bus mažesnė.
Procedūra:
Į 500 ml sterilaus 0,1M pH 6 citrato buferinio tirpalo įpilkite 44 g mielių ir 55 g g gliukozės. Įdėkite į 30 °C temperatūros vandens vonią. Inkubuojama 40/50 minučių.
Įpilkite benzaldehido (25 mmol) į 5 ml etanolio ir acetaldehido (25 mmol). Inkubuokite 60 minučių.
Filtruokite per Celitą.
Ekstrahuokite 3*100 ml etilacetato. Emulsiją suskaidykite soties natrio chlorido tirpalu, išdžiovinkite virš bevandenio natrio sulfato, filtruokite, išgarinkite tirpiklį. Tai yra jūsų L-PAC.
Paaiškinimai:
Citratinis buferis: jis naudojamas stabiliam pH palaikyti, nes ląstelės augimas jį mažina (tai nėra gerai). Norėdami paruošti šį buferį, vadovaukitės šioje skaičiuoklėje pateiktomis procedūromis: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Nepamirškite pakeisti pH į 6.
Temperatūra: užtikrina didesnį mielių medžiagų apykaitos aktyvumą.
Etanolis: naudojamas benzaldehidui ir acetaldehidui ištirpinti ir padidina jų biologinį prieinamumą.
Acetaldehidas: naudojamas kaip vandenilio akceptorius vietoj benzaldehido, taip apribojant benzilo alkoholio gamybą.
Tai lengva procedūra, kurią gali atlikti beveik kiekvienas, šiek tiek paskaitęs apie standartinius sterilius metodus, tačiau gaunama mažesnė išeiga nei kitoje procedūroje (20-40 %). Ją galima pagerinti geriau vėdinant, naudojant orbitinį purtymą 150 aps/min. greičiu arba pumpuojant sterilų orą į terpę, 1 l oro litrui terpės per minutę, arba imobilizuojant ląsteles alginato rutuliukuose. Tai galima rasti youtube, tai labai paprasta ir gali gerokai padidinti derlių.
Antrasis metodas:
Šis protokolas yra sudėtingesnis, tačiau, jei jis atliekamas teisingai, išeiga gali padidėti iki 60 ar 70 %. Tačiau jam reikės daugiau medžiagos. Nors jis nėra tobulas, tačiau yra daug geresnis.
Šis metodas buvo sukurtas mielėms Candida utilis, o ne S. cerevisiae. Vietoj jų galite naudoti SC, tačiau išeiga sumažės. C. utilis galite įsigyti čia: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Procedūra
Augimo terpę sudaro 10 g/l karbamido (azoto), 10 g/l MgSO4 (magnio ir sieros) ir nuo 50 iki 70 g/l cukraus (melasa). Ištirpinama atitinkamame 0,1M pH 6 citrato buferinės terpės kiekyje.
Išvakarėse paskiepykite pradinę mielių kultūrą ir inkubuokite 30 °C temperatūroje per naktį.
Nuskaitykite optinį tankį (absorbciją) esant 595 nm. Inokuliuokite fermentacijos reaktorių 15 % v/v pradinės kultūros, sureguliuotos iki 0,4 OD. Pavyzdys: norint užkrėsti 1 l talpyklą, jei buvo išmatuotas 0,2 OD, į 700 ml įpilkite 300 ml. Jei OD jau yra 0,4, į 850 ml įpilkite 150 ml ir t. t. (240x106 ląstelių/ml inokuliate, žr. paaiškinimus).
Inkubuokite 30 °C temperatūroje, kratydami orbitiniu būdu 150 apsukų per minutę greičiu arba pumpuodami sterilų orą 1 v/v/min greičiu. Jei siurbiate orą, galbūt norėsite lėtai maišyti.
Inkubuokite, kol OD pasieks 0,3-0,4. Tai turėtų užtrukti 4-6 valandas, gali būti ir mažiau, ir daugiau. Kas 30 minučių tikrinkite OD, kol pasieksite norimą vertę.
Benzaldehidas pridedamas keliomis dozėmis. 50 ml tirpalo tūris yra 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Tuo pačiu metu įpilkite lygiavertį acetaldehido tūrį. Tarp kiekvieno papildymo palaukite vieną valandą.
Ekstrahuokite naudodami 1:2 tolueną ir mediumą v/v, išgarinkite.
Paaiškinimas:
Optinis tankis: matuojamas spektrofotometru. Čia nuskaitome absorbciją 595 nm, kuri yra proporcinga ląstelių skaičiui tirpale. Kaip taisyklę, atminkite, kad 0,1 OD=60x10^6 ląstelių/ml
Bendrosios pastabos:
Aeracijai mažais kiekiais geriau naudoti orbitinį purtymą 150 aps/min greičiu. Didesniu mastu reikės burbuliuoti per filtrą praleidžiamą orą.
Antrajame protokole benzaldehidas pridedamas keliomis dozėmis, kad padidėtų išeiga. Tai galima dar labiau pagerinti nuolat mažėjančiu greičiu švirkščiant benzaldehidą, tačiau mėgėjiškai tai padaryti sudėtinga.
Galima naudoti pakeistus benzaldehidus ir gauti atitinkamą L-PAC analogą.
Galiausiai galite pasiskolinti kai kuriuos 2 metodo elementus ir įtraukti juos į 1 metodą, kad galėtumėte pritaikyti eksperimentinį planą pagal savo poreikius. Žinokite, kad galima naudoti kitas padermes ir rūšis, taip gerokai padidinant išeigą. Daugiau informacijos žr. Ravi et al. straipsnyje "L-fenil acetil karbinolio (L-PAC) gamyba naudojant skirtingus naujus mielių štamus melasoje ir cukranendrių sultyse kaip gamybos terpėje".
