Ievads
L-fenilacetilkarbinols ir savienojums, ko izmanto efedrīna sintēzē, kuru pašu izmanto kā amfetamīnu prekursoru. Rūpnieciski to sintezē, maizes raugam (S. cerevisiae/SC) aerobos apstākļos fermentējot benzaldehīdu. Lai gan process ir diezgan vienkāršs, tas var prasīt nelielu aprīkojumu un zināšanas, jo īpaši, ja runājam par sterilu kultūru uzturēšanu un piemērotiem augšanas apstākļiem. Tāpēc es paskaidrošu divas dažādas sarežģītības metodes L-PAC ražošanai biotransformācijas ceļā. Augšanas barotne pirms lietošanas jāsterilizē, izmantojot autoklāvu.
Pirmā metode:
Šo metodi varētu raksturot kā "nevērīgu, bet vieglu". Tā prasa mazāk aprīkojuma, ir vienkāršāka, bet arī mazāk efektīva un dos mazāku iznākumu.
Procedūra:
Pievienojiet 500 ml sterila 0,1 M pH 6 citrāta buferšķīduma, pievienojiet 44 g rauga un 55 g g glikozes. Ievieto ūdens vannā, kas uzsildīta 30 °C temperatūrā. Inkubēt 40/50 minūtes.
Pievieno benzaldehīdu (25 mmol) 5 ml etanola un acetaldehīdu (25 mmol). Inkubē 60 minūtes.
Filtrē caur celītu.
Ekstrahē ar 3*100 ml etilacetāta. Izšķīdina emulsiju, izmantojot piesātinātu nātrija hlorīda šķīdumu, žāvē virs bezūdens nātrija sulfāta, filtrē, iztvaicē šķīdinātāju. Tas ir jūsu L-PAC.
Paskaidrojumi:
Citrāta buferšķīdums: to izmanto, lai uzturētu stabilu pH, jo šūnas augšana to pazemina (nav labi). Lai pagatavotu šo buferšķīdumu, izpildiet šajā kalkulatorā norādītās procedūras: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Neaizmirstiet mainīt pH vērtību uz 6.
Temperatūra: nodrošina augstāku rauga metabolisma aktivitāti.
Etanols: izmanto, lai izšķīdinātu benzaldehīdu un acetaldehīdu un palielinātu to biopieejamību.
Acetaldehīds: izmanto kā ūdeņraža akceptoru benzaldehīda vietā, tādējādi ierobežojot benzilspirta ražošanu.
Šī ir vienkārša procedūra, ko var veikt gandrīz ikviens, nedaudz izlasījis par standarta sterilām metodēm, taču tā dod zemāku iznākumu nekā otra procedūra (20 līdz 40 %). To var uzlabot, vai nu nodrošinot labāku aerāciju, izmantojot vai nu orbitālo kratīšanu ar 150 apgr./min, vai iepludinot barotnē sterilu gaisu, uz vienu litru barotnes iepludinot 1 l gaisa minūtē, vai imobilizējot šūnas algināta lodītēs. To var sameklēt youtube, tas ir ļoti vienkārši izdarāms un var ievērojami palielināt ražību.
Otra metode:
Šis protokols ir sarežģītāks, bet, ja to veic pareizi, var palielināt iznākumu līdz 60 vai 70 %. Tomēr tam būs nepieciešams vairāk materiāla. Lai gan tā nav perfekta, tā ir daudz labāka.
Šī metode ir izstrādāta raugam Candida utilis, nevis S. cerevisiae. Tā vietā var izmantot SC, bet raža samazināsies. C. utilis var iegādāties šeit: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p.
Procedūra
Augšanas barotni veido 10 g/l urīnvielas (slāpeklis), 10 g/l MgSO4 (magnijs un sērs) un no 50 līdz 70 g/l cukura, izmantojot melasi. Izšķīdina atbilstošā 0,1 M pH 6 citrāta buferšķīduma tilpumā.
Dienu iepriekš inokulē rauga sākumkultūru un inkubē 30 °C temperatūrā uz nakti.
Nolasa optisko blīvumu (absorbciju) pie 595 nm. Inokultivējiet fermentācijas reaktoru ar 15 % v/v sākumkultūras, kas koriģēta līdz 0,4 OD. Piemērs: lai inokulētu 1 l trauku, ja OD tika izmērīts 0,2, pievieno 300 ml uz 700 ml. Ja OD jau ir 0,4, pievienojiet 150 ml uz 850 ml utt... (240x106 šūnu/ml inokulātā, skatīt paskaidrojumus).
Inkubējiet 30 °C temperatūrā, kratot orbitāli ar 150 apgr./min vai sūknējot sterilu gaisu ar ātrumu 1 v/v/min. Ja sūknējat gaisu, iespējams, vēlēsieties to lēni maisīt.
Inkubējiet, līdz OD sasniedz 0,3 līdz 0,4. Tam vajadzētu būt no 4 līdz 6 stundām, var būt mazāk vai vairāk. Pārbaudiet OD ik pēc 30 minūtēm, līdz sasniegta vēlamā vērtība.
Benzaldehīdu pievieno vairākās devās. 50 ml tilpums ir 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Vienlaikus pievieno ekvivalentu acetaldehīda tilpumu. Starp katru pievienošanu pagaidiet vienu stundu.
Ekstrahē, izmantojot toluola/vidējā v/v attiecību 1:2, iztvaicē.
Paskaidrojums:
Optiskais blīvums: to mēra, izmantojot spektrofotometru. Šeit mēs nolasām absorbciju pie 595 nm, kas ir proporcionāla šūnu skaitam šķīdumā. Parasti jāatceras, ka 0,1 OD=60x10^6 šūnu/ml.
Vispārīgas piezīmes:
Lai nodrošinātu aerāciju, nelielā mērogā labāk ir izmantot orbitālo kratīšanu ar 150 apgriezieniem minūtē. Lielākā mērogā būs nepieciešams caur filtru izlaist gaisu ar burbuļiem.
Otrajā protokolā benzaldehīdu pievieno vairākās devās, lai palielinātu iznākumu. To var vēl vairāk uzlabot, nepārtraukti ievadot benzaldehīdu ar samazinošu devu, taču amatieru apstākļos to izdarīt ir sarežģīti.
Var izmantot aizvietotus benzaldehīdus, un no tiem iegūs atbilstošu L-PAC analogu.
Visbeidzot, var aizņemties dažus 2. metodes elementus un iekļaut tos 1. metodē, lai pielāgotu eksperimenta plānu pēc savām vēlmēm. Ņemiet vērā, ka var izmantot citus celmus un sugas, ievērojami palielinot iznākumu. Lai iegūtu vairāk informācijas, skatiet Ravi et al. darbu "L-fenil acetilkarbinola (L-PAC) ražošana, izmantojot dažādus jaunus raugu celmus melasā un cukurniedru sulā kā ražošanas vidē".
L-fenilacetilkarbinols ir savienojums, ko izmanto efedrīna sintēzē, kuru pašu izmanto kā amfetamīnu prekursoru. Rūpnieciski to sintezē, maizes raugam (S. cerevisiae/SC) aerobos apstākļos fermentējot benzaldehīdu. Lai gan process ir diezgan vienkāršs, tas var prasīt nelielu aprīkojumu un zināšanas, jo īpaši, ja runājam par sterilu kultūru uzturēšanu un piemērotiem augšanas apstākļiem. Tāpēc es paskaidrošu divas dažādas sarežģītības metodes L-PAC ražošanai biotransformācijas ceļā. Augšanas barotne pirms lietošanas jāsterilizē, izmantojot autoklāvu.
Pirmā metode:
Šo metodi varētu raksturot kā "nevērīgu, bet vieglu". Tā prasa mazāk aprīkojuma, ir vienkāršāka, bet arī mazāk efektīva un dos mazāku iznākumu.
Procedūra:
Pievienojiet 500 ml sterila 0,1 M pH 6 citrāta buferšķīduma, pievienojiet 44 g rauga un 55 g g glikozes. Ievieto ūdens vannā, kas uzsildīta 30 °C temperatūrā. Inkubēt 40/50 minūtes.
Pievieno benzaldehīdu (25 mmol) 5 ml etanola un acetaldehīdu (25 mmol). Inkubē 60 minūtes.
Filtrē caur celītu.
Ekstrahē ar 3*100 ml etilacetāta. Izšķīdina emulsiju, izmantojot piesātinātu nātrija hlorīda šķīdumu, žāvē virs bezūdens nātrija sulfāta, filtrē, iztvaicē šķīdinātāju. Tas ir jūsu L-PAC.
Paskaidrojumi:
Citrāta buferšķīdums: to izmanto, lai uzturētu stabilu pH, jo šūnas augšana to pazemina (nav labi). Lai pagatavotu šo buferšķīdumu, izpildiet šajā kalkulatorā norādītās procedūras: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Neaizmirstiet mainīt pH vērtību uz 6.
Temperatūra: nodrošina augstāku rauga metabolisma aktivitāti.
Etanols: izmanto, lai izšķīdinātu benzaldehīdu un acetaldehīdu un palielinātu to biopieejamību.
Acetaldehīds: izmanto kā ūdeņraža akceptoru benzaldehīda vietā, tādējādi ierobežojot benzilspirta ražošanu.
Šī ir vienkārša procedūra, ko var veikt gandrīz ikviens, nedaudz izlasījis par standarta sterilām metodēm, taču tā dod zemāku iznākumu nekā otra procedūra (20 līdz 40 %). To var uzlabot, vai nu nodrošinot labāku aerāciju, izmantojot vai nu orbitālo kratīšanu ar 150 apgr./min, vai iepludinot barotnē sterilu gaisu, uz vienu litru barotnes iepludinot 1 l gaisa minūtē, vai imobilizējot šūnas algināta lodītēs. To var sameklēt youtube, tas ir ļoti vienkārši izdarāms un var ievērojami palielināt ražību.
Otra metode:
Šis protokols ir sarežģītāks, bet, ja to veic pareizi, var palielināt iznākumu līdz 60 vai 70 %. Tomēr tam būs nepieciešams vairāk materiāla. Lai gan tā nav perfekta, tā ir daudz labāka.
Šī metode ir izstrādāta raugam Candida utilis, nevis S. cerevisiae. Tā vietā var izmantot SC, bet raža samazināsies. C. utilis var iegādāties šeit: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p.
Procedūra
Augšanas barotni veido 10 g/l urīnvielas (slāpeklis), 10 g/l MgSO4 (magnijs un sērs) un no 50 līdz 70 g/l cukura, izmantojot melasi. Izšķīdina atbilstošā 0,1 M pH 6 citrāta buferšķīduma tilpumā.
Dienu iepriekš inokulē rauga sākumkultūru un inkubē 30 °C temperatūrā uz nakti.
Nolasa optisko blīvumu (absorbciju) pie 595 nm. Inokultivējiet fermentācijas reaktoru ar 15 % v/v sākumkultūras, kas koriģēta līdz 0,4 OD. Piemērs: lai inokulētu 1 l trauku, ja OD tika izmērīts 0,2, pievieno 300 ml uz 700 ml. Ja OD jau ir 0,4, pievienojiet 150 ml uz 850 ml utt... (240x106 šūnu/ml inokulātā, skatīt paskaidrojumus).
Inkubējiet 30 °C temperatūrā, kratot orbitāli ar 150 apgr./min vai sūknējot sterilu gaisu ar ātrumu 1 v/v/min. Ja sūknējat gaisu, iespējams, vēlēsieties to lēni maisīt.
Inkubējiet, līdz OD sasniedz 0,3 līdz 0,4. Tam vajadzētu būt no 4 līdz 6 stundām, var būt mazāk vai vairāk. Pārbaudiet OD ik pēc 30 minūtēm, līdz sasniegta vēlamā vērtība.
Benzaldehīdu pievieno vairākās devās. 50 ml tilpums ir 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. Vienlaikus pievieno ekvivalentu acetaldehīda tilpumu. Starp katru pievienošanu pagaidiet vienu stundu.
Ekstrahē, izmantojot toluola/vidējā v/v attiecību 1:2, iztvaicē.
Paskaidrojums:
Optiskais blīvums: to mēra, izmantojot spektrofotometru. Šeit mēs nolasām absorbciju pie 595 nm, kas ir proporcionāla šūnu skaitam šķīdumā. Parasti jāatceras, ka 0,1 OD=60x10^6 šūnu/ml.
Vispārīgas piezīmes:
Lai nodrošinātu aerāciju, nelielā mērogā labāk ir izmantot orbitālo kratīšanu ar 150 apgriezieniem minūtē. Lielākā mērogā būs nepieciešams caur filtru izlaist gaisu ar burbuļiem.
Otrajā protokolā benzaldehīdu pievieno vairākās devās, lai palielinātu iznākumu. To var vēl vairāk uzlabot, nepārtraukti ievadot benzaldehīdu ar samazinošu devu, taču amatieru apstākļos to izdarīt ir sarežģīti.
Var izmantot aizvietotus benzaldehīdus, un no tiem iegūs atbilstošu L-PAC analogu.
Visbeidzot, var aizņemties dažus 2. metodes elementus un iekļaut tos 1. metodē, lai pielāgotu eksperimenta plānu pēc savām vēlmēm. Ņemiet vērā, ka var izmantot citus celmus un sugas, ievērojami palielinot iznākumu. Lai iegūtu vairāk informācijas, skatiet Ravi et al. darbu "L-fenil acetilkarbinola (L-PAC) ražošana, izmantojot dažādus jaunus raugu celmus melasā un cukurniedru sulā kā ražošanas vidē".
