Ievads
Kolonnu hromatogrāfija ir plānslāņa hromatogrāfijas (TLC) paplašinājums. Tiek pieņemts, ka lasītājam ir zināma pieredze laboratorijas praksē un viņš ir saskāries ar plānslāņa hromatogrāfiju. Tā vietā, lai paraugu uzklātu uz plānas silīcija dioksīda vai alumīnija oksīda kārtiņas, paraugu uzklāj uz adsorbenta cilindra un šķīdinātāju nepārtraukti ar spiedienu pieliek, līdz komponenti pilnībā izplūst no cilindra. Izmantojot šo modifikāciju, sastāvdaļas var ne tikai atdalīt, bet arī savākt dažādās tvertnēs, ļaujot attīrīt maisījumus un atdalīt zāles ar piesārņojumu. Kolonnu hromatogrāfija (pazīstama arī kā "zibens hromatogrāfija") tiek bieži izmantota pētniecībā, par ko liecina tās biežā parādīšanās žurnālu rakstu procesuālajās sadaļās.
Procedūras apspriešana
Kolonnu hromatogrāfijai piemēro tos pašus hromatogrāfijas plānā slānī (TLC) pamatprincipus. Patiesībā pirms kolonnas izmantošanas vienmēr veic TLC, lai novērtētu situāciju un noteiktu pareizo šķīdinātāja attiecību. Lai iegūtu labu atdalīšanu, ideāli ir, ja vēlamajam komponentam ir Rf aptuveni 0,35 (par Rf lasiet TLC tēmā) un tas ir atdalīts no citiem komponentiem vismaz ar 0,2 Rf vienībām. Ja atdalāmie plankumi ir ļoti tuvu (ja Rf starpība ir < 0,2), vislabāk, ja plankumu vidū Rf ir 0,35. Rf tuvu 0,35 ir ideāls, jo tas ir pietiekami lēns, lai varētu notikt stacionārās un mobilās fāzes izlīdzināšanās, bet pietiekami ātrs, lai līdz minimumam samazinātu difūzijas radīto joslas paplašināšanos.
Ir daži mainīgie lielumi, kas nav piemērojami TLC, bet kas ietekmē komponentu atdalīšanu kolonnu hromatogrāfijā. Tie ietver kolonnas diametru, izmantotā adsorbenta daudzumu un šķīdinātāja plūsmas ātrumu. Attēlā. 1 parādīti mainīgo ieteikumi, pamatojoties uz parauga lielumu un komponentu atdalīšanas pakāpi. Visos scenārijos kolonnas ir jāsagatavo 12,5-15 cm augstas.
Ir daži mainīgie lielumi, kas nav piemērojami TLC, bet kas ietekmē komponentu atdalīšanu kolonnu hromatogrāfijā. Tie ietver kolonnas diametru, izmantotā adsorbenta daudzumu un šķīdinātāja plūsmas ātrumu. Attēlā. 1 parādīti mainīgo ieteikumi, pamatojoties uz parauga lielumu un komponentu atdalīšanas pakāpi. Visos scenārijos kolonnas ir jāsagatavo 12,5-15 cm augstas.
Piemēram, ar 2,5 cm garu kolonnu būtu jāspēj attīrīt aptuveni 400 mg materiāla, ja atdalīšana ir laba (ΔRf > 0,2, 1. att. trešā kolonna), vai aptuveni 160 mg, ja atdalīšana ir apgrūtināta (ΔRf > 0,1). Kolonnu jāspēj sagatavot un eluēt, izmantojot aptuveni 200 ml šķīdinātāja, un frakcijas var savākt, izmantojot aptuveni 10 ml šķīduma katrai.
Pastāv vairāki kolonnas fiziskās palaišanas varianti. Viena liela atšķirība metodēs ir kolonnas sagatavošanas veids. Izmantojot "sausās iepakošanas" metodi, sausu silīcija dioksīdu vai alumīnija oksīdu pievieno tieši kolonnai, un šķīdinātāju ļauj pa daļām, tad ar spiedienu. Izmantojot "slapjās iepakošanas" metodi, kolonnu vispirms piepilda ar šķīdinātāju, pēc tam viegli sakrata sausu silīcija dioksīdu vai alumīnija oksīdu un tad ar spiedienu iepako. Izmantojot "suspensijas" metodi, šķīdinātāju pievieno silīcija dioksīdam vai alumīnija oksīdam Erlenmeijera kolbā, izlej uz kolonnas kā dūņas, tad iepilda ar spiedienu (spiedienu var radīt ar šļirci).
Ir svarīgi zināt, ka, pievienojot šķīdinātāju silīcija dioksīdam vai alumīnija oksīdam, izdalās siltums (tiem ir eksotermisks šķīdināšanas siltums). Šajā iedaļā ir aprakstīta suspensijas metode, kuras galvenais iemesls ir tas, ka tā ļauj šo eksotermisko posmu veikt Erlenmeijera kolbā, nevis uz kolonnas. Ja kolonnas pildīšanas laikā izdalās siltums, tas var radīt burbuļus no šķīdinātāja vārīšanās. Tie var traucēt kolonnas atdalīšanu, ja tos pienācīgi nenovāc, un var saplaisāt adsorbenta materiālu kolonnā.
Pastāv vairāki kolonnas fiziskās palaišanas varianti. Viena liela atšķirība metodēs ir kolonnas sagatavošanas veids. Izmantojot "sausās iepakošanas" metodi, sausu silīcija dioksīdu vai alumīnija oksīdu pievieno tieši kolonnai, un šķīdinātāju ļauj pa daļām, tad ar spiedienu. Izmantojot "slapjās iepakošanas" metodi, kolonnu vispirms piepilda ar šķīdinātāju, pēc tam viegli sakrata sausu silīcija dioksīdu vai alumīnija oksīdu un tad ar spiedienu iepako. Izmantojot "suspensijas" metodi, šķīdinātāju pievieno silīcija dioksīdam vai alumīnija oksīdam Erlenmeijera kolbā, izlej uz kolonnas kā dūņas, tad iepilda ar spiedienu (spiedienu var radīt ar šļirci).
Ir svarīgi zināt, ka, pievienojot šķīdinātāju silīcija dioksīdam vai alumīnija oksīdam, izdalās siltums (tiem ir eksotermisks šķīdināšanas siltums). Šajā iedaļā ir aprakstīta suspensijas metode, kuras galvenais iemesls ir tas, ka tā ļauj šo eksotermisko posmu veikt Erlenmeijera kolbā, nevis uz kolonnas. Ja kolonnas pildīšanas laikā izdalās siltums, tas var radīt burbuļus no šķīdinātāja vārīšanās. Tie var traucēt kolonnas atdalīšanu, ja tos pienācīgi nenovāc, un var saplaisāt adsorbenta materiālu kolonnā.
Procedūras soli pa solim
a ) Ferrocēna/acetilferrocēna maisījuma TLC, b) Kolonnu hromatogrāfija
Šajā sadaļā attēlotajā kolonnā attīrīts 0,20 g paraugs, kas satur ferrocēna un acetilferrocēna maisījumu (neapstrādāta TLC ir 2. a attēlā). Aptuveni 8 ml frakcijas tika savāktas mazās mēģenēs, un tika izmantoti aptuveni 400 ml eluenta.
a) neapstrādāta ferocēna/acetilferrocēna maisījuma TLC plate pirms eluēšanas, b ) pēc eluēšanas, c ) kolonna ar fritu, d ) kolonna ar kokvilnas ķīli apakšā, e) kolonna bez kokvilnas ķīļa (pirms lietošanas būtu jāievieto).
Veikt TLC
1 ) Veiciet TLC attīrāmajam paraugam (3. attēls a un b), lai noteiktu piemērotu šķīdinātāju hromatogrāfijai. Vēlamajai sastāvdaļai jābūt ar Rf aptuveni 0,35, un ideālā gadījumā tai jābūt atdalītai no visiem pārējiem plankumiem ar vismaz 0,2 Rf vienībām.
2) Sagatavojiet eluenta partiju, kas dod atbilstošu Rf vērtību. Sagatavotais daudzums ir atkarīgs no parauga daudzuma, kolonnas lieluma un no tā, vai šķīdinātāja sastāvu plānots mainīt pusceļā. (Skatīt 1. attēlā norādījumus un eluotropisko sēriju, kurā redzamas "šķīdinātāja jaudas" tendences).
2) Sagatavojiet eluenta partiju, kas dod atbilstošu Rf vērtību. Sagatavotais daudzums ir atkarīgs no parauga daudzuma, kolonnas lieluma un no tā, vai šķīdinātāja sastāvu plānots mainīt pusceļā. (Skatīt 1. attēlā norādījumus un eluotropisko sēriju, kurā redzamas "šķīdinātāja jaudas" tendences).
Sagatavot pildīto kolonnu
3) Iegādājieties piemērotu kolonnu (sk. 1. att.) un pārliecinieties, ka pie aizbīdņa krāna ir kaut kas tāds, kas ļaus cauri izplūst šķidrumam, bet ne cietai vielai. Kolonnām var būt saķepināts disks (pazīstams arī kā "frite"), 3. c) attēls, vai no iepriekšējā lietotāja palikusi vates vai stikla vates aizbāzniņa (3. d) attēls). Ja nav diska vai aizbāžņa (3.3. e attēls), ar garu stienīti iebāzt kolonnas apakšā nelielu vates vai stikla vates vati.
a) Silīcija dioksīda ieberšana 12,5-15 cm augstumā tvaika nosūcējā, b ) silīcija dioksīda ieberšana Erlenmeijera kolbā, c un d) suspensijas veidošana.
Drošības piezīme: Pulverveida silīcija dioksīds un alumīnija oksīds kairina plaušas, un ar tiem vienmēr uzmanīgi jārīkojas digeneratorā. Izšķīdušie putekļi jāiznīcina, noslaucot tos ar mitru papīra dvieli (ja tas ir mitrs, smalkās daļiņas ir mazāk dispersīvas).
5 ) Dūmvadā kolonnā izmērīto adsorbentu ielej Erlenmeijera kolbā (4. b attēls), tad pievieno eluentu (4. c attēls). Izveidojiet irdenu suspensiju, maisot un maisot ar stikla maisīšanas stieni (4. attēls, d), līdz viss adsorbents ir pilnībā samitrināts, gāzes burbulīši ir izdalījušies un konsistence ir nedaudz bieza, bet izlejama.
a ) suspensijas iepildīšana kolonnā, b) kolbas skalošana, c ) pie kolonnas malām pielipušais adsorbents, d) pielipušā adsorbenta skalošana.
6) Novieto mērglāzi vai Erlenmeijera kolbu zem saspiestās kolonnas un atver aizbāzni. Ar vienu ātru kustību, izmantojot piltuvi ar lielu atvērumu, sakratiet un ielejiet kolonnā silīcija dioksīda vai alumīnija oksīda suspensiju (5. a attēls). Tūlīt izmantojiet vairāk eluenta, lai izskalotu atlikušo suspensiju no Erlenmeijera kolbas (5. b attēls) uz kolonnas.
7) Tūlīt noskalojiet silīcija dioksīdu vai alumīnija oksīdu no kolonnas rezervuāra malām, izmantojot eluentu un Pasteira pipetes virpuļkustības (5. c un d attēls). Ja ļaus nožūt, adsorbents pieķersies pie stikla un to nebūs viegli noskalot.
7) Tūlīt noskalojiet silīcija dioksīdu vai alumīnija oksīdu no kolonnas rezervuāra malām, izmantojot eluentu un Pasteira pipetes virpuļkustības (5. c un d attēls). Ja ļaus nožūt, adsorbents pieķersies pie stikla un to nebūs viegli noskalot.
a) Kolonnas saspiešana, lai atbrīvotos no gaisa burbulīšiem, b) Gaisa spiediena pielikšana, c ) Smilšu pievienošana, d) Smilšu skalošana no sāniem.
8) Kolonnu spēcīgi saspiediet, izmantojot korķa gredzenu vai kaulus (6. attēls, a) apakšpunkts), lai kolonnā izspiestu gaisa burbuļus (kas varētu izraisīt sliktu atdalīšanu vai adsorbenta plaisāšanu kolonnā) un veicinātu vienmērīgu adsorbenta nogulsnēšanos.
9) Lai saspiestu kolonnas augšdaļu (6. b attēls), pielieciet vieglu gaisa spiedienu uz kolonnas augšdaļu (6. b attēls), pārtraucot, kad eluenta līmenis ir 1 cm no kolonnas augšdaļas. Ja gaisa vadam izmanto T-veida adapteri, kā parādīts 6. b attēlā, gaisa plūsmu var precīzi kontrolēt, regulējot gumijas caurulītes saspiešanas skavu. Visa eluēšanas procesa laikā balto adsorbenta kolonnu jāuztur mitru, eluenta līmenim atrodoties virs silīcija dioksīda vai alumīnija oksīda augšdaļas. Lai pārtrauktu spiediena piemērošanu, uzmanīgi pārtrauciet blīvējumu un aizveriet aizbīdni, lai nepieļautu šķidruma tālāku pilēšanu.
10) Pievienojiet plānu smilšu slāni (6. attēls, c), aptuveni 0,5 cm augstu. Noskalojiet kolonnas malas ar eluentu, veicot virpuļkustības, lai smiltis atdalītu no stikla malām (6. attēls, d). Atveriet aizbīdni un ļaujiet šķidrumam pilēt, līdz šķidrums ir tieši virs smilšu slāņa. Ja šķidruma pilēšana notiek pārāk lēni, pielietojiet gaisa spiedienu.
9) Lai saspiestu kolonnas augšdaļu (6. b attēls), pielieciet vieglu gaisa spiedienu uz kolonnas augšdaļu (6. b attēls), pārtraucot, kad eluenta līmenis ir 1 cm no kolonnas augšdaļas. Ja gaisa vadam izmanto T-veida adapteri, kā parādīts 6. b attēlā, gaisa plūsmu var precīzi kontrolēt, regulējot gumijas caurulītes saspiešanas skavu. Visa eluēšanas procesa laikā balto adsorbenta kolonnu jāuztur mitru, eluenta līmenim atrodoties virs silīcija dioksīda vai alumīnija oksīda augšdaļas. Lai pārtrauktu spiediena piemērošanu, uzmanīgi pārtrauciet blīvējumu un aizveriet aizbīdni, lai nepieļautu šķidruma tālāku pilēšanu.
10) Pievienojiet plānu smilšu slāni (6. attēls, c), aptuveni 0,5 cm augstu. Noskalojiet kolonnas malas ar eluentu, veicot virpuļkustības, lai smiltis atdalītu no stikla malām (6. attēls, d). Atveriet aizbīdni un ļaujiet šķidrumam pilēt, līdz šķidrums ir tieši virs smilšu slāņa. Ja šķidruma pilēšana notiek pārāk lēni, pielietojiet gaisa spiedienu.
Pievienojiet paraugu
Kad paraugs ir ievietots kolonnā, sākas sacīkstes ar laiku, jo difūzija sāks paplašināt materiālu. Paraugu nevajadzētu uzklāt, kamēr neesat gatavs nekavējoties pabeigt kolonnu pilnībā. Šis process var aizņemt no 15 līdz 90 minūtēm! Ja frakciju savākšanai izmanto mēģenes, pirms parauga pievienošanas mēģenes jānovieto statīvā, un kolonnas augstums jānoregulē tā, lai mēģenes statīvs varētu slīdēt zem tās.
a) Cietās vielas šķīdināšana ar nelielu daudzumu dihlormetāna, b ) parauga uzklāšana, c ) parauga skalošana kolbā, d) spiediena pielietošana, lai paraugu uzstumtu uz kolonnas tieši aiz smilšu slāņa.
11) Ja neapstrādātais paraugs ir šķidrums, izmantojiet to tieši (pāriet uz 13. darbību).
12) Ja neapstrādātais paraugs ir cieta viela, veiciet vienu no šādām darbībām.
12) Ja neapstrādātais paraugs ir cieta viela, veiciet vienu no šādām darbībām.
a) Ideālā situācija: izšķīdināt cieto vielu minimālā eluenta daudzumā (ne vairāk kā pāris ml).
b ) Ja cietā viela nav īpaši šķīstoša vai nešķīst dažos ml eluenta, izšķīdiniet to minimālajā dihlormetāna daudzumā (ne vairāk kā pāris ml, 7. a attēls).
c) Ja cietā viela nešķīst eluentā, ir iespējama arī alternatīva procedūra. Cietvielu izšķīdina kolbā ar apaļu dibenu, izmantojot dažus ml šķīdinātāja ar zemu viršanas temperatūru (piemēram, dihlormetānu vai acetonu). Kolbai pievieno aptuveni 1 g silīcija dioksīda vai alumīnija oksīda, pēc tam šķīdinātāju noņem uz rotācijas iztvaicētāja, atstājot cieto vielu, kas satur uz adsorbenta nogulsnēto paraugu. Kad virs pildītās kolonnas ir colla eluenta (ja izmanto šo metodi, izlaižot smilšu slāni), ar platkameru piltuvi uz kolonnas uzlej silīcija dioksīda adsorbēto paraugu. Ja uz stikla pieķeras putekļi, noskalojiet to ar lielāku daudzumu eluenta (turpiniet 15. darbību).
13) Ar pipetes palīdzību maigi pievienojiet paraugu kolonnai, pilinot šķidrumu vai šķīdumu tieši uz smiltīm ar pipetes galu tik tuvu, cik vien iespējams, nevis lejup pa malām (7. b attēls). Uzmanieties, lai šķidrums netiktu iešļakstīts piespiedu kārtā tā, ka smiltīs vai silīcija dioksīda/alumīnija kolonnā rastos iespiedumi.
14) Izskalojiet parauga trauku ar nedaudz šķīdinātāja (vai dihlormetāna, ja tas tiek izmantots, 7. attēls, c) un ar to pašu pipeti (lai izskalotu arī pipeti) pievienojiet skalošanas šķīdumu kolonnai.
15) Atveriet aizbīdņa krānu un ļaujiet šķidrumam pilēt, līdz paraugs ir tieši aiz smilšu slāņa (7. attēls, d) un nonāk kolonnas baltajā zonā (ja tas aizņem vairāk nekā 20 sekundes, izmantojiet gaisa spiedienu).
16) Maigi noskalojiet kolonnas sānus, veicot virpuļkustības, izmantojot 1-2 pilnas pipetes ar eluentu, lai noskalotu jebkuru izšļakstīto paraugu. Atkal ļaujiet šķidrumam noplūst (vai izmantojiet gaisa spiedienu), līdz paraugs tiek iestumts baltajā adsorbentā.
Atkārtojiet skalošanas darbību, līdz esat pārliecināts, ka viss paraugs ir nogulsnēts uz adsorbenta. Ja daļa parauga joprojām atrodas smilšu slānī, tas var izšķīst šķīdinātājā, pievienojot vairāk šķīdinātāja, kā rezultātā samazinās iznākums. Ja savienojums ir krāsains, skalošanai jābūt pilnīgi dzidrai.
14) Izskalojiet parauga trauku ar nedaudz šķīdinātāja (vai dihlormetāna, ja tas tiek izmantots, 7. attēls, c) un ar to pašu pipeti (lai izskalotu arī pipeti) pievienojiet skalošanas šķīdumu kolonnai.
15) Atveriet aizbīdņa krānu un ļaujiet šķidrumam pilēt, līdz paraugs ir tieši aiz smilšu slāņa (7. attēls, d) un nonāk kolonnas baltajā zonā (ja tas aizņem vairāk nekā 20 sekundes, izmantojiet gaisa spiedienu).
16) Maigi noskalojiet kolonnas sānus, veicot virpuļkustības, izmantojot 1-2 pilnas pipetes ar eluentu, lai noskalotu jebkuru izšļakstīto paraugu. Atkal ļaujiet šķidrumam noplūst (vai izmantojiet gaisa spiedienu), līdz paraugs tiek iestumts baltajā adsorbentā.
Atkārtojiet skalošanas darbību, līdz esat pārliecināts, ka viss paraugs ir nogulsnēts uz adsorbenta. Ja daļa parauga joprojām atrodas smilšu slānī, tas var izšķīst šķīdinātājā, pievienojot vairāk šķīdinātāja, kā rezultātā samazinās iznākums. Ja savienojums ir krāsains, skalošanai jābūt pilnīgi dzidrai.
a un b) Šķīdinātāja rezervuāra piepildīšana, c un d) Kolonnas eluēšana.
Kolonnas piepildīšana ar šķīdinātāju un izskalošana
17) Ar pipetes palīdzību (8. attēls, a) maigi pievienojiet vairāk eluenta (8. attēls), virpuļojot pa malām, un tad, kad smilšu slānis vairs netiks traucēts, uzmanīgi ielejiet lielāku daudzumu (8. attēls, b) sagatavotā eluenta, lai piepildītu rezervuāru (vai piepildiet to tik daudz, cik var būt nepieciešams). Kolonnas pildīšanas laikā savākto tīro eluentu var izmantot atkārtoti.
18) Izmantojiet gaisa spiedienu, lai maigi un vienmērīgi eluētu paraugu caur kolonnu (8. attēls, c un d). Jo vairāk reižu spiediens tiek iedarbināts un apturēts, jo lielāka iespēja, ka kolonna var saplaisāt. Vislabāk, ja spiedienu visu laiku var uzturēt maigu un vienmērīgu.
Optimālais pilēšanas ātrums eluēšanas laikā ir atkarīgs no kolonnas lieluma. Ideāla eluenta plūsma ir tad, ja šķīdinātājs kolonnas cilindriskajā daļā virs adsorbenta pil 5 cm minūtē. Tāpēc šauras kolonnas pilienu ātrumam jābūt lēnākam salīdzinājumā ar platāku kolonnu. Vienas collas kolonnas pilēšanas ātrumam jābūt tādam, ka atsevišķus pilienus var tik tikko atšķirt. Šķidruma straume, kas izplūst no aizbīdņa ar šāda izmēra kolonnu, ir nedaudz par ātru.
18) Izmantojiet gaisa spiedienu, lai maigi un vienmērīgi eluētu paraugu caur kolonnu (8. attēls, c un d). Jo vairāk reižu spiediens tiek iedarbināts un apturēts, jo lielāka iespēja, ka kolonna var saplaisāt. Vislabāk, ja spiedienu visu laiku var uzturēt maigu un vienmērīgu.
Optimālais pilēšanas ātrums eluēšanas laikā ir atkarīgs no kolonnas lieluma. Ideāla eluenta plūsma ir tad, ja šķīdinātājs kolonnas cilindriskajā daļā virs adsorbenta pil 5 cm minūtē. Tāpēc šauras kolonnas pilienu ātrumam jābūt lēnākam salīdzinājumā ar platāku kolonnu. Vienas collas kolonnas pilēšanas ātrumam jābūt tādam, ka atsevišķus pilienus var tik tikko atšķirt. Šķidruma straume, kas izplūst no aizbīdņa ar šāda izmēra kolonnu, ir nedaudz par ātru.
a-c) Frakciju savākšana, d) Kolonnas darbināšana
Frakciju savākšana
19) Tūlīt sāk savākt eluējošo šķidrumu mēģenēs uz statīva (9. a attēls). Ieteikumus par katrā mēģenē savācamo tilpumu skatīt 1. attēlā.20) Kad pirmā mēģene ir piepildīta vai ja ir savākts noteikts šķidruma daudzums, kā ieteicis instruktors vai 1. attēls, pārvietojiet statīvu, lai sāktu savākt šķidrumu citā mēģenē (9. attēls, b un c). Piepildiet un turiet mēģenes kārtībā uz statīva.
Šīs dažādās mēģenes sauc par "frakcijām". Kolonnas mērķis ir savākt pietiekami mazas frakcijas, lai lielākā daļa (vai dažas) frakcijas saturētu tīru materiālu. Ja maisījuma atdalīšana ir apgrūtināta (ja komponentu ΔRf ir zems), vislabāk ir vākt mazas frakcijas (piemēram, līdz pusei piepildītas mēģenes).
Šīs dažādās mēģenes sauc par "frakcijām". Kolonnas mērķis ir savākt pietiekami mazas frakcijas, lai lielākā daļa (vai dažas) frakcijas saturētu tīru materiālu. Ja maisījuma atdalīšana ir apgrūtināta (ja komponentu ΔRf ir zems), vislabāk ir vākt mazas frakcijas (piemēram, līdz pusei piepildītas mēģenes).
a-c) Skalošanas materiāls, kas uzšļakstīts uz kolonnas gala, d) Studenti, kas darbina kolonnu.
21) Kad šķidrums notek no kolonnas, tas bieži vien uzšļakstās uz kolonnas uzgaļa ārpuses, un, šķīdinātājam iztvaikojot, uz uzgaļa var būt redzams materiāla gredzens (ja komponents ir cieta viela, kā 10. b attēlā, redzēsiet cietas vielas gredzenu, vai arī eļļainus pilienus, ja komponents ir šķidrums). Ja komponenti ir krāsaini, kolonnas uzgalis jānoskalo (10. c attēls), kad šķiet, ka viens komponents ir pilnībā eluēts, un pirms tuvojas otrs komponents.
22) Periodiski sekojiet līdzi eluenta līmenim un papildiniet to, pirms tas nokrities zem smilšu slāņa.
22) Periodiski sekojiet līdzi eluenta līmenim un papildiniet to, pirms tas nokrities zem smilšu slāņa.
a) Izskalošana, b) Etil acetāta pievienošana, lai palielinātu šķīdinātāja polaritāti, c ) Šķīdinātāja līmenis tuvojas smilšu slānim, d) Papildināšana.
Iespējama šķīdinātāja polaritātes palielināšana
23) Visā kolonnā var izmantot vienu šķīdinātāju, jo īpaši, ja atdalāmajām sastāvdaļām ir līdzīgas Rf vērtības. Tomēr, ja komponentiem ir ļoti atšķirīgas Rf vērtības, šķīdinātāja polaritāti var palielināt pēc tam, kad viens komponents ir eluēts no kolonnas (11. a attēls).
Palielinot šķīdinātāja polaritāti, komponenti pārvietojas "ātrāk". Ir vairāki iemesli, kāpēc ir vēlama ātrāka elucija. Pirmkārt, ja viens komponents jau ir izgājis no kolonnas, kolonna jau ir paveikusi savu darbu, tāpēc procesa paātrināšana neietekmēs savākto frakciju tīrību. Otrkārt, jo ilgāk kolonnu darbina, jo plašākas būs komponentu joslas (difūzijas dēļ), un, savācot plašu materiāla joslu, tiks patērēts (un izlietots) daudz šķīdinātāja.
Palielinot šķīdinātāja polaritāti, komponenti pārvietojas "ātrāk". Ir vairāki iemesli, kāpēc ir vēlama ātrāka elucija. Pirmkārt, ja viens komponents jau ir izgājis no kolonnas, kolonna jau ir paveikusi savu darbu, tāpēc procesa paātrināšana neietekmēs savākto frakciju tīrību. Otrkārt, jo ilgāk kolonnu darbina, jo plašākas būs komponentu joslas (difūzijas dēļ), un, savācot plašu materiāla joslu, tiks patērēts (un izlietots) daudz šķīdinātāja.
Satur daļēju eluotropisko sēriju sarakstu, sarakstu ar parastajiem šķīdinātājiem, kas sakārtoti pēc to "šķīdinātāja jaudas" normālās fāzes hromatogrāfijā. Polārāks šķīdinātājs izraisa visstraujāko Rf palielināšanos.
24) Lai palielinātu šķīdinātāja polaritāti, polāro šķīdinātāju var pilināt tieši eluentā kolonnas rezervuārā (11.b attēls). Piemēram, ja izmanto heksānu:etilacetāta maisījumu, pievienojot tīru etilacetātu eluentam, kas pašlaik atrodas rezervuārā, palielināsies tā polaritāte. Ja eluenta līmenis ir zems, var pagatavot šķīdumu, kas satur lielāku polārākās sastāvdaļas procentuālo daudzumu. Piemēram, ja kolonnā vispirms tika izmantots heksānu un etilacetāta maisījums 4:1, tad, izmantojot maisījumu 1:1, šķīdinātājs būtu polārāks.
25 ) Eluēt kolonnu ar polārāku šķīdinātāju, kā iepriekš, un vienmēr jāatceras, ka jāseko eluenta līmenim, un tas jāpapildina (11. d attēls), pirms tas nokrītas zem smilšu slāņa.
26) Lai palielinātu šķīdinātāja polaritāti, polāro šķīdinātāju var pilināt tieši eluentā kolonnas rezervuārā (11. b attēls). Piemēram, ja izmanto heksānu:etilacetāta maisījumu, pievienojot tīru etilacetātu eluentam, kas pašlaik atrodas rezervuārā, palielināsies tā polaritāte. Ja eluenta līmenis ir zems, var pagatavot šķīdumu, kas satur lielāku polārākās sastāvdaļas procentuālo daudzumu. Piemēram, ja kolonnā vispirms tika izmantots heksānu un etilacetāta maisījums 4:1, tad, izmantojot maisījumu 1:1, šķīdinātājs būtu polārāks.
27) Eluēt kolonnu ar polārāku šķīdinātāju, kā iepriekš, un vienmēr jāatceras, ka jāseko eluenta līmenim, un tas jāpapildina (11. d attēls), pirms tas nokrītas zem smilšu slāņa.
25 ) Eluēt kolonnu ar polārāku šķīdinātāju, kā iepriekš, un vienmēr jāatceras, ka jāseko eluenta līmenim, un tas jāpapildina (11. d attēls), pirms tas nokrītas zem smilšu slāņa.
26) Lai palielinātu šķīdinātāja polaritāti, polāro šķīdinātāju var pilināt tieši eluentā kolonnas rezervuārā (11. b attēls). Piemēram, ja izmanto heksānu:etilacetāta maisījumu, pievienojot tīru etilacetātu eluentam, kas pašlaik atrodas rezervuārā, palielināsies tā polaritāte. Ja eluenta līmenis ir zems, var pagatavot šķīdumu, kas satur lielāku polārākās sastāvdaļas procentuālo daudzumu. Piemēram, ja kolonnā vispirms tika izmantots heksānu un etilacetāta maisījums 4:1, tad, izmantojot maisījumu 1:1, šķīdinātājs būtu polārāks.
27) Eluēt kolonnu ar polārāku šķīdinātāju, kā iepriekš, un vienmēr jāatceras, ka jāseko eluenta līmenim, un tas jāpapildina (11. d attēls), pirms tas nokrītas zem smilšu slāņa.
a) Sākotnējā TLC plate, b) Frakcijas, ko savāc kolonna, c) Frakciju uzklāšana uz TLC plates, d) Vizualizēta katras frakcijas paraugu TLC plate.
Atrast un koncentrēt vēlamo komponentu
28) Atrodot vēlamo komponentu mēģenes frakcijās, ir lietderīgi saprast saikni starp Rf un elucijas secību kolonnu hromatogrāfijā.Kolonnveida hromatogrāfijā paraugs tiek novietots uz kolonnas un eluējas uz leju, bet plānslāņa hromatogrāfijā paraugs tiek novietots uz plates apakšējās daļas un eluējas uz augšu. Tāpēc kolonnu var uzskatīt par otrādi apgrieztu TLC plati. Savienojums ar augstāku Rf izkliedējas "ātrāk", t. i., uz TLC plates tas atrodas augstāk, un ar kolonnas palīdzību to savāc pirmo. Šajā sadaļā attēlotajā kolonnā komponents ar zemāku Rf (oranžā krāsā uz TLC plates 13. a attēlā) ir komponents, kas savākts otrais no kolonnas.
29) Vispirms nosaka, kurās mēģenēs ir izšķīdušais savienojums.
29) Vispirms nosaka, kurās mēģenēs ir izšķīdušais savienojums.
a) Uz TLC plāksnītes, kas marķēta ar frakciju numuriem, kuri atbilst to savākšanas secībai (13. attēls, c), uzliek katras frakcijas paraugu. Vislabāk būtu katru paraugu uzklāt 2-3 reizes vienu virs otra, ja frakcijas ir atšķaidītas.
b) Ja ir savāktas daudzas frakcijas, tāpēc jūs šaubāties, vai ņemt paraugus no katras frakcijas, viena no metodēm, kā identificēt bezkrāsainas frakcijas, kas var saturēt savienojumu, ir meklēt atlikumu pazīmes, kas ved uz mēģenēm. Pēc iztvaikošanas dažreiz mēģenes augšpusē paliek ciets atlikums (13. attēls) vai eļļaini pilieni, kas padara acīmredzamu, ka šīs frakcijas satur vairāk nekā tikai šķīdinātāju. Ņem paraugus no visām frakcijām, kas atrodas blakus mēģenēm, kurās ir redzams atlikums.
.
c ) Vizualizē plankumaino TLC plāksnīti, izmantojot UV gaismu un/vai traipu, lai noteiktu, kurās frakcijās ir savienojums (13. attēls, d).
c ) Vizualizē plankumaino TLC plāksnīti, izmantojot UV gaismu un/vai traipu, lai noteiktu, kurās frakcijās ir savienojums (13. attēls, d).
a ) Iespējamo savienojumu saturošu frakciju eluētās TLC plates, b ) Frakciju apvienošana, c) Frakciju mēģenes skalošana.
28) Veiciet visu frakciju, kas satur savienojumu, TLC, uz 2,5 cm platas TLC plates uzliekot līdz pieciem paraugiem. Šim nolūkam var izmantot platākas TLC plates, ja tādas ir pieejamas.
29) Identificējiet savienojumu ar vēlamo Rf, salīdzinot ar sākotnējo neapstrādāto TLC plāksni. Izvēlieties saglabāt frakcijas, kurās vēlamais savienojums ir tīrā veidā, kā to pierāda eluētā TLC plāksne. Piemēram, ja 15. a attēlā ir vēlamais savienojums ar augstāku Rf, jāsaglabā 6.-10. frakcija.
30) Salikt tīras frakcijas atbilstoša izmēra apaļdibena kolbā (ne vairāk kā līdz pusei piepildītā, 15. b attēls). Izskalojiet katru mēģeni ar nelielu daudzumu šķīdinātāja (vai citu šķīdinātāju, ja šķīdība ir problēma) un pievienojiet skalošanas šķīdumu kolbai ar apaļo dibenu (15. attēls, c).
31) Iztvaicējiet šķīdinātāju uz rotācijas iztvaicētāja, lai kolbā paliktu attīrīts savienojums.
29) Identificējiet savienojumu ar vēlamo Rf, salīdzinot ar sākotnējo neapstrādāto TLC plāksni. Izvēlieties saglabāt frakcijas, kurās vēlamais savienojums ir tīrā veidā, kā to pierāda eluētā TLC plāksne. Piemēram, ja 15. a attēlā ir vēlamais savienojums ar augstāku Rf, jāsaglabā 6.-10. frakcija.
30) Salikt tīras frakcijas atbilstoša izmēra apaļdibena kolbā (ne vairāk kā līdz pusei piepildītā, 15. b attēls). Izskalojiet katru mēģeni ar nelielu daudzumu šķīdinātāja (vai citu šķīdinātāju, ja šķīdība ir problēma) un pievienojiet skalošanas šķīdumu kolbai ar apaļo dibenu (15. attēls, c).
31) Iztvaicējiet šķīdinātāju uz rotācijas iztvaicētāja, lai kolbā paliktu attīrīts savienojums.
a ) Izmantojot gaisa spiedienu, kolonnas žāvēšanai, b ) ļaujot kolonnai žāvēties otrādi, c) savāc silīcija dioksīda atkritumus.
Kolonnas tīrīšana
32) Lai kolonnu izžāvētu, pielietojiet gaisa spiedienu, lai lielāko daļu eluenta no kolonnas novadītu atkritumu traukā. Pēc tam kolonnu žāvē tālāk, izmantojot kādu no šīm metodēm.
a) atstāt pieslēgtu maigu gaisa plūsmu, kas plūst cauri kolonnai, lai to vēl vairāk izžāvētu, kamēr tiek tīrīti citi priekšmeti (16. attēls, a).
b) Kolonnu skavās piesprādzēt virsū uz augšu virs lielas atkritumu mērglāzes tvaika nosūcējā, lai adsorbents pēc izžūšanas nokristu (16. b attēls). Tas aizņems ilgu laiku (līdz nākamajai mācību stundai), bet ir viena no iespējām.
33) Kad adsorbents ir izžuvis, to var izliet no kolonnas uz atkritumu tvertni dignostatorā (16. attēls c).
Drošības piezīme: Pulverveida adsorbenti kairina plaušas, un to bīstamība palielinās, ja kolonnā ir atlikušie savienojumi, kas tagad var nokļūt plaušās. Silīcija dioksīda vai alumīnija oksīda pulveri vienmēr jālej dūmu nosūcējā.
34) Kad lielākā daļa adsorbenta ir savākusies atkritumu traukā, ar ūdeni izskalojiet izlietnē visus cietvielu atlikumus un pēc tam izskalojiet kolonnu ar acetonu atkritumu traukā. Pēc tam kolonnu notīriet ar ziepēm un ūdeni un nosusiniet, atdalot aizbīdņa daļas.
Drošības piezīme: Pulverveida adsorbenti kairina plaušas, un to bīstamība palielinās, ja kolonnā ir atlikušie savienojumi, kas tagad var nokļūt plaušās. Silīcija dioksīda vai alumīnija oksīda pulveri vienmēr jālej dūmu nosūcējā.
34) Kad lielākā daļa adsorbenta ir savākusies atkritumu traukā, ar ūdeni izskalojiet izlietnē visus cietvielu atlikumus un pēc tam izskalojiet kolonnu ar acetonu atkritumu traukā. Pēc tam kolonnu notīriet ar ziepēm un ūdeni un nosusiniet, atdalot aizbīdņa daļas.
Problēmu novēršana
Kolonnā parādās gaisa burbuļi
Gaisa burbulis ir tukša kabata, kurā nenotiek stacionārās un mobilās fāzes izlīdzināšanās, tāpēc komponenti pārvietojas ātrāk, nekā tiem vajadzētu. Tas var izraisīt nevienmērīgu eluēšanas joslu veidošanos, kas var radīt pārklāšanos, ja maisījuma atdalīšana ir apgrūtināta (ja komponentiem ir ļoti tuvas Rf vērtības, kā 17. attēlā).
Ja kolonnā ir redzami gaisa burbuļi un smiltis vai paraugs vēl nav uzklāts, iepakošanas laikā kolonnu kārtīgi sakratiet, lai no tās izņemtu visus gaisa burbuļus. Ja burbuļi nespēj izkustēties, vērsieties pie pasniedzēja, jo, iespējams, jūs pārāk delikāti veicat šo uzdevumu. Ja smiltis vai paraugs jau ir uzklāts, vislabāk atstāt kolonnu tādu, kāda tā ir, un cerēt, ka gaisa burbuļi neietekmēs atdalīšanu.
Joslas eluējas nevienmērīgi
Ja maisījuma sastāvdaļas ir krāsainas, tas var būt acīmredzams, ja joslas eluējas izkliedējas izkliedēti. Tas, visticamāk, ir tāpēc, ka kolonna ir saspiesta nedaudz pa diagonāli. Ja kolonna ir iespiesta slīpi, komponenti pārvietojas slīpi (18. attēls). Tas var radīt atdalīšanas problēmas, ja komponentiem ir līdzīgs Rf.
Nav iespējams atrisināt šo problēmu kolonnas vidū, bet, ja komponentiem ir ļoti atšķirīgas Rf vērtības, slīpās joslas var neietekmēt atdalīšanu. Nākotnē pārliecinieties, vai kolonna ir pilnīgi vertikāla gan sānu-suvumu, gan priekšpuses-atpakaļ virzienā.
Last edited by a moderator:
