Mefedronas (4-metilmetkatinonas) yra β-ketoamfetamino stimuliuojanti narkotinė medžiaga, turinti daug struktūrinių ir mechaninių panašumų į metamfetaminą. Vienas iš stipriausių su mefedronu siejamų poveikių yra gebėjimas skatinti dopamino (DA) išsiskyrimą ir blokuoti jo atgalinį sugrąžinimą sąveikaujant su dopamino pernešėju (DAT). Nors mefedronas nesukelia toksiškumo DA nervų galūnėlėms, jo gebėjimas veikti kaip DAT blokatorius galėtų apsaugoti nuo metamfetamino sukelto neurotoksiškumo, kaip ir kiti DAT inhibitoriai. Siekiant patikrinti šią galimybę, pelės buvo gydomos mefedronu (10, 20 arba 40 mg/kg) prieš kiekvieną neurotoksinio metamfetamino injekciją (4 injekcijos po 2,5 arba 5,0 mg/kg 2 val. intervalais). Striatumo DA nervinių galūnių vientisumas buvo vertinamas nustatant DA, DAT ir tirozino hidroksilazės kiekį. Vidutinio ir stipraus DA toksiškumo, susijusio su skirtingomis metamfetamino dozėmis, neišvengė nė viena mefedrono dozė, o atvirkščiai - jis buvo gerokai didesnis. Hipertermija, kurią sukėlė kombinuotas gydymas mefedronu ir metamfetaminu, buvo tokia pati, kaip ir po vieno ar kito vaisto vartojimo. Mefedronas taip pat sustiprino neurotoksinį amfetamino ir MDMA poveikį DA nervų galūnėlėms. Priešingai, nomifenzinas apsaugojo nuo metamfetamino sukelto neurotoksiškumo. Kadangi mefedronas didina metamfetamino neurotoksiškumą, šie rezultatai rodo, kad jis sąveikauja su DAT kitaip nei kiti tipiški DAT inhibitoriai. Santykinai nekenksmingas vien tik mefedrono poveikis DA nervų galūnėlėms slepia potencialiai pavojingą sąveiką su narkotikais, kurie dažnai vartojami kartu su juo, todėl padidėja neurotoksiškumas.
Mefedronas (4-metilmetkatinonas) yra katinono darinys ir struktūrinis metamfetamino bei 3,4-metilendioksi-metamfetamino (MDMA) analogas. Mefedronas yra viena iš "vonios druskų" psichoaktyviųjų sudedamųjų dalių kartu su kitais junginiais, tokiais kaip metilonas, butilonas ir 3,4-metilendioksipirovaleronas (MDPV). β-ketoamfetaminais piktnaudžiaujama vis dažniau ir neatsitiktinai dėl to, kad metamfetamino ir MDMA sintezei reikalingų pirmtakų prieinamumas slaptose laboratorijose yra labai ribotas ir atitinkamai mažėja jų grynumas (Winstock et al. 2011b, Brunt et al. 2011). Piktnaudžiavimui β-ketoamfetaminais vis didėjant, jų nepageidaujamo poveikio sąrašas išsiplėtė ir apima širdies ir kraujagyslių sistemos komplikacijas, sujaudinimą, nemigą, psichozę ir depresiją (Schifano et al. 2011, Prosser ir Nelson 2012).
Kadangi β-ketoamfetaminai yra metamfetamino ir MDMA cheminiai giminaičiai, nenuostabu, kad jų poveikis centrinei nervų sistemai yra toks pat, kaip ir šių pirmųjų narkotikų. Pavyzdžiui, šie narkotikai blokuoja dopamino (DA) ir serotonino (5-HT) pernešėjus (atitinkamai DAT ir SERT) (Cozzi et al. 1999, Rothman et al. 2003, Fleckenstein et al. 2000, Lopez-Arnau et al. 2012) ir skatina monoamino išsiskyrimą in vitro (Kalix ir Glennon 1986, Gygi et al. 1997, Rothman et al. 2003) ir in vivo (Gygi et al. 1997, Kehr et al. 2011). Metkatinonas sukelia nuolatinį triptofano hidroksilazės ir tirozino hidroksilazės (TH) aktyvumo sumažėjimą ir DA bei 5-HT išeikvojimą (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). Metkatinono abstinentų PET vaizdavimo tyrimai atskleidė sumažėjusį striatinio DAT tankį, rodantį DA terminalų netekimą (McCann ir kt. 1998). Vienu metu vykstantis DA išsiskyrimo stimuliavimas ir jo pasisavinimo slopinimas atspindi kritinius elementus, kuriais grindžiamas su metamfetaminu siejamas neurotoksiškumas (Kuhn et al. 2008, Yamamoto ir Bankson 2005, Cadet et al. 2007, Fleckenstein et al. 2007).
Mes (Angoa-Perez et al. 2012) ir kiti (Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011) neseniai tyrėme galimybę, kad mefedronas gali sukelti neurotoksiškumą kaip metamfetaminas ir MDMA. Keista, kad mefedronas nebuvo toksiškas striatumo DA nervų galūnėlėms (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Klausimas, ar mefedronas pažeidžia 5-HT nervų galūnes, lieka neišspręstas, nes viename tyrime užfiksuotas teigiamas poveikis (Hadlock et al. 2011), o kitame - neigiamas (Baumann et al. 2012). Atsižvelgdami į santykinai švelnų mefedrono poveikį DA nervų galūnėms ir į jo, kaip DAT blokatoriaus, savybes, iškėlėme hipotezę, kad jis iš tikrųjų gali apsaugoti DA neuronų sistemą nuo neurotoksinio metamfetamino poveikio, kaip tai, kaip žinoma, vyksta su kitais DAT blokatoriais, pavyzdžiui, amfoneline rūgštimi (Pu ir kt. 1994, Schmidt ir Gibb 1985, Marek ir kt. 1990) ir nomifenzinu (Poth ir kt. 2012). Šiuo metu pranešame, kad mefedronas reikšmingai sustiprina metamfetamino neurotoksiškumą. Šis poveikis apima ir amfetaminą bei MDMA - narkotikus, kurie dažnai vartojami kartu su mefedronu (Feyissa ir Kelly 2008, Schifano ir kt. 2011). Šie netikėti rezultatai piktnaudžiavimą mefedronu iškelia į naują šviesą ir skatina skubiai pripažinti šią subtilią ir pavojingą šio β-ketoamfetamino savybę.
Medžiaga ir metodai
Narkotikai ir reagentai
Mefedrono hidrochloridas ir 3,4-metilendioksimetamfetaminas (MDMA) buvo gauti iš NIDA mokslinių tyrimų išteklių narkotikų tiekimo programos. (+) Metamfetamino hidrochloridas, nomifenzino maleatas, d-amfetamino sulfatas, pentobarbitalis, DA ir visi buferiai bei HPLC reagentai buvo įsigyti iš "Sigma-Aldrich" (St. Louis, MO, JAV). Bicinchonino rūgšties baltymų analizės rinkiniai buvo įsigyti iš Pierce (Rockford, IL, JAV). Polikloniniai antikūnai prieš žiurkių TH buvo pagaminti, kaip aprašyta anksčiau (Kuhn ir Billingsley 1987). Monokloninius antikūnus prieš žiurkių DAT dosniai suteikė Dr. Roxanne A. Vaughan (Šiaurės Dakotos universitetas, Grand Forks, ND, JAV). HRP konjuguotus antrinius anti-IgG antikūnus parūpino Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA, JAV).
Gyvūnai
C57BL/6 pelių patelės (Harlan, Indianapolis, IN, JAV), eksperimento metu svėrusios 20-25 g, buvo laikomos po 5 narveliuose didelėse batų dėžutėse šviesioje (12 val. šviesa/tamsus paros metas) ir temperatūros kontroliuojamoje patalpoje. Buvo naudojamos pelių patelės, nes žinoma, kad jos labai jautrios neurotoksinių amfetaminų sukeliamiems neuronų pažeidimams, ir siekiant išlaikyti nuoseklumą su mūsų ankstesniais metamfetamino neurotoksiškumo tyrimais (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Pelės galėjo laisvai gauti maisto ir vandens. Wayne State universiteto institucinis priežiūros ir naudojimo komitetas patvirtino gyvūnų priežiūrą ir eksperimentines procedūras. Visos procedūros taip pat atitiko NIH laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovą.
Farmakologinės, fiziologinės ir elgesio procedūros
Pelės buvo gydomos mefedronu, taikant į svaiginimąsi panašų režimą, kurį sudarė 4 injekcijos po 10, 20 arba 40 mg/kg su 2 val. pertrauka tarp kiekvienos injekcijos. Toks gydymo režimas, kai švirkščiant pakaitinius amfetaminus ir katinono darinius, sukelia didelį DA nervų galūnių pažeidimą. Anksčiau įrodyta, kad šiuo metu naudojamos mefedrono dozės nėra toksiškos DA nervų galūnėlėms (Angoa-Perez ir kt. 2012). Pelės buvo gydomos metamfetaminu (4X 2,5 arba 5 mg/kg), amfetaminu (4X 5 mg/kg) arba MDMA (4X 20 mg/kg) atskirai arba kartu su mefedronu. Kai pelės buvo gydomos dviem narkotikais, prieš 30 min. iki kiekvienos iš 4 metamfetamino, amfetamino ar MDMA injekcijų joms buvo sušvirkšta mefedrono injekcija. Kontrolinėms pelėms buvo sušvirkšta fiziologinio fiziologinio tirpalo pagal tą patį grafiką, kuris buvo taikomas mefedronui vienam arba kartu su kitais amfetaminais. Kontroliuojant DAT inhibitoriaus poveikį metamfetamino toksiškumui, pelėms 30 min. prieš kiekvieną metamfetamino (4X 5 mg/kg) injekciją buvo suleista nomifenzino (4X 5 mg/kg). Visos injekcijos buvo atliekamos i.p. būdu. Pelės buvo paaukotos praėjus 2 dienoms po paskutinio gydymo vaistais, kai su amfetaminu susijęs neurotoksiškumas buvo didžiausias. Kūno temperatūra buvo stebima telemetriniu būdu naudojant "Bio Medic Data Systems, Inc." (Seaford, DE, JAV) implantuojamus temperatūros atsakiklius IPTT-300. Temperatūra neinvaziniu būdu buvo fiksuojama kas 20 min., pradedant 60 min. prieš pirmąją METH injekciją ir tęsiant 9 val. po jos, naudojant "Bio Medic" konsolinę sistemą DAS-5001.
Striatinio DA kiekio nustatymas
Po gydymo striatinis audinys buvo išpjautas abipus smegenų ir laikomas -80 °C temperatūroje. Sušaldyti audiniai buvo pasverti ir 4 °C temperatūroje sonikuoti 10 tūrio 0,16 N perchloro rūgšties tirpale. Netirpūs baltymai buvo pašalinti centrifuguojant, o DA nustatytas HPLC su elektrochemine detekcija, kaip anksčiau aprašyta metamfetaminui (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
TH ir DAT baltymų kiekio nustatymas imunoblotingo metodu
Gydymo vaistais poveikis striatinio TH ir DAT lygiui buvo nustatytas imunoblotingo metodu kaip toksiškumo striatinio DA nervų galūnėlėms rodiklis. Po gydymo pelės buvo nužudytos nukertant galvą ir striatumas buvo išpjautas abipus. Audiniai buvo laikomi -80 °C temperatūroje. Užšaldytas audinys buvo suardytas sonikuojant 1 % SDS 95 °C temperatūroje, o netirpi medžiaga nusodinta centrifuguojant. Baltymai buvo nustatyti bikinchonino rūgšties metodu, o vienodi baltymų kiekiai (70 μg/l) buvo išskirti SDS-poliakrilamidinio gelio elektroforezės metodu ir po to elektrolitiniu būdu perkelti į nitroceliuliozę. Blotai 1 val. kambario temperatūroje buvo blokuojami Triso buferiniame druskos tirpale, kuriame yra Tween 20 (0,1 % v/v) ir 5 % neriebaus sauso pieno. Pirminiai antikūnai prieš TH (1:1000) arba DAT (1:1000) buvo pridėti prie dėmių ir palikti inkubuoti 16 val. 4 °C temperatūroje. Blotai buvo 3 kartus nuplauti Tris buferiniu fiziologiniu tirpalu, kad būtų pašalinti nesureagavę antikūnai, tada 1 val. kambario temperatūroje inkubuoti su HRP konjuguotu antriniu anti-IgG antikūnu (1:4000). Imunoreaktyvios juostos buvo vizualizuotos sustiprinta chemiluminescencija, o santykinis TH ir DAT reaguojančių juostų tankis buvo nustatytas vaizduojant "Kodak Image Station" ("Carestream Molecular Systems", Ročesteris, Niujorko valstija, JAV) ir kiekybiškai įvertintas naudojant "ImageJ" programinę įrangą (NIH).
Duomenų analizė
Analizuojant metamfetamino ir mefedrono dozių poveikį DA, DAT ir TH, buvo atliktos dvipusės ANOVA analizės. Gydymo vaistais poveikis striatinio DA, TH ir DAT kiekiui buvo tikrinamas reikšmingumas taikant vienakryptę ANOVA, po kurios sekė Tukey daugkartinio palyginimo testas. Gydymo vaistais rezultatai dėl šerdinės kūno temperatūros laikui bėgant buvo analizuojami taikant dvipusę ANOVA, po kurios atliktas Bonferroni testas, siekiant nustatyti temperatūros skirtumų reikšmingumą atskirais laikotarpiais po gydymo. Skirtumai buvo laikomi reikšmingais, jei p < 0,05. Visos statistinės analizės atliktos naudojant "GraphPad Prism" 5.02 versiją "Windows" ("GraphPad Software", San Diegas, Kalifornija, JAV, www.graphpad.com).
Eikite į: 1:
Rezultatai
Mefedrono poveikis metamfetamino sukeltam neurotoksiškumui
Mefedrono, kurio dozės (10, 20 arba 40 mg/kg), kaip žinoma, nesukelia toksinio poveikio DA nervų galūnėms (Angoa-Perez et al. 2012), buvo suleista 30 min. prieš kiekvieną metamfetamino injekciją. Metamfetaminas buvo skiriamas dozėmis, kurios sukelia vidutinio sunkumo (4X 2,5 mg/kg) arba sunkų (4X 5 mg/kg) striatumo DA nervinių galūnių pažeidimą (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). Iš 1 pav. pateiktų rezultatų matyti, kad metamfetamino dozės (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) ir mefedrono dozės (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) pagrindinis poveikis DA kiekiui striatume buvo labai reikšmingas taikant dvipusę ANOVA. Pagrindinis mefedrono, duodamo kartu su 2,5 mg/kg (F4,22 = 35,96, p < 0,001) arba 5,0 mg/kg metamfetamino (F4,17 = 953,9, p < 0,0001), poveikis taip pat buvo labai reikšmingas taikant vienakryptę ANOVA. Visi gydymo bet kuria metamfetamino ± mefedrono doze atvejai sukėlė reikšmingai didesnį DA sumažėjimą, palyginti su atitinkama kontrole (visų atvejų p < 0,0001). Iš 1 pav. taip pat matyti, kad 20 (p < 0,01) ir 40 mg/kg (p < 0,001) mefedrono dozės reikšmingai sustiprino 2,5 mg/kg metamfetamino DA mažinantį poveikį, tuo tarpu visos mefedrono dozės reikšmingai sustiprino 5,0 mg/kg metamfetamino poveikį DA kiekiui (p < 0,0001 visoms).
1 pav.
Mefedrono poveikis metamfetamino sukeltam striatinio DA sumažėjimui. Pelės buvo apdorotos nurodytomis mefedrono (MEPH) dozėmis 30 min. prieš kiekvieną 2,5 (-) arba 5,0 mg/kg (■) metamfetamino (METH) injekciją ir po 2 d. paaukotos, kad HPLC metodu būtų nustatytas striatinio DA kiekis. Duomenys yra 5-7 pelių iš kiekvienos grupės vidurkis ± SEM. Kai kurios paklaidos juostos buvo per mažos, kad viršytų simbolių dydį, todėl jų nesimato. ***p < 0,001, palyginti su kontroline grupe, ir #p < 0,01, ##p < 0,001 arba ###p < 0,0001, palyginti su atitinkama metamfetamino doze (Tukey daugkartinio palyginimo testas).
2a pav. parodyta, kad mefedronas reikšmingai padidino metamfetamino sukeltą DAT koncentracijos sumažėjimą, nustatytą imunoblotingo metodu. Imunoblotai buvo kiekybiškai įvertinti ir, sutinkamai su DA rezultatais, metamfetamino dozės (F1,92 = 9,48, p < 0,001) ir mefedrono dozės (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) pagrindinis poveikis DAT kiekiui striatume buvo labai reikšmingas taikant dvipusę ANOVA (2b pav.). Pagrindinis mefedrono, duodamo kartu su 2,5 mg/kg (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) arba 5,0 mg/kg metamfetamino (F4,39 = 24,84, p < 0,0001), poveikis taip pat buvo labai reikšmingas taikant vienakryptę ANOVA. Visi gydymo būdai bet kuria metamfetamino ± mefedrono doze sukėlė reikšmingai didesnį DAT sumažėjimą, palyginti su atitinkama kontrole (p < 0,01 vien tik 2,5 mg/kg metamfetamino; p < 0,0001 visų kitų gydymo būdų atveju). Iš 2b pav. taip pat matyti, kad 20 mg/kg (p < 0,01) ir 40 mg/kg (p < 0,001) mefedrono dozės reikšmingai sustiprino 2,5 mg/kg metamfetamino sukeltą DAT sumažėjimą, o tik 40 mg/kg mefedrono dozė reikšmingai sustiprino (p < 0,01) 5,0 mg/kg metamfetamino poveikį DAT sumažėjimui.
2 pav.
Mefedrono poveikis metamfetamino sukeltam striatinio DAT sumažėjimui. Pelės buvo apdorotos nurodytomis mefedrono (MEPH) dozėmis 30 min. prieš kiekvieną 2,5 (●) arba 5,0 mg/kg (■) metamfetamino (METH) injekciją ir po 2 d. paaukotos, kad būtų galima nustatyti striatinio DAT kiekį imunoblotingo metodu (a). Dėmelės buvo kiekybiškai įvertintos naudojant "ImageJ", o duomenys yra 10-12 pelių iš kiekvienos grupės vidurkis ± SEM (b). *p < 0,01 arba ***p < 0,0001, palyginti su kontrole (C), ir #p < 0,01 arba ##p < 0,001, palyginti su atitinkama metamfetamino doze (Tukey daugkartinio palyginimo testas).
3a pav. parodyta, kad mefedronas reikšmingai padidino metamfetamino sukeltą TH kiekio sumažėjimą, kaip nustatyta imunoblotingo metodu. Imunoblotai buvo kiekybiškai įvertinti ir, sutinkamai su pirmiau pateiktais DA ir DAT rezultatais, metamfetamino dozės (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) ir mefedrono dozės (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) pagrindiniai poveikiai buvo labai reikšmingi taikant dvipusę ANOVA (3b pav.). Pagrindinis mefedrono, duodamo kartu su 2,5 mg/kg (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) arba 5,0 mg/kg metamfetamino (F4,49 = 99,16, p < 0,0001), poveikis taip pat buvo labai reikšmingas taikant vienakryptę ANOVA. Visi gydymo būdai bet kuria metamfetamino ± mefedrono doze sukėlė reikšmingai didesnį TH sumažėjimą, palyginti su atitinkama kontrole (p < 0,001 2,5 mg/kg metamfetamino + 10 mg/kg mefedrono; p < 0,0001 visų kitų derinių atveju), išskyrus vien tik 2,5 mg/kg metamfetamino, kuris reikšmingai nepakeitė TH kiekio (t. y. toksiškumo nebuvo). Iš 3b pav. taip pat matyti, kad 20 mg/kg (p < 0,01) ir 40 mg/kg (p < 0,001) mefedrono dozės reikšmingai sustiprino 2,5 mg/kg metamfetamino sukeltą TH sumažėjimą, o visos trys mefedrono dozės reikšmingai (p < 0,0001) sustiprino 5,0 mg/kg metamfetamino poveikį TH sumažėjimui.
3 pav.
Mefedrono poveikis metamfetamino sukeltam striatinio TH sumažėjimui. Pelės buvo apdorotos nurodytomis mefedrono (MEPH) dozėmis 30 min. prieš kiekvieną 2,5 (●) arba 5,0 mg/kg (■) metamfetamino (METH) injekciją ir po 2 d. paaukotos, kad būtų galima nustatyti TH kiekį striatose imunoblotingo metodu (a). Dėmelės buvo kiekybiškai įvertintos naudojant "ImageJ", o duomenys yra 10-12 pelių iš kiekvienos grupės vidurkis ± SEM (b). Kai kurios paklaidos juostos buvo per mažos, kad viršytų simbolių dydį, todėl jų nesimato. **p < 0,001 arba ***p < 0,0001, palyginti su kontrole (C), ir #p < 0,01, ##p < 0,001 arba ####p < 0,0001), palyginti su atitinkama metamfetamino doze (Tukey daugkartinio palyginimo testas).
Mefedrono poveikis metamfetamino sukeltai hipertermijai
Mefedronas, kaip ir metamfetaminas, sukelia didelę hipertermiją (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Kai mefedrono buvo suleista 30 min. prieš kiekvieną metamfetamino injekciją, 4 pav. matyti, kad metamfetamino ir mefedrono dozių (F1,300 = 11,99, p < 0,0001) pagrindinis poveikis laikui (F4,300 = 51,73, p < 0,0001) buvo labai reikšmingas taikant dvipusę ANOVA. Pagrindiniai mefedrono, duodamo kartu su 2,5 mg/kg metamfetamino (F4,120 = 41,44, p < 0,0001, a skydelis) per tam tikrą laiką (F30,120 = 3,84, p < 0,0001) arba 5,0 mg/kg metamfetamino (F4,120 = 78,09, p < 0,0001, b skydelis) per tam tikrą laiką (F30,120 = 9,98, p < 0,0001), poveikiai taip pat buvo labai reikšmingi taikant dvipusę ANOVA. Visi gydymo bet kuria metamfetamino ± mefedrono doze būdai reikšmingai skyrėsi nuo atitinkamų kontrolinių (p < 0,0001 visiems gydymo būdams).
4 pav.
Mefedrono poveikis metamfetamino sukeltai hipertermijai. Pelės buvo gydomos nurodytomis mefedrono (MEPH) dozėmis 30 min. prieš kiekvieną 2,5 (a) arba 5,0 mg/kg (b) metamfetamino (METH) injekciją. Šerdies temperatūra buvo matuojama 20 min. intervalais telemetriniu būdu, pradedant 60 min. prieš pirmąją metamfetamino injekciją. Keturios metamfetamino injekcijos pažymėtos rodyklėmis, esančiomis ant x ašies. Duomenys išreikšti kaip 6-8 pelių kūno temperatūros vidurkis kiekvienoje grupėje. SEM visada buvo < 10 % vidurkio ir aiškumo dėlei nepateikiami.
Mefedrono poveikis amfetamino ir MDMA sukeltam neurotoksiškumui
Siekiant patikrinti, ar mefedrono stiprinamasis poveikis metamfetaminui gali būti taikomas ir kitiems neurotoksiškiems amfetaminams, pelės buvo gydomos šiuo β-ketoamfetaminu (20 mg/kg) ir amfetaminu (4X 5 mg/kg) arba MDMA (4X 20 mg/kg), o rezultatai pateikti 5 pav. Prisiminkime, kad pats mefedronas nesumažina striatinio DA, DAT ar TH (Angoa-Perez ir kt. 2012). Pagrindinis vaisto poveikis (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) buvo labai reikšmingas taikant vienpusę ANOVA DA sumažėjimui (5a pav.). Iš 5a pav. taip pat matyti, kad visi gydymo amfetaminu (p < 0,001) arba MDMA (p < 0,001) atskirai arba kartu su mefedronu (p < 0,0001 abiem narkotikams) būdai reikšmingai sumažino DA kiekį, palyginti su kontroliniu. Mefedronas reikšmingai padidino amfetamino (p < 0,01) arba MDMA (p < 0,01) sukeltą DA sumažėjimą. 5b pav. parodytas panašus kombinuotų vaistų gydymo poveikis DAT lygiui striatume. Pagrindinis vaisto poveikis (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) buvo labai reikšmingas taikant vienpusę ANOVA DAT. Iš 5b pav. taip pat matyti, kad visų gydymo amfetaminu arba MDMA atvejų DAT kiekis buvo reikšmingai (p < 0,0001 visiems) mažesnis, palyginti su kontrole. Mefedronas taip pat reikšmingai padidino amfetamino arba MDMA sukeltą DAT sumažėjimą (p < 0,0001 abiem atvejais). Galiausiai 5c pav. matyti, kad pagrindinis vaisto poveikis (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) buvo labai reikšmingas taikant vienakryptę ANOVA TH sumažėjimui. Iš 5c pav. taip pat matyti, kad visų gydymo amfetaminu arba MDMA atvejų TH buvo reikšmingai (visais atvejais p < 0,0001) mažesnis, palyginti su kontrole. Mefedronas taip pat reikšmingai padidino amfetamino arba MDMA sukeltą TH sumažėjimą (abiem atvejais p < 0,0001).
5 pav.
Mefedrono poveikis amfetamino arba MDMA sukeltam DA nervinių galūnių neurotoksiškumui. Pelės buvo apdorotos 20 mg/kg mefedrono (MEPH) 30 min. prieš kiekvieną 5,0 mg/kg amfetamino (AMPH) arba 20 mg/kg MDMA injekciją ir 2d. po gydymo paaukotos, kad HPLC metodu būtų nustatytas a) DA kiekis striatose. (b) DAT ir (c) TH buvo nustatyti imunoblotingo būdu, o dėmės kiekybiškai įvertintos naudojant ImageJ. Reprezentatyvūs DAT ir TH imunoblotai pateikti kaip įdėklai atitinkamai b ir c paveikslėliuose, o abiejų paveikslėlių gydymo būdai pažymėti: 1,5 - kontrolė; 2,6 - MEPH; 3 - AMPH; 4 - AMPH + MEPH; 7 - MDMA ir 8 - MDMA + MEPH. Duomenys yra 5-12 pelių vidurkis ± SEM kiekvienoje grupėje. **p < 0,001 arba ***p < 0,0001, palyginti su kontrole, ir #p < 0,01 arba ###p < 0,0001, palyginti su AMPH arba MDMA (Tukey'o daugkartinio palyginimo testas).
Nomifenzino poveikis metamfetamino sukeltam neurotoksiškumui
Nomifenzinas, stiprus DAT blokatorius, kurio piktnaudžiavimo ar neurotoksiškumo potencialas nėra žinomas, buvo ištirtas dėl jo gebėjimo apsaugoti nuo metamfetamino sukelto neurotoksiškumo ir kontrasto su mefedrono poveikiu metamfetamino, amfetamino ir MDMA sukeltam DA nervinių galūnių toksiškumui. Iš 6a pav. pateiktų rezultatų matyti, kad pagrindinis vaisto poveikis (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) DA kiekiui buvo labai reikšmingas taikant vienakryptę ANOVA. Vien tik nomifenzinas DA kiekio nekeitė, tačiau metamfetamino (p < 0,0001) sukeltą sumažėjimą šiek tiek, bet reikšmingai pakeitė nomifenzinas (p < 0,01). Pagrindinis vaisto poveikis (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) DAT kiekiui buvo labai reikšmingas taikant vienpusę ANOVA, kaip parodyta 6b pav. Nomifenzinas nekeitė DAT lygio, tačiau reikšmingai apsaugojo (p < 0,001) nuo metamfetamino (p < 0,0001) sukelto striatinio DAT sumažėjimo, palyginti su kontrole. Galiausiai 6c pav. matyti, kad pagrindinis vaisto poveikis (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) TH kiekiui buvo labai reikšmingas taikant vienakryptę ANOVA. Kaip ir DA bei DAT atveju, metamfetamino (p < 0,0001) sukeltą TH sumažėjimą šiek tiek, bet reikšmingai slopino nomifenzinas (p < 0,01).
6 pav.
Nomifenzino poveikis metamfetamino sukeltam DA nervinių galūnių neurotoksiškumui. Pelės buvo apdorotos 5,0 mg/kg nomifenzino (NOM) 30 min. prieš kiekvieną 5,0 mg/kg metamfetamino (METH) injekciją ir po 2 d. paaukotos, kad HPLC metodu būtų nustatytas a) DA kiekis striatose. (b) DAT ir (c) TH buvo nustatyti imunoblotingo būdu, o dėmės kiekybiškai įvertintos naudojant ImageJ. Reprezentatyvūs DAT ir TH imunoblotai pateikti kaip b ir c skydelių intarpai. Duomenys yra 5-7 pelių iš kiekvienos grupės vidurkis plius SEM. ***p < 0,0001, palyginti su kontrole (C), ir #p < 0,01 arba ##p < 0,001, palyginti su vien tik metamfetaminu (Tukey daugkartinio palyginimo testas).
Aptarimas
Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti, ar mefedronas užkirs kelią metamfetamino sukeltam DA nervinių galūnių toksiškumui. Remiantis jo cheminiu panašumu į metamfetaminą ir MDMA, iš pradžių buvo tikimasi, kad mefedronas darys žalingą poveikį DA neuronų sistemai. Tačiau keliuose tyrimuose beveik vienu metu nustatyta, kad mefedronas nėra toksiškas DA nervų galūnėms (Angoa-Perez ir kt. 2012, Baumann ir kt. 2012, Hadlock ir kt. 2011). Klausimas, ar šis vaistas daro žalą 5-HT neuronų sistemai, lieka atviras. Viename tyrime pranešta apie nuolatinį 5-HT nervinių galūnių funkcijos sumažėjimą (Hadlock et al. 2011), o kitame nustatyta, kad mefedronas žalos nesukėlė (Baumann et al. 2012). Mefedronas sąveikauja su DA nervine galūne tokiu būdu, kuris leidžia manyti, kad jis iš tiesų skatina išsiskyrimą ir blokuoja DA pakartotinį įsisavinimą sąveikaudamas su DAT. Pagrindinis metamfetamino neurotoksinio veikimo mechanizmo aspektas yra jo gebėjimas per DAT patekti į DA nervų galūnėles ir sutrikdyti DA homeostazę (Sulzer 2011). Jei šis ankstyvasis metamfetamino neurotoksinės kaskados etapas sustabdomas slopinant DAT, toksiškumo išvengiama (Pu ir kt. 1994, Poth ir kt. 2012, Marek ir kt. 1990, Schmidt ir Gibb 1985). Manėme, kad mefedronas galėtų turėti tą pačią apsauginę savybę kaip ir kiti DAT inhibitoriai, tačiau vietoj to pastebėjome reikšmingą toksiškumo padidėjimą. Ši sąveika pastebėta naudojant dvi skirtingas metamfetamino dozes, kurios sukelia vidutinį arba stiprų DA nervinių galūnių pažeidimą (atitinkamai 4X 2,5 arba 5,0 mg/kg). Šis stiprinantis mefedrono poveikis neapsiribojo vien metamfetaminu ir apėmė ir amfetaminą bei MDMA - du narkotikus, kurie dažnai vartojami kartu su mefedronu ir kitais β-ketoamfetaminais (Feyissa ir Kelly 2008, Schifano ir kt. 2011, Kelly 2011). Todėl, nepaisant to, kad mefedronas nesukelia toksinio poveikio bent jau striatumo DA nervų galūnėlėms, jis sustiprina kitų piktnaudžiavimo narkotikų neurotoksinį poveikį. Šis naujas atradimas turėtų dar griežčiau įvertinti piktnaudžiavimą mefedronu, nes dėl jam būdingo neurotoksiškumo nebuvimo jis gali atrodyti nekenksmingas.
Hipertermija yra dažnai pastebimas ūmus nepageidaujamas metamfetamino (Greene et al. 2008) ir β-ketoamfetamino vartojimo poveikis žmonėms (Borek ir Holstege 2012, Prosser ir Nelson 2012). Kaip ir metamfetaminas, daugelis β-ketoamfetamino narkotikų graužikams taip pat sukelia didelį šerdies temperatūros padidėjimą (Angoa-Perez et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Rockhold et al. 1997). Nors metamfetamino sukeliama hipertermija gali prisidėti prie jo morfologinio ir neuronus žalojančio poveikio, nebūtinai hipertermija yra tiesioginė šio poveikio priežastis (Kiyatkin ir Sharma 2009). Registravome mefedronu ir metamfetaminu gydytų pelių kūno šerdies temperatūrą ir pastebėjome, kad bendras gydymas nepadidino temperatūros daugiau nei maksimalus padidėjimas, pastebėtas po vieno ar kito vaisto vartojimo. Metamfetaminas sukėlė nuo dozės priklausomą kūno temperatūros padidėjimą ir ši hipertermija nekito visame tirtų mefedrono dozių intervale. Tiesą sakant, kūno temperatūros kritimas po injekcijos, pastebėtas po gydymo mefedronu (Angoa-Perez et al. 2012), išliko ir vartojant didesnes mefedrono ir metamfetamino dozes. Nors vaisto sukelta hipertermija nepadidėjo gydant kombinuotu vaistu, neurotoksinis poveikis buvo adityvus. Todėl bent jau šiuo atveju atrodo, kad neurotoksinį metamfetamino poveikį mefedronas gali sustiprinti nepriklausomai nuo hipertermijos.
Mefedronas akivaizdžiai slopina DAT funkciją ir blokuoja DA pakartotinį įsisavinimą in vitro (Lopez-Arnau et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Kehr et al. 2011, Martinez-Clemente et al. 2012, Cozzi et al. 1999). Mefedronas išstumia WIN-35,428 iš jo prisijungimo vietos DAT, o tai rodo, kad jis yra konkurencinis DA pasisavinimo inhibitorius (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). Šiuo požiūriu mefedrono stiprumas labai panašus į metamfetamino (Cozzi ir kt. 1999) ir MDMA (Escubedo ir kt. 2011). Nežinoma, ar mefedronas yra pernešamas per DAT, tačiau metkatinonas pernešamas per DAT (Cozzi ir Foley 2003). Nomifenzinas ir amfonelinė rūgštis, kurie jungiasi prie DAT ir slopina DA pasisavinimą, labai apsaugo nuo metamfetamino sukelto neurotoksiškumo (Pu ir kt. 1994, Marek ir kt. 1990, Schmidt ir Gibb 1985, Poth ir kt. 2012), o pelės, neturinčios DAT, yra atsparios metamfetamino toksiškumui neuronams (Fumagalli ir kt. 1998). Žinant, kad mefedronas nėra neurotoksiškas ir yra DAT blokatorius, galima prognozuoti, kad jis turėtų užkirsti kelią toksiškumui. Šiuo atžvilgiu kaip teigiamą kontrolę išbandėme nomifenziną ir patvirtinome, kad jis apsaugo nuo metamfetamino sukelto DA, DAT ir TH išsekimo. Nomifenzinas taip pat slopina noradrenalino transporterį (Brogden et al. 1979), tačiau šia savybe negalima paaiškinti dabartinių rezultatų, nes dauguma β-ketoamfetaminų, įskaitant mefedroną, slopina noradrenalino transporterį ir blokuoja noradrenalino pasisavinimą (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). 5-HT neuronų sistemos vaidmuo kai kuriems farmakologiniams mefedrono poveikiams galimas atsižvelgiant į šio narkotiko, kaip ir MDMA (Yamamoto et al. 1995), gebėjimą sukelti striatinio DA nutekėjimą dėl sąveikos su 5-HT2A receptoriais (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). Mefedrono sukeliama hiperlokacija priklauso nuo endogeninio 5-HT (Lopez-Arnau et al. 2012), šis vaistas taip pat skatina 5-HT išsiskyrimą ir slopina jo pasisavinimą in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) ir in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). Tačiau galime atmesti endogeninio 5-HT vaidmenį bent jau metamfetamino DA neurotoksiškumui, nes įrodyta, kad pelės, kurioms genetiškai sumažintas 5-HT kiekis, išlaiko jautrumą neurotoksiškumui (Thomas et al. 2010).
Mefedronas gali sustiprinti metamfetamino neurotoksiškumą keliais galimais mechanizmais. Pirma, mefedronas galėtų sąveikauti su VMAT ir sukelti DA nutekėjimą į presinapsinės nervinės galūnės citoplazmą. Metamfetamino neurotoksiškumą didina gydymo būdai, kurie didina citoplazminį (t. y. vaisto išlaisvinamą) DA kiekį (Thomas ir kt. 2008, Thomas ir kt. 2009, Schmidt ir kt. 1985). Šis mechanizmas mažai tikėtinas, nes metkatinonas tik silpnai sąveikauja su VMAT (Cozzi et al. 1999). Antra, mefedrono ir metamfetamino derinys galėtų turėti sinergetinį poveikį nevezikuliniam DA išsiskyrimui, tačiau ši galimybė taip pat atrodo mažai tikėtina, atsižvelgiant į rezultatus, rodančius, kad DAT arba SERT ekspresiją turinčių CHO ląstelių apdorojimas mefedronu ir metamfetaminu neturi adityvaus poveikio DA arba 5-HT išsiskyrimui (Sogawa et al. 2011). Trečia, mefedronas gali sąveikauti su DAT nauju būdu, kuris prisideda prie papildomo toksiškumo. Įrodyta, kad metilenas kartu su metamfetaminu sukelia sinergetinį citotoksiškumą CHO ląstelėse, kuriose ekspresuojamas DAT arba SERT, bet ne laukinio tipo CHO ląstelėse, kuriose šių pernešėjų nėra (Sogawa et al. 2011). Šiuose tyrimuose kultivuotose ląstelėse pastebėtas citotoksiškumas (t. y. LDH išsiskyrimas) labai skiriasi nuo metamfetamino sukeliamo DA nervinių galūnių pažeidimo, tačiau šis mechanizmas rodo įdomų, bet neapibrėžtą DAT vaidmenį didinant citotoksiškumą. Galiausiai, mefedronas galėjo pakeisti metamfetamino metabolizmą. Mefedronas, kaip ir metamfetaminas bei MDMA, pirmiausia metabolizuojamas N-demetilinimo būdu (Meyer ir Maurer 2010) (Caldwell 1976). Šį mechanizmą patvirtina įrodymas, kad metamfetaminas ir MDMA tarpusavyje slopina atitinkamų pirminių metabolitų gamybą ir padidina narkotikų koncentraciją plazmoje virš tos, kuri stebima vartojant bet kurį iš šių narkotikų atskirai (Kuwayama et al. 2012). Šiuo metu ir ankstesniame mūsų tyrime (Angoa-Perez et al. 2012) naudotos mefedrono dozės, nors ir didelės, nėra neurotoksiškos ir patenka į diapazoną, kuriuo piktnaudžiauja žmonės (McErath ir O'Neill 2011). Todėl mefedronas gali veikti kaip MDMA, didindamas metamfetamino koncentraciją plazmoje, slopindamas jo metabolizmą. Pastarajai galimybei patvirtinti reikės atlikti išsamią farmakokinetinę analizę.
Piktnaudžiavimas β-ketoamfetaminais grėsmingai didėja, o mefedronas šiuo metu yra vienas iš dažniausiai vartojamų narkotikų po kanapių, MDMA ir kokaino (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Be to, mefedronas, palyginti su MDMA, žmonėms sukelia stipresnį potraukio jausmą (Brunt et al. 2011), o mefedroną šniurkščiojantys vartotojai jį vertina kaip keliantį didesnę priklausomybę nei kokainas (Winstock et al. 2011b). Mefedroną žmonės vartoja svaiginimosi būdu (t. y. "krovimo") ir dažnai vartoja kartu su kitais narkotikais, tokiais kaip kanapės ir amfetaminų psichostimuliatoriai (Schifano et al. 2011, Fass et al. 2012, Winstock et al. 2011a, Kelly 2011, Torrance ir Cooper 2010). Mefedrono vis dažniau randama tabletėse, parduodamose kaip MDMA (Brunt et al. 2011), o jo vartojimas tikriausiai pralenks MDMA vartojimą, nes pastarojo narkotiko grynumas toliau mažėja (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Remiantis bendrais mefedrono ir kitų "vonios druskų" sudedamųjų dalių piktnaudžiavimo modeliais, svarbu apsvarstyti, ar atsiranda papildoma rizika žmonių sveikatai, kai šie narkotikai tyčia ar netyčia derinami su amfetaminais. Mūsų rezultatai, rodantys, kad bent jau mefedronas gerokai sustiprina metamfetamino, amfetamino ir MDMA sukeliamą striatumo DA nervinių galūnių neurotoksiškumą, atskleidžia ypač pavojingą ir netikėtą šio β-ketoamfetamino savybę.
Naudotos santrumpos
5-HT serotoninas
DA dopaminas
DAT DA transporteris
MDMA 3,4-metilendioksimetamfetaminas
TH tirozino hidroksilazė
VMAT vezikulinis monoamino transporteris
Mefedronas (4-metilmetkatinonas) yra katinono darinys ir struktūrinis metamfetamino bei 3,4-metilendioksi-metamfetamino (MDMA) analogas. Mefedronas yra viena iš "vonios druskų" psichoaktyviųjų sudedamųjų dalių kartu su kitais junginiais, tokiais kaip metilonas, butilonas ir 3,4-metilendioksipirovaleronas (MDPV). β-ketoamfetaminais piktnaudžiaujama vis dažniau ir neatsitiktinai dėl to, kad metamfetamino ir MDMA sintezei reikalingų pirmtakų prieinamumas slaptose laboratorijose yra labai ribotas ir atitinkamai mažėja jų grynumas (Winstock et al. 2011b, Brunt et al. 2011). Piktnaudžiavimui β-ketoamfetaminais vis didėjant, jų nepageidaujamo poveikio sąrašas išsiplėtė ir apima širdies ir kraujagyslių sistemos komplikacijas, sujaudinimą, nemigą, psichozę ir depresiją (Schifano et al. 2011, Prosser ir Nelson 2012).
Kadangi β-ketoamfetaminai yra metamfetamino ir MDMA cheminiai giminaičiai, nenuostabu, kad jų poveikis centrinei nervų sistemai yra toks pat, kaip ir šių pirmųjų narkotikų. Pavyzdžiui, šie narkotikai blokuoja dopamino (DA) ir serotonino (5-HT) pernešėjus (atitinkamai DAT ir SERT) (Cozzi et al. 1999, Rothman et al. 2003, Fleckenstein et al. 2000, Lopez-Arnau et al. 2012) ir skatina monoamino išsiskyrimą in vitro (Kalix ir Glennon 1986, Gygi et al. 1997, Rothman et al. 2003) ir in vivo (Gygi et al. 1997, Kehr et al. 2011). Metkatinonas sukelia nuolatinį triptofano hidroksilazės ir tirozino hidroksilazės (TH) aktyvumo sumažėjimą ir DA bei 5-HT išeikvojimą (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). Metkatinono abstinentų PET vaizdavimo tyrimai atskleidė sumažėjusį striatinio DAT tankį, rodantį DA terminalų netekimą (McCann ir kt. 1998). Vienu metu vykstantis DA išsiskyrimo stimuliavimas ir jo pasisavinimo slopinimas atspindi kritinius elementus, kuriais grindžiamas su metamfetaminu siejamas neurotoksiškumas (Kuhn et al. 2008, Yamamoto ir Bankson 2005, Cadet et al. 2007, Fleckenstein et al. 2007).
Mes (Angoa-Perez et al. 2012) ir kiti (Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011) neseniai tyrėme galimybę, kad mefedronas gali sukelti neurotoksiškumą kaip metamfetaminas ir MDMA. Keista, kad mefedronas nebuvo toksiškas striatumo DA nervų galūnėlėms (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Klausimas, ar mefedronas pažeidžia 5-HT nervų galūnes, lieka neišspręstas, nes viename tyrime užfiksuotas teigiamas poveikis (Hadlock et al. 2011), o kitame - neigiamas (Baumann et al. 2012). Atsižvelgdami į santykinai švelnų mefedrono poveikį DA nervų galūnėms ir į jo, kaip DAT blokatoriaus, savybes, iškėlėme hipotezę, kad jis iš tikrųjų gali apsaugoti DA neuronų sistemą nuo neurotoksinio metamfetamino poveikio, kaip tai, kaip žinoma, vyksta su kitais DAT blokatoriais, pavyzdžiui, amfoneline rūgštimi (Pu ir kt. 1994, Schmidt ir Gibb 1985, Marek ir kt. 1990) ir nomifenzinu (Poth ir kt. 2012). Šiuo metu pranešame, kad mefedronas reikšmingai sustiprina metamfetamino neurotoksiškumą. Šis poveikis apima ir amfetaminą bei MDMA - narkotikus, kurie dažnai vartojami kartu su mefedronu (Feyissa ir Kelly 2008, Schifano ir kt. 2011). Šie netikėti rezultatai piktnaudžiavimą mefedronu iškelia į naują šviesą ir skatina skubiai pripažinti šią subtilią ir pavojingą šio β-ketoamfetamino savybę.
Medžiaga ir metodai
Narkotikai ir reagentai
Mefedrono hidrochloridas ir 3,4-metilendioksimetamfetaminas (MDMA) buvo gauti iš NIDA mokslinių tyrimų išteklių narkotikų tiekimo programos. (+) Metamfetamino hidrochloridas, nomifenzino maleatas, d-amfetamino sulfatas, pentobarbitalis, DA ir visi buferiai bei HPLC reagentai buvo įsigyti iš "Sigma-Aldrich" (St. Louis, MO, JAV). Bicinchonino rūgšties baltymų analizės rinkiniai buvo įsigyti iš Pierce (Rockford, IL, JAV). Polikloniniai antikūnai prieš žiurkių TH buvo pagaminti, kaip aprašyta anksčiau (Kuhn ir Billingsley 1987). Monokloninius antikūnus prieš žiurkių DAT dosniai suteikė Dr. Roxanne A. Vaughan (Šiaurės Dakotos universitetas, Grand Forks, ND, JAV). HRP konjuguotus antrinius anti-IgG antikūnus parūpino Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA, JAV).
Gyvūnai
C57BL/6 pelių patelės (Harlan, Indianapolis, IN, JAV), eksperimento metu svėrusios 20-25 g, buvo laikomos po 5 narveliuose didelėse batų dėžutėse šviesioje (12 val. šviesa/tamsus paros metas) ir temperatūros kontroliuojamoje patalpoje. Buvo naudojamos pelių patelės, nes žinoma, kad jos labai jautrios neurotoksinių amfetaminų sukeliamiems neuronų pažeidimams, ir siekiant išlaikyti nuoseklumą su mūsų ankstesniais metamfetamino neurotoksiškumo tyrimais (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Pelės galėjo laisvai gauti maisto ir vandens. Wayne State universiteto institucinis priežiūros ir naudojimo komitetas patvirtino gyvūnų priežiūrą ir eksperimentines procedūras. Visos procedūros taip pat atitiko NIH laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovą.
Farmakologinės, fiziologinės ir elgesio procedūros
Pelės buvo gydomos mefedronu, taikant į svaiginimąsi panašų režimą, kurį sudarė 4 injekcijos po 10, 20 arba 40 mg/kg su 2 val. pertrauka tarp kiekvienos injekcijos. Toks gydymo režimas, kai švirkščiant pakaitinius amfetaminus ir katinono darinius, sukelia didelį DA nervų galūnių pažeidimą. Anksčiau įrodyta, kad šiuo metu naudojamos mefedrono dozės nėra toksiškos DA nervų galūnėlėms (Angoa-Perez ir kt. 2012). Pelės buvo gydomos metamfetaminu (4X 2,5 arba 5 mg/kg), amfetaminu (4X 5 mg/kg) arba MDMA (4X 20 mg/kg) atskirai arba kartu su mefedronu. Kai pelės buvo gydomos dviem narkotikais, prieš 30 min. iki kiekvienos iš 4 metamfetamino, amfetamino ar MDMA injekcijų joms buvo sušvirkšta mefedrono injekcija. Kontrolinėms pelėms buvo sušvirkšta fiziologinio fiziologinio tirpalo pagal tą patį grafiką, kuris buvo taikomas mefedronui vienam arba kartu su kitais amfetaminais. Kontroliuojant DAT inhibitoriaus poveikį metamfetamino toksiškumui, pelėms 30 min. prieš kiekvieną metamfetamino (4X 5 mg/kg) injekciją buvo suleista nomifenzino (4X 5 mg/kg). Visos injekcijos buvo atliekamos i.p. būdu. Pelės buvo paaukotos praėjus 2 dienoms po paskutinio gydymo vaistais, kai su amfetaminu susijęs neurotoksiškumas buvo didžiausias. Kūno temperatūra buvo stebima telemetriniu būdu naudojant "Bio Medic Data Systems, Inc." (Seaford, DE, JAV) implantuojamus temperatūros atsakiklius IPTT-300. Temperatūra neinvaziniu būdu buvo fiksuojama kas 20 min., pradedant 60 min. prieš pirmąją METH injekciją ir tęsiant 9 val. po jos, naudojant "Bio Medic" konsolinę sistemą DAS-5001.
Striatinio DA kiekio nustatymas
Po gydymo striatinis audinys buvo išpjautas abipus smegenų ir laikomas -80 °C temperatūroje. Sušaldyti audiniai buvo pasverti ir 4 °C temperatūroje sonikuoti 10 tūrio 0,16 N perchloro rūgšties tirpale. Netirpūs baltymai buvo pašalinti centrifuguojant, o DA nustatytas HPLC su elektrochemine detekcija, kaip anksčiau aprašyta metamfetaminui (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
TH ir DAT baltymų kiekio nustatymas imunoblotingo metodu
Gydymo vaistais poveikis striatinio TH ir DAT lygiui buvo nustatytas imunoblotingo metodu kaip toksiškumo striatinio DA nervų galūnėlėms rodiklis. Po gydymo pelės buvo nužudytos nukertant galvą ir striatumas buvo išpjautas abipus. Audiniai buvo laikomi -80 °C temperatūroje. Užšaldytas audinys buvo suardytas sonikuojant 1 % SDS 95 °C temperatūroje, o netirpi medžiaga nusodinta centrifuguojant. Baltymai buvo nustatyti bikinchonino rūgšties metodu, o vienodi baltymų kiekiai (70 μg/l) buvo išskirti SDS-poliakrilamidinio gelio elektroforezės metodu ir po to elektrolitiniu būdu perkelti į nitroceliuliozę. Blotai 1 val. kambario temperatūroje buvo blokuojami Triso buferiniame druskos tirpale, kuriame yra Tween 20 (0,1 % v/v) ir 5 % neriebaus sauso pieno. Pirminiai antikūnai prieš TH (1:1000) arba DAT (1:1000) buvo pridėti prie dėmių ir palikti inkubuoti 16 val. 4 °C temperatūroje. Blotai buvo 3 kartus nuplauti Tris buferiniu fiziologiniu tirpalu, kad būtų pašalinti nesureagavę antikūnai, tada 1 val. kambario temperatūroje inkubuoti su HRP konjuguotu antriniu anti-IgG antikūnu (1:4000). Imunoreaktyvios juostos buvo vizualizuotos sustiprinta chemiluminescencija, o santykinis TH ir DAT reaguojančių juostų tankis buvo nustatytas vaizduojant "Kodak Image Station" ("Carestream Molecular Systems", Ročesteris, Niujorko valstija, JAV) ir kiekybiškai įvertintas naudojant "ImageJ" programinę įrangą (NIH).
Duomenų analizė
Analizuojant metamfetamino ir mefedrono dozių poveikį DA, DAT ir TH, buvo atliktos dvipusės ANOVA analizės. Gydymo vaistais poveikis striatinio DA, TH ir DAT kiekiui buvo tikrinamas reikšmingumas taikant vienakryptę ANOVA, po kurios sekė Tukey daugkartinio palyginimo testas. Gydymo vaistais rezultatai dėl šerdinės kūno temperatūros laikui bėgant buvo analizuojami taikant dvipusę ANOVA, po kurios atliktas Bonferroni testas, siekiant nustatyti temperatūros skirtumų reikšmingumą atskirais laikotarpiais po gydymo. Skirtumai buvo laikomi reikšmingais, jei p < 0,05. Visos statistinės analizės atliktos naudojant "GraphPad Prism" 5.02 versiją "Windows" ("GraphPad Software", San Diegas, Kalifornija, JAV, www.graphpad.com).
Eikite į: 1:
Rezultatai
Mefedrono poveikis metamfetamino sukeltam neurotoksiškumui
Mefedrono, kurio dozės (10, 20 arba 40 mg/kg), kaip žinoma, nesukelia toksinio poveikio DA nervų galūnėms (Angoa-Perez et al. 2012), buvo suleista 30 min. prieš kiekvieną metamfetamino injekciją. Metamfetaminas buvo skiriamas dozėmis, kurios sukelia vidutinio sunkumo (4X 2,5 mg/kg) arba sunkų (4X 5 mg/kg) striatumo DA nervinių galūnių pažeidimą (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). Iš 1 pav. pateiktų rezultatų matyti, kad metamfetamino dozės (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) ir mefedrono dozės (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) pagrindinis poveikis DA kiekiui striatume buvo labai reikšmingas taikant dvipusę ANOVA. Pagrindinis mefedrono, duodamo kartu su 2,5 mg/kg (F4,22 = 35,96, p < 0,001) arba 5,0 mg/kg metamfetamino (F4,17 = 953,9, p < 0,0001), poveikis taip pat buvo labai reikšmingas taikant vienakryptę ANOVA. Visi gydymo bet kuria metamfetamino ± mefedrono doze atvejai sukėlė reikšmingai didesnį DA sumažėjimą, palyginti su atitinkama kontrole (visų atvejų p < 0,0001). Iš 1 pav. taip pat matyti, kad 20 (p < 0,01) ir 40 mg/kg (p < 0,001) mefedrono dozės reikšmingai sustiprino 2,5 mg/kg metamfetamino DA mažinantį poveikį, tuo tarpu visos mefedrono dozės reikšmingai sustiprino 5,0 mg/kg metamfetamino poveikį DA kiekiui (p < 0,0001 visoms).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/sywobkqrnd-jpg.47/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
1 pav.
Mefedrono poveikis metamfetamino sukeltam striatinio DA sumažėjimui. Pelės buvo apdorotos nurodytomis mefedrono (MEPH) dozėmis 30 min. prieš kiekvieną 2,5 (-) arba 5,0 mg/kg (■) metamfetamino (METH) injekciją ir po 2 d. paaukotos, kad HPLC metodu būtų nustatytas striatinio DA kiekis. Duomenys yra 5-7 pelių iš kiekvienos grupės vidurkis ± SEM. Kai kurios paklaidos juostos buvo per mažos, kad viršytų simbolių dydį, todėl jų nesimato. ***p < 0,001, palyginti su kontroline grupe, ir #p < 0,01, ##p < 0,001 arba ###p < 0,0001, palyginti su atitinkama metamfetamino doze (Tukey daugkartinio palyginimo testas).
2a pav. parodyta, kad mefedronas reikšmingai padidino metamfetamino sukeltą DAT koncentracijos sumažėjimą, nustatytą imunoblotingo metodu. Imunoblotai buvo kiekybiškai įvertinti ir, sutinkamai su DA rezultatais, metamfetamino dozės (F1,92 = 9,48, p < 0,001) ir mefedrono dozės (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) pagrindinis poveikis DAT kiekiui striatume buvo labai reikšmingas taikant dvipusę ANOVA (2b pav.). Pagrindinis mefedrono, duodamo kartu su 2,5 mg/kg (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) arba 5,0 mg/kg metamfetamino (F4,39 = 24,84, p < 0,0001), poveikis taip pat buvo labai reikšmingas taikant vienakryptę ANOVA. Visi gydymo būdai bet kuria metamfetamino ± mefedrono doze sukėlė reikšmingai didesnį DAT sumažėjimą, palyginti su atitinkama kontrole (p < 0,01 vien tik 2,5 mg/kg metamfetamino; p < 0,0001 visų kitų gydymo būdų atveju). Iš 2b pav. taip pat matyti, kad 20 mg/kg (p < 0,01) ir 40 mg/kg (p < 0,001) mefedrono dozės reikšmingai sustiprino 2,5 mg/kg metamfetamino sukeltą DAT sumažėjimą, o tik 40 mg/kg mefedrono dozė reikšmingai sustiprino (p < 0,01) 5,0 mg/kg metamfetamino poveikį DAT sumažėjimui.
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/bfu3sx5dnr-jpg.4797/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
2 pav.
Mefedrono poveikis metamfetamino sukeltam striatinio DAT sumažėjimui. Pelės buvo apdorotos nurodytomis mefedrono (MEPH) dozėmis 30 min. prieš kiekvieną 2,5 (●) arba 5,0 mg/kg (■) metamfetamino (METH) injekciją ir po 2 d. paaukotos, kad būtų galima nustatyti striatinio DAT kiekį imunoblotingo metodu (a). Dėmelės buvo kiekybiškai įvertintos naudojant "ImageJ", o duomenys yra 10-12 pelių iš kiekvienos grupės vidurkis ± SEM (b). *p < 0,01 arba ***p < 0,0001, palyginti su kontrole (C), ir #p < 0,01 arba ##p < 0,001, palyginti su atitinkama metamfetamino doze (Tukey daugkartinio palyginimo testas).
3a pav. parodyta, kad mefedronas reikšmingai padidino metamfetamino sukeltą TH kiekio sumažėjimą, kaip nustatyta imunoblotingo metodu. Imunoblotai buvo kiekybiškai įvertinti ir, sutinkamai su pirmiau pateiktais DA ir DAT rezultatais, metamfetamino dozės (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) ir mefedrono dozės (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) pagrindiniai poveikiai buvo labai reikšmingi taikant dvipusę ANOVA (3b pav.). Pagrindinis mefedrono, duodamo kartu su 2,5 mg/kg (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) arba 5,0 mg/kg metamfetamino (F4,49 = 99,16, p < 0,0001), poveikis taip pat buvo labai reikšmingas taikant vienakryptę ANOVA. Visi gydymo būdai bet kuria metamfetamino ± mefedrono doze sukėlė reikšmingai didesnį TH sumažėjimą, palyginti su atitinkama kontrole (p < 0,001 2,5 mg/kg metamfetamino + 10 mg/kg mefedrono; p < 0,0001 visų kitų derinių atveju), išskyrus vien tik 2,5 mg/kg metamfetamino, kuris reikšmingai nepakeitė TH kiekio (t. y. toksiškumo nebuvo). Iš 3b pav. taip pat matyti, kad 20 mg/kg (p < 0,01) ir 40 mg/kg (p < 0,001) mefedrono dozės reikšmingai sustiprino 2,5 mg/kg metamfetamino sukeltą TH sumažėjimą, o visos trys mefedrono dozės reikšmingai (p < 0,0001) sustiprino 5,0 mg/kg metamfetamino poveikį TH sumažėjimui.
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/tggfrjpqru-jpg.4798/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
3 pav.
Mefedrono poveikis metamfetamino sukeltam striatinio TH sumažėjimui. Pelės buvo apdorotos nurodytomis mefedrono (MEPH) dozėmis 30 min. prieš kiekvieną 2,5 (●) arba 5,0 mg/kg (■) metamfetamino (METH) injekciją ir po 2 d. paaukotos, kad būtų galima nustatyti TH kiekį striatose imunoblotingo metodu (a). Dėmelės buvo kiekybiškai įvertintos naudojant "ImageJ", o duomenys yra 10-12 pelių iš kiekvienos grupės vidurkis ± SEM (b). Kai kurios paklaidos juostos buvo per mažos, kad viršytų simbolių dydį, todėl jų nesimato. **p < 0,001 arba ***p < 0,0001, palyginti su kontrole (C), ir #p < 0,01, ##p < 0,001 arba ####p < 0,0001), palyginti su atitinkama metamfetamino doze (Tukey daugkartinio palyginimo testas).
Mefedrono poveikis metamfetamino sukeltai hipertermijai
Mefedronas, kaip ir metamfetaminas, sukelia didelę hipertermiją (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Kai mefedrono buvo suleista 30 min. prieš kiekvieną metamfetamino injekciją, 4 pav. matyti, kad metamfetamino ir mefedrono dozių (F1,300 = 11,99, p < 0,0001) pagrindinis poveikis laikui (F4,300 = 51,73, p < 0,0001) buvo labai reikšmingas taikant dvipusę ANOVA. Pagrindiniai mefedrono, duodamo kartu su 2,5 mg/kg metamfetamino (F4,120 = 41,44, p < 0,0001, a skydelis) per tam tikrą laiką (F30,120 = 3,84, p < 0,0001) arba 5,0 mg/kg metamfetamino (F4,120 = 78,09, p < 0,0001, b skydelis) per tam tikrą laiką (F30,120 = 9,98, p < 0,0001), poveikiai taip pat buvo labai reikšmingi taikant dvipusę ANOVA. Visi gydymo bet kuria metamfetamino ± mefedrono doze būdai reikšmingai skyrėsi nuo atitinkamų kontrolinių (p < 0,0001 visiems gydymo būdams).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/x0ik9hdwsw-jpg.4799/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
4 pav.
Mefedrono poveikis metamfetamino sukeltai hipertermijai. Pelės buvo gydomos nurodytomis mefedrono (MEPH) dozėmis 30 min. prieš kiekvieną 2,5 (a) arba 5,0 mg/kg (b) metamfetamino (METH) injekciją. Šerdies temperatūra buvo matuojama 20 min. intervalais telemetriniu būdu, pradedant 60 min. prieš pirmąją metamfetamino injekciją. Keturios metamfetamino injekcijos pažymėtos rodyklėmis, esančiomis ant x ašies. Duomenys išreikšti kaip 6-8 pelių kūno temperatūros vidurkis kiekvienoje grupėje. SEM visada buvo < 10 % vidurkio ir aiškumo dėlei nepateikiami.
Mefedrono poveikis amfetamino ir MDMA sukeltam neurotoksiškumui
Siekiant patikrinti, ar mefedrono stiprinamasis poveikis metamfetaminui gali būti taikomas ir kitiems neurotoksiškiems amfetaminams, pelės buvo gydomos šiuo β-ketoamfetaminu (20 mg/kg) ir amfetaminu (4X 5 mg/kg) arba MDMA (4X 20 mg/kg), o rezultatai pateikti 5 pav. Prisiminkime, kad pats mefedronas nesumažina striatinio DA, DAT ar TH (Angoa-Perez ir kt. 2012). Pagrindinis vaisto poveikis (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) buvo labai reikšmingas taikant vienpusę ANOVA DA sumažėjimui (5a pav.). Iš 5a pav. taip pat matyti, kad visi gydymo amfetaminu (p < 0,001) arba MDMA (p < 0,001) atskirai arba kartu su mefedronu (p < 0,0001 abiem narkotikams) būdai reikšmingai sumažino DA kiekį, palyginti su kontroliniu. Mefedronas reikšmingai padidino amfetamino (p < 0,01) arba MDMA (p < 0,01) sukeltą DA sumažėjimą. 5b pav. parodytas panašus kombinuotų vaistų gydymo poveikis DAT lygiui striatume. Pagrindinis vaisto poveikis (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) buvo labai reikšmingas taikant vienpusę ANOVA DAT. Iš 5b pav. taip pat matyti, kad visų gydymo amfetaminu arba MDMA atvejų DAT kiekis buvo reikšmingai (p < 0,0001 visiems) mažesnis, palyginti su kontrole. Mefedronas taip pat reikšmingai padidino amfetamino arba MDMA sukeltą DAT sumažėjimą (p < 0,0001 abiem atvejais). Galiausiai 5c pav. matyti, kad pagrindinis vaisto poveikis (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) buvo labai reikšmingas taikant vienakryptę ANOVA TH sumažėjimui. Iš 5c pav. taip pat matyti, kad visų gydymo amfetaminu arba MDMA atvejų TH buvo reikšmingai (visais atvejais p < 0,0001) mažesnis, palyginti su kontrole. Mefedronas taip pat reikšmingai padidino amfetamino arba MDMA sukeltą TH sumažėjimą (abiem atvejais p < 0,0001).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/onvypkgxvn-jpg.4800/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
5 pav.
Mefedrono poveikis amfetamino arba MDMA sukeltam DA nervinių galūnių neurotoksiškumui. Pelės buvo apdorotos 20 mg/kg mefedrono (MEPH) 30 min. prieš kiekvieną 5,0 mg/kg amfetamino (AMPH) arba 20 mg/kg MDMA injekciją ir 2d. po gydymo paaukotos, kad HPLC metodu būtų nustatytas a) DA kiekis striatose. (b) DAT ir (c) TH buvo nustatyti imunoblotingo būdu, o dėmės kiekybiškai įvertintos naudojant ImageJ. Reprezentatyvūs DAT ir TH imunoblotai pateikti kaip įdėklai atitinkamai b ir c paveikslėliuose, o abiejų paveikslėlių gydymo būdai pažymėti: 1,5 - kontrolė; 2,6 - MEPH; 3 - AMPH; 4 - AMPH + MEPH; 7 - MDMA ir 8 - MDMA + MEPH. Duomenys yra 5-12 pelių vidurkis ± SEM kiekvienoje grupėje. **p < 0,001 arba ***p < 0,0001, palyginti su kontrole, ir #p < 0,01 arba ###p < 0,0001, palyginti su AMPH arba MDMA (Tukey'o daugkartinio palyginimo testas).
Nomifenzino poveikis metamfetamino sukeltam neurotoksiškumui
Nomifenzinas, stiprus DAT blokatorius, kurio piktnaudžiavimo ar neurotoksiškumo potencialas nėra žinomas, buvo ištirtas dėl jo gebėjimo apsaugoti nuo metamfetamino sukelto neurotoksiškumo ir kontrasto su mefedrono poveikiu metamfetamino, amfetamino ir MDMA sukeltam DA nervinių galūnių toksiškumui. Iš 6a pav. pateiktų rezultatų matyti, kad pagrindinis vaisto poveikis (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) DA kiekiui buvo labai reikšmingas taikant vienakryptę ANOVA. Vien tik nomifenzinas DA kiekio nekeitė, tačiau metamfetamino (p < 0,0001) sukeltą sumažėjimą šiek tiek, bet reikšmingai pakeitė nomifenzinas (p < 0,01). Pagrindinis vaisto poveikis (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) DAT kiekiui buvo labai reikšmingas taikant vienpusę ANOVA, kaip parodyta 6b pav. Nomifenzinas nekeitė DAT lygio, tačiau reikšmingai apsaugojo (p < 0,001) nuo metamfetamino (p < 0,0001) sukelto striatinio DAT sumažėjimo, palyginti su kontrole. Galiausiai 6c pav. matyti, kad pagrindinis vaisto poveikis (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) TH kiekiui buvo labai reikšmingas taikant vienakryptę ANOVA. Kaip ir DA bei DAT atveju, metamfetamino (p < 0,0001) sukeltą TH sumažėjimą šiek tiek, bet reikšmingai slopino nomifenzinas (p < 0,01).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/daczg9cwfv-jpg.4801/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
6 pav.
Nomifenzino poveikis metamfetamino sukeltam DA nervinių galūnių neurotoksiškumui. Pelės buvo apdorotos 5,0 mg/kg nomifenzino (NOM) 30 min. prieš kiekvieną 5,0 mg/kg metamfetamino (METH) injekciją ir po 2 d. paaukotos, kad HPLC metodu būtų nustatytas a) DA kiekis striatose. (b) DAT ir (c) TH buvo nustatyti imunoblotingo būdu, o dėmės kiekybiškai įvertintos naudojant ImageJ. Reprezentatyvūs DAT ir TH imunoblotai pateikti kaip b ir c skydelių intarpai. Duomenys yra 5-7 pelių iš kiekvienos grupės vidurkis plius SEM. ***p < 0,0001, palyginti su kontrole (C), ir #p < 0,01 arba ##p < 0,001, palyginti su vien tik metamfetaminu (Tukey daugkartinio palyginimo testas).
Aptarimas
Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti, ar mefedronas užkirs kelią metamfetamino sukeltam DA nervinių galūnių toksiškumui. Remiantis jo cheminiu panašumu į metamfetaminą ir MDMA, iš pradžių buvo tikimasi, kad mefedronas darys žalingą poveikį DA neuronų sistemai. Tačiau keliuose tyrimuose beveik vienu metu nustatyta, kad mefedronas nėra toksiškas DA nervų galūnėms (Angoa-Perez ir kt. 2012, Baumann ir kt. 2012, Hadlock ir kt. 2011). Klausimas, ar šis vaistas daro žalą 5-HT neuronų sistemai, lieka atviras. Viename tyrime pranešta apie nuolatinį 5-HT nervinių galūnių funkcijos sumažėjimą (Hadlock et al. 2011), o kitame nustatyta, kad mefedronas žalos nesukėlė (Baumann et al. 2012). Mefedronas sąveikauja su DA nervine galūne tokiu būdu, kuris leidžia manyti, kad jis iš tiesų skatina išsiskyrimą ir blokuoja DA pakartotinį įsisavinimą sąveikaudamas su DAT. Pagrindinis metamfetamino neurotoksinio veikimo mechanizmo aspektas yra jo gebėjimas per DAT patekti į DA nervų galūnėles ir sutrikdyti DA homeostazę (Sulzer 2011). Jei šis ankstyvasis metamfetamino neurotoksinės kaskados etapas sustabdomas slopinant DAT, toksiškumo išvengiama (Pu ir kt. 1994, Poth ir kt. 2012, Marek ir kt. 1990, Schmidt ir Gibb 1985). Manėme, kad mefedronas galėtų turėti tą pačią apsauginę savybę kaip ir kiti DAT inhibitoriai, tačiau vietoj to pastebėjome reikšmingą toksiškumo padidėjimą. Ši sąveika pastebėta naudojant dvi skirtingas metamfetamino dozes, kurios sukelia vidutinį arba stiprų DA nervinių galūnių pažeidimą (atitinkamai 4X 2,5 arba 5,0 mg/kg). Šis stiprinantis mefedrono poveikis neapsiribojo vien metamfetaminu ir apėmė ir amfetaminą bei MDMA - du narkotikus, kurie dažnai vartojami kartu su mefedronu ir kitais β-ketoamfetaminais (Feyissa ir Kelly 2008, Schifano ir kt. 2011, Kelly 2011). Todėl, nepaisant to, kad mefedronas nesukelia toksinio poveikio bent jau striatumo DA nervų galūnėlėms, jis sustiprina kitų piktnaudžiavimo narkotikų neurotoksinį poveikį. Šis naujas atradimas turėtų dar griežčiau įvertinti piktnaudžiavimą mefedronu, nes dėl jam būdingo neurotoksiškumo nebuvimo jis gali atrodyti nekenksmingas.
Hipertermija yra dažnai pastebimas ūmus nepageidaujamas metamfetamino (Greene et al. 2008) ir β-ketoamfetamino vartojimo poveikis žmonėms (Borek ir Holstege 2012, Prosser ir Nelson 2012). Kaip ir metamfetaminas, daugelis β-ketoamfetamino narkotikų graužikams taip pat sukelia didelį šerdies temperatūros padidėjimą (Angoa-Perez et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Rockhold et al. 1997). Nors metamfetamino sukeliama hipertermija gali prisidėti prie jo morfologinio ir neuronus žalojančio poveikio, nebūtinai hipertermija yra tiesioginė šio poveikio priežastis (Kiyatkin ir Sharma 2009). Registravome mefedronu ir metamfetaminu gydytų pelių kūno šerdies temperatūrą ir pastebėjome, kad bendras gydymas nepadidino temperatūros daugiau nei maksimalus padidėjimas, pastebėtas po vieno ar kito vaisto vartojimo. Metamfetaminas sukėlė nuo dozės priklausomą kūno temperatūros padidėjimą ir ši hipertermija nekito visame tirtų mefedrono dozių intervale. Tiesą sakant, kūno temperatūros kritimas po injekcijos, pastebėtas po gydymo mefedronu (Angoa-Perez et al. 2012), išliko ir vartojant didesnes mefedrono ir metamfetamino dozes. Nors vaisto sukelta hipertermija nepadidėjo gydant kombinuotu vaistu, neurotoksinis poveikis buvo adityvus. Todėl bent jau šiuo atveju atrodo, kad neurotoksinį metamfetamino poveikį mefedronas gali sustiprinti nepriklausomai nuo hipertermijos.
Mefedronas akivaizdžiai slopina DAT funkciją ir blokuoja DA pakartotinį įsisavinimą in vitro (Lopez-Arnau et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Kehr et al. 2011, Martinez-Clemente et al. 2012, Cozzi et al. 1999). Mefedronas išstumia WIN-35,428 iš jo prisijungimo vietos DAT, o tai rodo, kad jis yra konkurencinis DA pasisavinimo inhibitorius (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). Šiuo požiūriu mefedrono stiprumas labai panašus į metamfetamino (Cozzi ir kt. 1999) ir MDMA (Escubedo ir kt. 2011). Nežinoma, ar mefedronas yra pernešamas per DAT, tačiau metkatinonas pernešamas per DAT (Cozzi ir Foley 2003). Nomifenzinas ir amfonelinė rūgštis, kurie jungiasi prie DAT ir slopina DA pasisavinimą, labai apsaugo nuo metamfetamino sukelto neurotoksiškumo (Pu ir kt. 1994, Marek ir kt. 1990, Schmidt ir Gibb 1985, Poth ir kt. 2012), o pelės, neturinčios DAT, yra atsparios metamfetamino toksiškumui neuronams (Fumagalli ir kt. 1998). Žinant, kad mefedronas nėra neurotoksiškas ir yra DAT blokatorius, galima prognozuoti, kad jis turėtų užkirsti kelią toksiškumui. Šiuo atžvilgiu kaip teigiamą kontrolę išbandėme nomifenziną ir patvirtinome, kad jis apsaugo nuo metamfetamino sukelto DA, DAT ir TH išsekimo. Nomifenzinas taip pat slopina noradrenalino transporterį (Brogden et al. 1979), tačiau šia savybe negalima paaiškinti dabartinių rezultatų, nes dauguma β-ketoamfetaminų, įskaitant mefedroną, slopina noradrenalino transporterį ir blokuoja noradrenalino pasisavinimą (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). 5-HT neuronų sistemos vaidmuo kai kuriems farmakologiniams mefedrono poveikiams galimas atsižvelgiant į šio narkotiko, kaip ir MDMA (Yamamoto et al. 1995), gebėjimą sukelti striatinio DA nutekėjimą dėl sąveikos su 5-HT2A receptoriais (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). Mefedrono sukeliama hiperlokacija priklauso nuo endogeninio 5-HT (Lopez-Arnau et al. 2012), šis vaistas taip pat skatina 5-HT išsiskyrimą ir slopina jo pasisavinimą in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) ir in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). Tačiau galime atmesti endogeninio 5-HT vaidmenį bent jau metamfetamino DA neurotoksiškumui, nes įrodyta, kad pelės, kurioms genetiškai sumažintas 5-HT kiekis, išlaiko jautrumą neurotoksiškumui (Thomas et al. 2010).
Mefedronas gali sustiprinti metamfetamino neurotoksiškumą keliais galimais mechanizmais. Pirma, mefedronas galėtų sąveikauti su VMAT ir sukelti DA nutekėjimą į presinapsinės nervinės galūnės citoplazmą. Metamfetamino neurotoksiškumą didina gydymo būdai, kurie didina citoplazminį (t. y. vaisto išlaisvinamą) DA kiekį (Thomas ir kt. 2008, Thomas ir kt. 2009, Schmidt ir kt. 1985). Šis mechanizmas mažai tikėtinas, nes metkatinonas tik silpnai sąveikauja su VMAT (Cozzi et al. 1999). Antra, mefedrono ir metamfetamino derinys galėtų turėti sinergetinį poveikį nevezikuliniam DA išsiskyrimui, tačiau ši galimybė taip pat atrodo mažai tikėtina, atsižvelgiant į rezultatus, rodančius, kad DAT arba SERT ekspresiją turinčių CHO ląstelių apdorojimas mefedronu ir metamfetaminu neturi adityvaus poveikio DA arba 5-HT išsiskyrimui (Sogawa et al. 2011). Trečia, mefedronas gali sąveikauti su DAT nauju būdu, kuris prisideda prie papildomo toksiškumo. Įrodyta, kad metilenas kartu su metamfetaminu sukelia sinergetinį citotoksiškumą CHO ląstelėse, kuriose ekspresuojamas DAT arba SERT, bet ne laukinio tipo CHO ląstelėse, kuriose šių pernešėjų nėra (Sogawa et al. 2011). Šiuose tyrimuose kultivuotose ląstelėse pastebėtas citotoksiškumas (t. y. LDH išsiskyrimas) labai skiriasi nuo metamfetamino sukeliamo DA nervinių galūnių pažeidimo, tačiau šis mechanizmas rodo įdomų, bet neapibrėžtą DAT vaidmenį didinant citotoksiškumą. Galiausiai, mefedronas galėjo pakeisti metamfetamino metabolizmą. Mefedronas, kaip ir metamfetaminas bei MDMA, pirmiausia metabolizuojamas N-demetilinimo būdu (Meyer ir Maurer 2010) (Caldwell 1976). Šį mechanizmą patvirtina įrodymas, kad metamfetaminas ir MDMA tarpusavyje slopina atitinkamų pirminių metabolitų gamybą ir padidina narkotikų koncentraciją plazmoje virš tos, kuri stebima vartojant bet kurį iš šių narkotikų atskirai (Kuwayama et al. 2012). Šiuo metu ir ankstesniame mūsų tyrime (Angoa-Perez et al. 2012) naudotos mefedrono dozės, nors ir didelės, nėra neurotoksiškos ir patenka į diapazoną, kuriuo piktnaudžiauja žmonės (McErath ir O'Neill 2011). Todėl mefedronas gali veikti kaip MDMA, didindamas metamfetamino koncentraciją plazmoje, slopindamas jo metabolizmą. Pastarajai galimybei patvirtinti reikės atlikti išsamią farmakokinetinę analizę.
Piktnaudžiavimas β-ketoamfetaminais grėsmingai didėja, o mefedronas šiuo metu yra vienas iš dažniausiai vartojamų narkotikų po kanapių, MDMA ir kokaino (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Be to, mefedronas, palyginti su MDMA, žmonėms sukelia stipresnį potraukio jausmą (Brunt et al. 2011), o mefedroną šniurkščiojantys vartotojai jį vertina kaip keliantį didesnę priklausomybę nei kokainas (Winstock et al. 2011b). Mefedroną žmonės vartoja svaiginimosi būdu (t. y. "krovimo") ir dažnai vartoja kartu su kitais narkotikais, tokiais kaip kanapės ir amfetaminų psichostimuliatoriai (Schifano et al. 2011, Fass et al. 2012, Winstock et al. 2011a, Kelly 2011, Torrance ir Cooper 2010). Mefedrono vis dažniau randama tabletėse, parduodamose kaip MDMA (Brunt et al. 2011), o jo vartojimas tikriausiai pralenks MDMA vartojimą, nes pastarojo narkotiko grynumas toliau mažėja (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Remiantis bendrais mefedrono ir kitų "vonios druskų" sudedamųjų dalių piktnaudžiavimo modeliais, svarbu apsvarstyti, ar atsiranda papildoma rizika žmonių sveikatai, kai šie narkotikai tyčia ar netyčia derinami su amfetaminais. Mūsų rezultatai, rodantys, kad bent jau mefedronas gerokai sustiprina metamfetamino, amfetamino ir MDMA sukeliamą striatumo DA nervinių galūnių neurotoksiškumą, atskleidžia ypač pavojingą ir netikėtą šio β-ketoamfetamino savybę.
Naudotos santrumpos
5-HT serotoninas
DA dopaminas
DAT DA transporteris
MDMA 3,4-metilendioksimetamfetaminas
TH tirozino hidroksilazė
VMAT vezikulinis monoamino transporteris
