Mefedrons (4-metilmetkatinons) ir β-ketoamfetamīna stimulējoša narkotiskā viela, kas izraisa ļaunprātīgu lietošanu, ar lielu strukturālu un mehānisku līdzību metamfetamīnam. Viena no spēcīgākajām ar mefedronu saistītajām iedarbībām ir spēja stimulēt dopamīna (DA) izdalīšanos un bloķēt tā atpakaļsaistīšanos, mijiedarbojoties ar dopamīna transportieri (DAT). Lai gan mefedrons neizraisa toksicitāti DA nervu galiem, tā spēja kalpot kā DAT blokatoram varētu nodrošināt aizsardzību pret metamfetamīna izraisītu neirotoksicitāti tāpat kā citi DAT inhibitori. Lai pārbaudītu šo iespēju, pirms katras neirotoksiskas metamfetamīna injekcijas (4 injekcijas pa 2,5 vai 5,0 mg/kg ar 2 stundu intervālu) pelēm tika ievadīts mefedrons (10, 20 vai 40 mg/kg). Striatuma DA nervu galu integritāti novērtēja, nosakot DA, DAT un tirozīna hidroksilāzes līmeni. Neviena mefedrona deva nenovērsa vidēji smagu līdz smagu DA toksicitāti, kas saistīta ar dažādām metamfetamīna devām, bet tieši otrādi - to ievērojami pastiprināja. Hipertermija, ko izraisīja kombinēta ārstēšana ar mefedronu un metamfetamīnu, bija tāda pati kā pēc vienas vai otras zāles lietošanas. Mefedrons pastiprināja arī amfetamīna un MDMA neirotoksisko iedarbību uz DA nervu galiem. Turpretī nomifensīns aizsargāja pret metamfetamīna izraisītu neirotoksicitāti. Tā kā mefedrons pastiprina metamfetamīna neirotoksicitāti, šie rezultāti liecina, ka tas mijiedarbojas ar DAT atšķirībā no citiem tipiskiem DAT inhibitoriem. Mefedrona relatīvi nekaitīgā ietekme uz DA nervu galiem slēpj potenciāli bīstamu mijiedarbību ar narkotikām, kas bieži tiek lietotas kopā ar mefedronu, izraisot pastiprinātu neirotoksicitāti.
Mefedrons (4-metilmetkatinons) ir katinona atvasinājums un metamfetamīna un 3,4-metilēndioksi-metamfetamīna (MDMA) strukturālais analogs. Mefedrons ir viena no "vannas sāļu" psihoaktīvajām sastāvdaļām kopā ar citiem savienojumiem, piemēram, metilonu, butilonu un 3,4-metilēndioksipirovaleronu (MDPV). β-ketoamfetamīni tiek ļaunprātīgi izmantoti aizvien biežāk, kas lielā mērā saistīts ar metamfetamīna un MDMA sintēzei nepieciešamo prekursoru ļoti ierobežoto pieejamību slepenajās laboratorijās un attiecīgi to tīrības samazināšanos (Winstock et al. 2011b, Brunt et al. 2011). Tā kā β-ketoamfetamīnu ļaunprātīga lietošana turpina pieaugt, to nelabvēlīgo seku sarakstā ir parādījušās kardiovaskulāras komplikācijas, uzbudinājums, bezmiegs, psihoze un depresija (Schifano et al. 2011, Prosser un Nelson 2012).
Tā kā β-ketoamfetamīni ir metamfetamīna un MDMA ķīmiskie radinieki, nav pārsteidzoši, ka β-ketoamfetamīniem ir daudz tādu pašu iedarbību uz centrālo nervu sistēmu kā šīm pirmajām narkotikām. Piemēram, šīs narkotikas bloķē dopamīna (DA) un serotonīna (5-HT) transportierus (attiecīgi DAT un SERT) (Cozzi et al. 1999, Rothman et al. 2003, Fleckenstein et al. 2000, Lopez-Arnau et al. 2012) un stimulē monoamīnu izdalīšanos in vitro (Kalix and Glennon 1986, Gygi et al. 1997, Rothman et al. 2003) un in vivo (Gygi et al. 1997, Kehr et al. 2011). Metkatinons izraisa pastāvīgu triptofāna hidroksilāzes un tirozīna hidroksilāzes (TH) aktivitātes samazināšanos un DA un 5-HT izsīkšanu (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). PET attēlveidošanas pētījumi abstinējošiem metkatinona lietotājiem atklāja samazinātu striatālā DAT blīvumu, kas liecina par DA terminālu zudumu (McCann et al. 1998). Vienlaicīga DA atbrīvošanās stimulēšana un tā uzsūkšanās kavēšana atspoguļo kritiskos elementus, kas ir ar metamfetamīnu saistītās neirotoksicitātes pamatā (Kuhn et al. 2008, Yamamoto un Bankson 2005, Cadet et al. 2007, Fleckenstein et al. 2007).
Mēs (Angoa-Perez u. c. 2012) un citi (Baumann u. c. 2012, Hadlock u. c. 2011) nesen pētījām iespēju, ka mefedrons varētu izraisīt neirotoksicitāti tāpat kā metamfetamīns un MDMA. Pārsteidzoši, ka mefedrons nebija toksisks striatuma DA nervu galiem (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Jautājums par to, vai mefedrons bojā 5-HT nervu galus, joprojām nav atrisināts, jo vienā pētījumā dokumentēta pozitīva ietekme (Hadlock et al. 2011), bet citā - negatīva (Baumann et al. 2012). Ņemot vērā mefedrona relatīvi labvēlīgo ietekmi uz DA nervu galotnēm un ņemot vērā tā kā DAT blokatora īpašības, mēs izvirzījām hipotēzi, ka tas faktiski varētu aizsargāt DA neironu sistēmu no metamfetamīna neirotoksiskās iedarbības, līdzīgi kā tas, kā zināms, notiek ar citiem DAT blokatoriem, piemēram, amfonelskābi (Pu et al. 1994, Schmidt and Gibb 1985, Marek et al. 1990) un nomifenzīnu (Poth et al. 2012). Šobrīd mēs ziņojam, ka mefedrons ievērojami pastiprina metamfetamīna neirotoksicitāti. Šis efekts attiecas arī uz amfetamīnu un MDMA - narkotikām, kas bieži tiek lietotas kopā ar mefedronu (Feyissa un Kelly 2008, Schifano et al. 2011). Šie pārsteidzošie rezultāti mefedrona ļaunprātīgu lietošanu parāda jaunā gaismā un palielina nepieciešamību steidzami apzināties šo smalko un bīstamo šī β-ketoamfetamīna īpašību.
Materiāli un metodes
Narkotikas un reaģenti
Mefedrona hidrohlorīds un 3,4-metilēndioksimetamfetamīns (MDMA) tika iegūti no NIDA Research Resources Drug Supply Program. (+) Metamfetamīna hidrohlorīds, nomifenzīna maleāts, d-amfetamīna sulfāts, pentobarbitāls, DA un visi buferi un HPLC reaģenti tika iegādāti no Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ASV). Bicinchonīnskābes olbaltumvielu analīzes komplekti tika iegūti no Pierce (Rokforda, IL, ASV). Poliklonālās antivielas pret žurku TH tika izgatavotas, kā aprakstīts iepriekš (Kuhn and Billingsley 1987). Monoklonālās antivielas pret žurku DAT dāsni sniedza Dr. Roxanne A. Vaughan (Ziemeļdakotas Universitāte, Grand Forks, ND, ASV). Ar HRP konjugētas anti-IgG sekundārās antivielas sniedza Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc (West Grove, PA, ASV).
Dzīvnieki
C57BL/6 peļu mātītes (Harlan, Indianapolis, Indianapolis, IN, ASV), kas eksperimenta laikā svēra 20-25 g, turēja pa piecām vienā būrī lielos kurpju kastu būros, apgaismotā (12 h gaisma/tumsa) un temperatūras kontrolētā telpā. Tika izmantotas peļu mātītes, jo ir zināms, ka tās ir ļoti jutīgas pret neirotoksisku amfetamīnu izraisītiem neironu bojājumiem, un lai saglabātu konsekvenci ar mūsu iepriekš veiktajiem metamfetamīna neirotoksicitātes pētījumiem (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Pelēm bija brīva piekļuve pārtikai un ūdenim. Wayne State University Institutional Care and Use Committee apstiprināja dzīvnieku aprūpi un eksperimentālās procedūras. Visas procedūras atbilda arī NIH rokasgrāmatai par laboratorijas dzīvnieku aprūpi un izmantošanu.
Farmakoloģiskās, fizioloģiskās un uzvedības procedūras
Peles ārstēja ar mefedronu, izmantojot binge-like režīmu, kas ietvēra 4 injekcijas pa 10, 20 vai 40 mg/kg ar 2 stundu intervālu starp katru injekciju. Šāda "binge" terapijas shēma, ja to izmanto aizvietotu amfetamīnu un katinona atvasinājumu injicēšanai, izraisa plašus DA nervu galu bojājumus. Pašlaik izmantotās mefedrona devas iepriekš tika pierādīts, ka tās nav toksiskas DA nervu galiem (Angoa-Perez et al. 2012). Peles tika apstrādātas ar metamfetamīnu (4X 2,5 vai 5 mg/kg), amfetamīnu (4X 5 mg/kg) vai MDMA (4X 20 mg/kg) atsevišķi vai kombinācijā ar mefedronu. Ja peles ārstēja ar divām narkotikām, 30 minūtes pirms katras no četrām metamfetamīna, amfetamīna vai MDMA injekcijām tām 30 min. injicēja mefedronu. Kontroles saņēma fizioloģiskā šķīduma injekcijas pēc tāda paša grafika kā mefedronam atsevišķi vai kombinācijā ar citiem amfetamīniem. Lai pārbaudītu DAT inhibitora ietekmi uz metamfetamīna toksicitāti, 30 min pirms katras metamfetamīna (4X 5 mg/kg) injekcijas pelēm 30 min pirms katras metamfetamīna (4X 5 mg/kg) injekcijas ievadīja nomifenzīnu (4X 5 mg/kg). Visas injekcijas tika ievadītas i.p. veidā. Peles tika nogalinātas 2 dienas pēc pēdējās zāļu lietošanas, kad ar amfetamīnu saistītā neirotoksicitāte bija sasniegusi maksimumu. Ķermeņa temperatūru uzraudzīja ar telemetrijas palīdzību, izmantojot Bio Medic Data Systems, Inc. (Seaford, DE, ASV) implantējamus temperatūras transponderus IPTT-300. Temperatūru neinvazīvi reģistrēja ik pēc 20 minūtēm, sākot 60 minūtes pirms pirmās METH injekcijas un turpinot 9 stundas pēc tam, izmantojot Bio Medic DAS-5001 konsoles sistēmu.
Striatālā DA satura noteikšana
Pēc apstrādes abpusēji no smadzenēm tika atdalīti striatālie audi un uzglabāti -80 °C temperatūrā. Sasaldētos audus nosvēra un sonicēja 10 tilpumos 0,16 N perhlorskābes 4 °C temperatūrā. Nešķīstošās olbaltumvielas atdalīja ar centrifugēšanu, un DA noteica ar HPLC ar elektroķīmisko detektoru, kā iepriekš aprakstīts metamfetamīna noteikšanai (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
TH un DAT olbaltumvielu līmeņa noteikšana, izmantojot imūnblotingu
Ārstēšanas ar zālēm ietekmi uz striatālā TH un DAT līmeni noteica, izmantojot imūnblotingu kā toksicitātes rādītāju striatālā DA nervu galiem. Pēc ārstēšanas peles tika nogalinātas, dekapitējot galvu, un striatums tika izoperēts abpusēji. Audus uzglabāja -80 °C temperatūrā. Sasaldētos audus izjauca ar sonikāciju 1 % SDS šķīdumā 95 °C temperatūrā, un nešķīstošo materiālu sedimentēja centrifugējot. Olbaltumvielas noteica ar bikinchonīnskābes metodi, un vienādu olbaltumvielu daudzumu (70 μg/l) izdalīja ar SDS-poliakrilamīda gēla elektroforēzi un pēc tam elektroblotēja uz nitrocelulozes. Blotus bloķēja Trisa buferšķīdumā, kas satur Tween 20 (0,1 % v/v) un 5 % beztauku sausā piena, 1 h istabas temperatūrā. Blotiem pievienoja primārās antivielas pret TH (1:1000) vai DAT (1:1000) un ļāva inkubēties 16 h 4 °C temperatūrā. Blotus 3 reizes mazgāja Trisa buferšķīduma fizioloģiskajā šķīdumā, lai noņemtu nereaģējušās antivielas, un pēc tam 1 h istabas temperatūrā inkubēja ar HRP konjugētu anti-IgG sekundāro antivielu (1:4000). Imūnreaktīvās joslas vizualizēja ar pastiprinātu ķīmiluminiscenci, un TH un DAT reaģējošo joslu relatīvo blīvumu noteica, izmantojot attēlu ar Kodak Image Station (Carestream Molecular Systems, Ročestera, Ņujorka, ASV) un kvantitatīvi, izmantojot ImageJ programmatūru (NIH).
Datu analīze
Lai analizētu metamfetamīna un mefedrona devas ietekmi uz DA, DAT un TH, tika veikta divvirzienu ANOVA. Narkotiku terapijas ietekme uz striatālā DA, TH un DAT saturu tika pārbaudīta, izmantojot vienvirziena ANOVA, kam sekoja Tukija daudzkārtējas salīdzināšanas tests. Narkotiku terapijas rezultāti attiecībā uz ķermeņa kodola temperatūru laika gaitā tika analizēti, izmantojot divvirzienu ANOVA, kam sekoja Bonferroni tests, lai noteiktu temperatūras atšķirību nozīmīgumu atsevišķos laikos pēc terapijas. Atšķirības uzskatīja par būtiskām, ja p < 0,05. Visas statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot GraphPad Prism 5.02 versiju operētājsistēmai Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, ASV, www.graphpad.com).
Iet uz:
Rezultāti
Mefedrona ietekme uz metamfetamīna izraisīto neirotoksicitāti
Mefedronu devās (10, 20 vai 40 mg/kg), par kurām ir zināms, ka tās neizraisa DA nervu galu toksicitāti (Angoa-Perez et al. 2012), ievadīja 30 min pirms katras metamfetamīna injekcijas. Metamfetamīns tika ievadīts devās, kas izraisa vidēji smagus (4X 2,5 mg/kg) vai smagus (4X 5 mg/kg) striatuma DA nervu galu bojājumus (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). Rezultāti, kas attēloti 1. attēlā, liecina, ka metamfetamīna devas (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) un mefedrona devas (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) galvenā ietekme uz DA līmeni striatumā bija ļoti nozīmīga, izmantojot divvirzienu ANOVA. Mefedrona, kas tika lietots kombinācijā ar 2,5 mg/kg (F4,22 = 35,96, p < 0,001) vai 5,0 mg/kg metamfetamīna (F4,17 = 953,9, p < 0,0001), galvenā ietekme bija ļoti nozīmīga arī ar vienvirziena ANOVA. Visas apstrādes ar abām metamfetamīna ± mefedrona devām izraisīja ievērojami lielāku DA samazinājumu salīdzinājumā ar attiecīgo kontroli (p < 0,0001 visiem). Turklāt 1. attēlā redzams, ka mefedrona devas 20 (p < 0,01) un 40 mg/kg (p < 0,001) būtiski pastiprināja 2,5 mg/kg metamfetamīna devu samazinošo ietekmi uz DA, savukārt visas mefedrona devas būtiski pastiprināja 5,0 mg/kg metamfetamīna devu ietekmi uz DA līmeni (p < 0,0001 visiem).
1. attēls
Mefedrona ietekme uz metamfetamīna izraisīto striatālā DA samazināšanos. Peles 30 minūtes pirms katras 2,5 (-) vai 5,0 mg/kg (■) metamfetamīna (METH) injekcijas tika apstrādātas ar norādītajām mefedrona (MEPH) devām, un pēc 2 dienām tās tika nogalinātas, lai ar HPLC noteiktu striatālā DA līmeni. Dati ir vidēji ± SEM 5-7 pelēm katrā grupā. Dažas kļūdu joslas bija pārāk mazas, lai pārsniegtu simbolu lielumu, un nav redzamas. ***p < 0,001 pret kontrolēm un #p < 0,01, ##p < 0,001 vai ###p < 0,0001 pret attiecīgo metamfetamīna devu (Tukija daudzkārtējs salīdzināšanas tests).
attēlā 2a. attēlā redzams, ka mefedrons ievērojami palielināja metamfetamīna izraisīto DAT līmeņa samazināšanos, ko nosaka ar imūnblotinga metodi. Tika veikta imunoblotu kvantitatīva noteikšana, un saskaņā ar rezultātiem attiecībā uz DA metamfetamīna devas (F1,92 = 9,48, p < 0,001) un mefedrona devas (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) galvenā ietekme uz DAT līmeni striatumā bija ļoti nozīmīga, izmantojot divvirzienu ANOVA (2.b attēls). Mefedrona, kas tika lietots kombinācijā ar 2,5 mg/kg (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) vai 5,0 mg/kg metamfetamīna (F4,39 = 24,84, p < 0,0001), galvenā ietekme bija ļoti nozīmīga arī ar vienvirziena ANOVA. Visas apstrādes ar kādu no metamfetamīna ± mefedrona devām izraisīja ievērojami lielāku DAT samazināšanos salīdzinājumā ar attiecīgo kontroli (p < 0,01 tikai 2,5 mg/kg metamfetamīna; p < 0,0001 visām pārējām apstrādēm). 2.b attēlā arī redzams, ka mefedrona devas 20 mg/kg (p < 0,01) un 40 mg/kg (p < 0,001) ievērojami pastiprināja DAT samazināšanos, ko izraisīja 2,5 mg/kg metamfetamīna, savukārt tikai 40 mg/kg mefedrona deva ievērojami pastiprināja (p < 0,01) 5,0 mg/kg metamfetamīna ietekmi uz DAT samazināšanos.
2. attēls
Mefedrona ietekme uz metamfetamīna izraisīto striatālā DAT samazināšanos. Peles 30 minūtes pirms katras 2,5 (●) vai 5,0 mg/kg (■) metamfetamīna (METH) injekcijas tika apstrādātas ar norādītajām mefedrona (MEPH) devām, un pēc 2 dienām tās tika nogalinātas, lai noteiktu striatālā DAT līmeni ar imūnblotinga metodi (a). Blotus kvantitatīvi novērtēja, izmantojot ImageJ, un dati ir vidēji ± SEM 10-12 pelēm katrā grupā (b). *p < 0,01 vai ***p < 0,0001 pret kontroli (C) un #p < 0,01 vai ##p < 0,001 pret attiecīgo metamfetamīna devu (Tukey's daudzkārtējs salīdzināšanas tests).
attēlā 3a. attēlā redzams, ka mefedrons ievērojami palielināja metamfetamīna izraisīto TH līmeņa samazināšanos, ko nosaka ar imūnblotinga metodi. Tika veikta imunoblotu kvantitatīva noteikšana, un saskaņā ar iepriekš minētajiem rezultātiem attiecībā uz DA un DAT metamfetamīna devas (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) un mefedrona devas (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) galvenie efekti bija ļoti nozīmīgi, izmantojot divvirzienu ANOVA (3.b attēls). Mefedrona, kas lietots kombinācijā ar 2,5 mg/kg (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) vai 5,0 mg/kg metamfetamīna (F4,49 = 99,16, p < 0,0001), galvenā ietekme bija ļoti nozīmīga arī vienvirziena ANOVA. Visas apstrādes ar kādu no metamfetamīna ± mefedrona devām izraisīja ievērojami lielāku TH samazinājumu salīdzinājumā ar attiecīgo kontroli (p < 0,001 2,5 mg/kg metamfetamīna + 10 mg/kg mefedrona gadījumā; p < 0,0001 visām pārējām kombinācijām), izņemot tikai 2,5 mg/kg metamfetamīna, kas būtiski nemainīja TH līmeni (t. i., nebija toksicitātes). 3.b attēlā arī redzams, ka mefedrona devas 20 mg/kg (p < 0,01) un 40 mg/kg (p < 0,001) būtiski pastiprināja TH samazināšanos, ko izraisīja 2,5 mg/kg metamfetamīna, un visas trīs mefedrona devas būtiski (p < 0,0001) pastiprināja 5,0 mg/kg metamfetamīna ietekmi uz TH samazināšanos.
3. attēls
Mefedrona ietekme uz metamfetamīna izraisīto striatālā TH samazināšanos. Peles 30 minūtes pirms katras 2,5 (●) vai 5,0 mg/kg (■) metamfetamīna (METH) injekcijas tika apstrādātas ar norādītajām mefedrona (MEPH) devām, un pēc 2 dienām tās tika nogalinātas, lai noteiktu TH līmeni striatā ar imūnblotinga metodi (a). Blotus kvantitatīvi novērtēja, izmantojot ImageJ, un dati ir vidēji ± SEM 10-12 pelēm katrā grupā (b). Dažas kļūdu svītras bija pārāk mazas, lai pārsniegtu simbolu lielumu, un nav redzamas. **p < 0,001 vai ***p < 0,0001 pret kontroli (C) un #p < 0,01, ##p < 0,001 vai ####p < 0,0001) pret attiecīgo metamfetamīna devu (Tukey's multiple comparison test).
Mefedrona ietekme uz metamfetamīna izraisītu hipertermiju
Mefedrons, tāpat kā metamfetamīns, izraisa ievērojamu hipertermiju (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Kad mefedrons tika ievadīts 30 minūtes pirms katras metamfetamīna injekcijas, 4. attēlā redzams, ka metamfetamīna un mefedrona devas (F1,300 = 11,99, p < 0,0001) galvenā ietekme uz laiku (F4,300 = 51,73, p < 0,0001) bija ļoti nozīmīga, izmantojot divvirzienu ANOVA. Mefedrona, kas tika lietots kombinācijā ar 2,5 mg/kg metamfetamīna (F4,120 = 41,44, p < 0,0001, a panelis) laika gaitā (F30,120 = 3,84, p < 0,0001) vai 5,0 mg/kg metamfetamīna (F4,120 = 78,09, p < 0,0001, b panelis) laika gaitā (F30,120 = 9,98, p < 0,0001), galvenā ietekme arī bija ļoti nozīmīga ar divvirzienu ANOVA. Visas apstrādes ar abām metamfetamīna ± mefedrona devām būtiski atšķīrās no attiecīgajām kontrolēm (p < 0,0001 visām apstrādēm).
4. attēls
Mefedrona ietekme uz metamfetamīna izraisītu hipertermiju. Peles tika apstrādātas ar norādītajām mefedrona (MEPH) devām 30 min pirms katras 2,5 (a) vai 5,0 mg/kg (b) metamfetamīna (METH) injekcijas. Ar telemetrijas palīdzību ar 20 min intervālu tika mērīta serdes temperatūra, sākot 60 min pirms pirmās metamfetamīna injekcijas. Četras metamfetamīna injekcijas ir norādītas ar bultiņām, kas atrodas uz x ass. Dati izteikti kā vidējā ķermeņa temperatūra 6-8 pelēm katrā grupā. SEM vienmēr bija < 10 % no vidējās vērtības, un skaidrības labad tie nav norādīti.
Mefedrona ietekme uz amfetamīna un MDMA izraisīto neirotoksicitāti
Lai pārbaudītu, vai mefedrona pastiprinošo ietekmi uz metamfetamīnu var attiecināt arī uz citiem neirotoksiskiem amfetamīniem, peles tika apstrādātas ar šo β-ketoamfetamīnu (20 mg/kg) plus amfetamīnu (4X 5 mg/kg) vai MDMA (4X 20 mg/kg), un rezultāti ir parādīti 5. attēlā. Atgādinām, ka mefedrons pats par sevi nesamazina striatālā DA, DAT vai TH (Angoa-Perez et al. 2012). Galvenā zāļu ietekme (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) bija ļoti nozīmīga, izmantojot vienvirziena ANOVA attiecībā uz DA samazinājumu (5.a attēls). Tāpat 5.a attēlā redzams, ka visas apstrādes ar amfetamīnu (p < 0,001) vai MDMA (p < 0,001) atsevišķi vai kombinācijā ar mefedronu (p < 0,0001 abām zālēm) būtiski pazemināja DA līmeni salīdzinājumā ar kontroli. Mefedrons ievērojami pastiprināja amfetamīna (p < 0,01) vai MDMA (p < 0,01) izraisīto DA samazināšanos. b attēlā redzama līdzīga kombinētās zāļu terapijas ietekme uz DAT līmeni striatumā. Galvenā zāļu ietekme (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) bija ļoti nozīmīga, izmantojot vienvirziena ANOVA attiecībā uz DAT. Arī 5.b attēlā redzams, ka visu apstrādes ar amfetamīnu vai MDMA līmenis bija ievērojami (p < 0,0001 visiem) zemāks, salīdzinot ar kontroli. Mefedrons arī būtiski palielināja DAT samazinājumu, ko izraisīja amfetamīns vai MDMA (p < 0,0001 abos gadījumos). Visbeidzot, 5.c attēlā redzams, ka zāļu galvenā ietekme (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) bija ļoti nozīmīga, izmantojot vienvirziena ANOVA attiecībā uz TH samazināšanos. Tāpat 5.c attēlā redzams, ka visos apstrādes gadījumos ar amfetamīnu vai MDMA TH līmenis bija ievērojami (p < 0,0001 visos gadījumos) zemāks, salīdzinot ar kontroli. Mefedrons arī būtiski palielināja amfetamīna vai MDMA izraisīto TH samazinājumu (p < 0,0001 abos gadījumos).
5. attēls
Mefedrona ietekme uz amfetamīna vai MDMA izraisīto DA nervu galu neirotoksicitāti. Peles 30 min pirms katras 5,0 mg/kg amfetamīna (AMPH) vai 20 mg/kg MDMA injekcijas tika apstrādātas ar 20 mg/kg mefedrona (MEPH) un 2d pēc apstrādes nogalinātas, lai ar HPLC noteiktu a) DA līmeni striatālajā striatā. (b) DAT un (c) TH noteica, izmantojot imūnblotu, un blotus kvantitatīvi novērtēja, izmantojot ImageJ. Reprezentatīvi imūnblotu paraugi DAT un TH ir iekļauti attiecīgi b) un c) paneļa ieliktņos, un abu paneļu apstrādes veidi ir apzīmēti ar 1,5: kontrole; 2,6: MEPH; 3: AMPH; 4: AMPH + MEPH; 7: MDMA; un 8: MDMA + MEPH. Dati ir vidēji ± SEM 5-12 pelēm katrā grupā. **p < 0,001 vai ***p < 0,0001 pret kontroli un #p < 0,01 vai ###p < 0,0001 pret AMPH vai MDMA (Tukey's multiple comparison test).
Nomifensīna ietekme uz metamfetamīna izraisītu neirotoksicitāti
Nomifensīna, spēcīga DAT blokatora, kam nav zināms ļaunprātīgas izmantošanas vai neirotoksisks potenciāls, spēja aizsargāt pret metamfetamīna izraisītu neirotoksicitāti un pretstatā mefedrona ietekmei uz metamfetamīna, amfetamīna un MDMA izraisīto DA nervu galu toksicitāti tika pārbaudīta. Rezultāti 6.a attēlā liecina, ka, izmantojot vienvirziena ANOVA, zāļu galvenā ietekme (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) uz DA līmeni bija ļoti nozīmīga. Nomifensīns vien nemainīja DA līmeni, bet metamfetamīna (p < 0,0001) izraisīto samazinājumu nedaudz, bet būtiski mazināja nomifensīns (p < 0,01). Galvenā zāļu ietekme (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) uz DAT līmeni bija ļoti nozīmīga, izmantojot vienvirziena ANOVA, kā parādīts 6.b attēlā. Nomifensīns nemainīja DAT līmeni, bet nodrošināja nozīmīgu aizsardzību (p < 0,001) pret metamfetamīna (p < 0,0001) izraisīto striatālā DAT samazināšanos salīdzinājumā ar kontroli. Visbeidzot, 6.c attēlā redzams, ka zāļu galvenā ietekme (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) uz TH līmeni bija ļoti nozīmīga, izmantojot vienvirziena ANOVA. Kā redzams attiecībā uz DA un DAT, metamfetamīna (p < 0,0001) izraisīto TH samazināšanos nedaudz, bet nozīmīgi novērsa nomifensīns (p < 0,01).
attēls. 6. attēls.
Nomifensīna ietekme uz metamfetamīna izraisīto DA nervu galu neirotoksicitāti. Peles 30 min pirms katras 5,0 mg/kg metamfetamīna (METH) injekcijas tika apstrādātas ar 5,0 mg/kg nomifensīna (NOM) un 2d vēlāk nogalinātas, lai ar HPLC noteiktu (a) DA līmeni striatālā. (b) DAT un (c) TH noteica, izmantojot imūnblotu, un blotus kvantitatīvi novērtēja, izmantojot ImageJ. Reprezentatīvi imūnblotu paraugi DAT un TH ir iekļauti b) un c) paneļu ieliktņos. Dati ir vidēji plus SEM 5-7 pelēm katrā grupā. ***p < 0,0001 pret kontroli (C) un #p < 0,01 vai ##p < 0,001 pret metamfetamīnu vien (Tukey's multiple comparison test).
Diskusija .
Šī pētījuma mērķis bija noteikt, vai mefedrons novērš metamfetamīna izraisīto DA nervu galu toksicitāti. Pamatojoties uz tā ķīmisko līdzību ar metamfetamīnu un MDMA, sākotnēji tika sagaidīts, ka mefedrons kaitīgi ietekmēs DA neironu sistēmu. Tomēr vairākos pētījumos gandrīz vienlaicīgi tika konstatēts, ka mefedrons nav toksisks DA nervu galiem (Angoa-Perez u. c. 2012, Baumann u. c. 2012, Hadlock u. c. 2011). Jautājums par to, vai šis medikaments izraisa 5-HT neironu sistēmas bojājumus, joprojām ir atklāts. Vienā pētījumā ziņots par noturīgu 5-HT nervu galotņu funkcijas samazināšanos (Hadlock et al. 2011), savukārt citā pētījumā konstatēts, ka mefedrons neizraisa bojājumus (Baumann et al. 2012). Mefedrons mijiedarbojas ar DA nervu galotni tādā veidā, kas liek domāt, ka tas patiešām stimulē atbrīvošanos un bloķē DA atpakaļsaistīšanos, mijiedarbojoties ar DAT. Metamfetamīna neirotoksiskā darbības mehānisma galvenais aspekts ir tā spēja caur DAT piekļūt DA nervu galotnēm un izjaukt DA homeostāzi (Sulzer 2011). Ja šo agrīno metamfetamīna neirotoksiskās kaskādes posmu novērš, inhibējot DAT, toksicitāte tiek novērsta (Pu et al. 1994, Poth et al. 2012, Marek et al. 1990, Schmidt and Gibb 1985). Mēs uzskatījām, ka mefedronam varētu būt tāda pati aizsargājošā īpašība kā citiem DAT inhibitoriem, bet tā vietā novērojām būtisku toksicitātes pastiprināšanos. Šī mijiedarbība tika novērota, izmantojot divas dažādas metamfetamīna devas, kas izraisa vidējus vai smagus DA nervu galu bojājumus (attiecīgi 4X 2,5 vai 5,0 mg/kg). Šī mefedrona pastiprinošā ietekme neaprobežojās tikai ar metamfetamīnu un attiecās arī uz amfetamīnu un MDMA - divām narkotikām, kuras bieži lieto kopā ar mefedronu un citiem β-ketoamfetamīniem (Feyissa un Kelly 2008, Schifano et al. 2011, Kelly 2011). Tāpēc, neraugoties uz to, ka mefedrons neizraisa toksicitāti vismaz striatuma DA nervu galiem, tas pastiprina citu narkotisko vielu neirotoksisko iedarbību. Šim jaunajam atklājumam vajadzētu vēl vairāk saasināt mefedrona ļaunprātīgu lietošanu, jo mefedronam piemītošās neirotoksicitātes trūkums var likt tam šķist nekaitīgam.
Hipertermija ir bieži ziņots par metamfetamīna (Greene et al. 2008) un β-ketoamfetamīna uzņemšanas akūtu nelabvēlīgu ietekmi uz cilvēkiem (Borek un Holstege 2012, Prosser un Nelson 2012). Tāpat kā metamfetamīns, arī daudzas β-ketoamfetamīna narkotikas grauzējiem izraisa būtisku ķermeņa temperatūras paaugstināšanos (Angoa-Perez et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Rockhold et al. 1997). Lai gan metamfetamīna izraisītā hipertermija varētu veicināt tā morfoloģisko un neironus bojājošo ietekmi, nav obligāti, ka hipertermija ir šo seku tiešais cēlonis (Kiyatkin un Sharma 2009). Mēs reģistrējām ar mefedronu un metamfetamīnu ārstētu peļu ķermeņa vidējo temperatūru un novērojām, ka kombinētā terapija nepalielināja temperatūru vairāk par maksimālo pieaugumu, kas novērots pēc vienas vai otras zāles lietošanas atsevišķi. Metamfetamīns izraisīja ar devu saistītu ķermeņa temperatūras paaugstināšanos, un šī hipertermija bija nemainīga visā testētajā mefedrona devu diapazonā. Patiesībā pēc mefedrona lietošanas novērotais ķermeņa temperatūras kritums pēc injekcijas (Angoa-Perez u. c. 2012) saglabājās, lietojot lielākas mefedrona un metamfetamīna devas. Lai gan narkotiku izraisītā hipertermija netika pastiprināta, lietojot kombinētās zāles, neirotoksiskā ietekme bija papildinoša. Tāpēc vismaz šajā gadījumā šķiet, ka mefedrons var pastiprināt metamfetamīna neirotoksisko iedarbību neatkarīgi no hipertermijas.
Mefedrons nepārprotami inhibē DAT funkciju un bloķē DA atpakaļsaistīšanu in vitro (Lopez-Arnau et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Kehr et al. 2011, Martinez-Clemente et al. 2012, Cozzi et al. 1999). Mefedrons izspiež WIN-35,428 no tā saistīšanās vietas DAT, kas liecina, ka tas ir konkurējošs DA uzņemšanas inhibitors (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). Mefedrona iedarbība šajā ziņā ir ļoti līdzīga metamfetamīna (Cozzi et al. 1999) un MDMA (Escubedo et al. 2011) iedarbībai. Nav zināms, vai mefedronu pārnēsā DAT, bet metkatinonu pārnēsā (Cozzi un Foley 2003). Nomifenzīns un amfonelskābe, kas saistās ar DAT un inhibē DA uzņemšanu, nodrošina būtisku aizsardzību pret metamfetamīna izraisītu neirotoksicitāti (Pu et al. 1994, Marek et al. 1990, Schmidt un Gibb 1985, Poth et al. 2012), un peles, kurām trūkst DAT, ir rezistentas pret metamfetamīna neironālo toksicitāti (Fumagalli et al. 1998). Zinot, ka mefedrons nav neirotoksisks un ir DAT blokators, var prognozēt, ka tam vajadzētu novērst toksicitāti. Šajā sakarā mēs pārbaudījām nomifenzīnu kā pozitīvu kontroli un apstiprinājām, ka tas aizsargā pret metamfetamīna izraisītu DA, DAT un TH izsmelšanu. Nomifensīns inhibē arī norepinefrīna transportētāju (Brogden et al. 1979), bet šī īpašība nevar izskaidrot pašreizējos rezultātus, jo lielākā daļa β-ketoamfetamīnu, tostarp mefedrons, inhibē norepinefrīna transportētāju un bloķē norepinefrīna uzsūkšanos (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). Iespējama 5-HT neironu sistēmas nozīme dažās mefedrona farmakoloģiskajās darbībās, ņemot vērā šīs narkotikas, tāpat kā MDMA (Yamamoto et al. 1995), spēju izraisīt striatālā DA izplūdi, mijiedarbojoties ar 5-HT2A receptoriem (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). Mefedrona izraisītā hiperlokomocija ir atkarīga no endogēnā 5-HT (Lopez-Arnau et al. 2012), un šī narkotika arī stimulē 5-HT izdalīšanos un kavē tā uzsūkšanos in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) un in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). Tomēr mēs varam izslēgt endogēnā 5-HT lomu vismaz metamfetamīna DA neirotoksicitātē, pierādot, ka peles, kurām ģenētiski atņemts 5-HT, saglabā jutību pret neirotoksicitāti (Thomas et al. 2010).
Mefedrons varētu pastiprināt metamfetamīna neirotoksicitāti, izmantojot vairākus iespējamus mehānismus. Pirmkārt, mefedrons varētu mijiedarboties ar VMAT, izraisot DA noplūdi presinaptisko nervu galu citoplazmā. Ārstēšana, kas palielina citoplazmas (t. i., zāļu izvadāmā) DA daudzumu, palielina metamfetamīna neirotoksicitāti (Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009, Schmidt et al. 1985). Šis mehānisms ir maz ticams, jo metkatinons tikai vāji mijiedarbojas ar VMAT (Cozzi et al. 1999). Otrkārt, mefedrona un metamfetamīna kombinācijai varētu būt sinerģiska ietekme uz DA atbrīvošanos ārpus vezikulām, bet arī šī iespēja šķiet maz ticama, ņemot vērā rezultātus, kas liecina, ka DAT vai SERT ekspresējošu CHO šūnu apstrādei ar mefedronu un metamfetamīnu nav aditīvas ietekmes uz DA vai 5-HT atbrīvošanos (Sogawa et al. 2011). Treškārt, mefedrons varētu mijiedarboties ar DAT jaunā veidā, kas veicina papildu toksicitāti. Ir pierādīts, ka metilons kombinācijā ar metamfetamīnu izraisa sinerģisku citotoksicitāti CHO šūnās, kas ekspresē DAT vai SERT, bet ne savvaļas tipa CHO šūnās, kurās nav transportieru (Sogawa et al. 2011). Šajos pētījumos kultivētajās šūnās novērotā citotoksicitāte (t. i., LDH izdalīšanās) ļoti atšķiras no metamfetamīna izraisītā DA nervu galu bojājuma, taču šis mehānisms liecina par interesantu, bet nenoteiktu DAT lomu pastiprinātā citotoksicitātē. Visbeidzot, mefedrons varētu mainīt metamfetamīna metabolismu. Mefedrons, tāpat kā metamfetamīns un MDMA, galvenokārt tiek metabolizēts N-demetilējot (Meyer un Maurer 2010) (Caldwell 1976). Šo mehānismu apstiprina pierādījumi, ka metamfetamīns un MDMA savstarpēji inhibē savu primāro metabolītu veidošanos un paaugstina narkotiku līmeni plazmā virs tā, kāds novērojams pēc vienas vai otras narkotikas lietošanas (Kuwayama et al. 2012). Pašlaik un mūsu iepriekšējā pētījumā (Angoa-Perez et al. 2012) izmantotās mefedrona devas, lai gan tās ir lielas, nav neirotoksiskas un ietilpst cilvēku ļaunprātīgi lietoto devu diapazonā (McErath and O'Neill 2011). Tāpēc mefedrons varētu darboties tāpat kā MDMA, palielinot metamfetamīna līmeni plazmā, kavējot tā metabolismu. Lai apstiprinātu šo pēdējo iespēju, būs jāveic padziļināta farmakokinētiskā analīze.
β-ketoamfetamīnu ļaunprātīga lietošana pieaug satraucošā ātrumā, un mefedrons pašlaik ir viena no visbiežāk lietotajām narkotikām pēc marihuānas, MDMA un kokaīna (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Turklāt, salīdzinot ar MDMA, mefedrons cilvēkiem izraisa spēcīgāku alkas sajūtu (Brunt et al. 2011), un lietotāji, kas šņauc mefedronu, uzskata, ka tas izraisa lielāku atkarību nekā kokaīns (Winstock et al. 2011b). Mefedronu cilvēki patērē uzdzeršanas veidā (t. i., "stacking"), un to bieži lieto kopā ar citām narkotikām, piemēram, marihuānu un amfetamīna psihostimulantiem (Schifano et al. 2011, Fass et al. 2012, Winstock et al. 2011a, Kelly 2011, Torrance and Cooper 2010). Mefedrons aizvien biežāk ir sastopams tabletēs, ko pārdod kā MDMA (Brunt et al. 2011), un tā lietošana, visticamāk, pārsniegs MDMA lietošanu, jo šīs pēdējās narkotikas tīrība turpina samazināties (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Pamatojoties uz mefedrona un citu "vannas sāļu" sastāvdaļu izplatītajiem ļaunprātīgas lietošanas veidiem, ir svarīgi apsvērt, vai cilvēkiem rodas papildu risks veselībai, ja šīs narkotikas tiek apzināti vai neapzināti kombinētas ar amfetamīniem. Mūsu rezultāti, kas liecina, ka vismaz mefedrons ievērojami pastiprina metamfetamīna, amfetamīna un MDMA izraisīto neirotoksicitāti striatuma DA nervu galiem, atklāj īpaši bīstamu un negaidītu šī β-ketoamfetamīna īpašību.
Izmantotie saīsinājumi
5-HT serotonīns
DA dopamīns
DAT DA transportieris
MDMA 3,4-metilēndioksimetamfetamīns
TH tirozīna hidroksilāze
VMAT vezikulārais monoamīnu transportētājs
Mefedrons (4-metilmetkatinons) ir katinona atvasinājums un metamfetamīna un 3,4-metilēndioksi-metamfetamīna (MDMA) strukturālais analogs. Mefedrons ir viena no "vannas sāļu" psihoaktīvajām sastāvdaļām kopā ar citiem savienojumiem, piemēram, metilonu, butilonu un 3,4-metilēndioksipirovaleronu (MDPV). β-ketoamfetamīni tiek ļaunprātīgi izmantoti aizvien biežāk, kas lielā mērā saistīts ar metamfetamīna un MDMA sintēzei nepieciešamo prekursoru ļoti ierobežoto pieejamību slepenajās laboratorijās un attiecīgi to tīrības samazināšanos (Winstock et al. 2011b, Brunt et al. 2011). Tā kā β-ketoamfetamīnu ļaunprātīga lietošana turpina pieaugt, to nelabvēlīgo seku sarakstā ir parādījušās kardiovaskulāras komplikācijas, uzbudinājums, bezmiegs, psihoze un depresija (Schifano et al. 2011, Prosser un Nelson 2012).
Tā kā β-ketoamfetamīni ir metamfetamīna un MDMA ķīmiskie radinieki, nav pārsteidzoši, ka β-ketoamfetamīniem ir daudz tādu pašu iedarbību uz centrālo nervu sistēmu kā šīm pirmajām narkotikām. Piemēram, šīs narkotikas bloķē dopamīna (DA) un serotonīna (5-HT) transportierus (attiecīgi DAT un SERT) (Cozzi et al. 1999, Rothman et al. 2003, Fleckenstein et al. 2000, Lopez-Arnau et al. 2012) un stimulē monoamīnu izdalīšanos in vitro (Kalix and Glennon 1986, Gygi et al. 1997, Rothman et al. 2003) un in vivo (Gygi et al. 1997, Kehr et al. 2011). Metkatinons izraisa pastāvīgu triptofāna hidroksilāzes un tirozīna hidroksilāzes (TH) aktivitātes samazināšanos un DA un 5-HT izsīkšanu (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). PET attēlveidošanas pētījumi abstinējošiem metkatinona lietotājiem atklāja samazinātu striatālā DAT blīvumu, kas liecina par DA terminālu zudumu (McCann et al. 1998). Vienlaicīga DA atbrīvošanās stimulēšana un tā uzsūkšanās kavēšana atspoguļo kritiskos elementus, kas ir ar metamfetamīnu saistītās neirotoksicitātes pamatā (Kuhn et al. 2008, Yamamoto un Bankson 2005, Cadet et al. 2007, Fleckenstein et al. 2007).
Mēs (Angoa-Perez u. c. 2012) un citi (Baumann u. c. 2012, Hadlock u. c. 2011) nesen pētījām iespēju, ka mefedrons varētu izraisīt neirotoksicitāti tāpat kā metamfetamīns un MDMA. Pārsteidzoši, ka mefedrons nebija toksisks striatuma DA nervu galiem (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Jautājums par to, vai mefedrons bojā 5-HT nervu galus, joprojām nav atrisināts, jo vienā pētījumā dokumentēta pozitīva ietekme (Hadlock et al. 2011), bet citā - negatīva (Baumann et al. 2012). Ņemot vērā mefedrona relatīvi labvēlīgo ietekmi uz DA nervu galotnēm un ņemot vērā tā kā DAT blokatora īpašības, mēs izvirzījām hipotēzi, ka tas faktiski varētu aizsargāt DA neironu sistēmu no metamfetamīna neirotoksiskās iedarbības, līdzīgi kā tas, kā zināms, notiek ar citiem DAT blokatoriem, piemēram, amfonelskābi (Pu et al. 1994, Schmidt and Gibb 1985, Marek et al. 1990) un nomifenzīnu (Poth et al. 2012). Šobrīd mēs ziņojam, ka mefedrons ievērojami pastiprina metamfetamīna neirotoksicitāti. Šis efekts attiecas arī uz amfetamīnu un MDMA - narkotikām, kas bieži tiek lietotas kopā ar mefedronu (Feyissa un Kelly 2008, Schifano et al. 2011). Šie pārsteidzošie rezultāti mefedrona ļaunprātīgu lietošanu parāda jaunā gaismā un palielina nepieciešamību steidzami apzināties šo smalko un bīstamo šī β-ketoamfetamīna īpašību.
Materiāli un metodes
Narkotikas un reaģenti
Mefedrona hidrohlorīds un 3,4-metilēndioksimetamfetamīns (MDMA) tika iegūti no NIDA Research Resources Drug Supply Program. (+) Metamfetamīna hidrohlorīds, nomifenzīna maleāts, d-amfetamīna sulfāts, pentobarbitāls, DA un visi buferi un HPLC reaģenti tika iegādāti no Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ASV). Bicinchonīnskābes olbaltumvielu analīzes komplekti tika iegūti no Pierce (Rokforda, IL, ASV). Poliklonālās antivielas pret žurku TH tika izgatavotas, kā aprakstīts iepriekš (Kuhn and Billingsley 1987). Monoklonālās antivielas pret žurku DAT dāsni sniedza Dr. Roxanne A. Vaughan (Ziemeļdakotas Universitāte, Grand Forks, ND, ASV). Ar HRP konjugētas anti-IgG sekundārās antivielas sniedza Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc (West Grove, PA, ASV).
Dzīvnieki
C57BL/6 peļu mātītes (Harlan, Indianapolis, Indianapolis, IN, ASV), kas eksperimenta laikā svēra 20-25 g, turēja pa piecām vienā būrī lielos kurpju kastu būros, apgaismotā (12 h gaisma/tumsa) un temperatūras kontrolētā telpā. Tika izmantotas peļu mātītes, jo ir zināms, ka tās ir ļoti jutīgas pret neirotoksisku amfetamīnu izraisītiem neironu bojājumiem, un lai saglabātu konsekvenci ar mūsu iepriekš veiktajiem metamfetamīna neirotoksicitātes pētījumiem (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Pelēm bija brīva piekļuve pārtikai un ūdenim. Wayne State University Institutional Care and Use Committee apstiprināja dzīvnieku aprūpi un eksperimentālās procedūras. Visas procedūras atbilda arī NIH rokasgrāmatai par laboratorijas dzīvnieku aprūpi un izmantošanu.
Farmakoloģiskās, fizioloģiskās un uzvedības procedūras
Peles ārstēja ar mefedronu, izmantojot binge-like režīmu, kas ietvēra 4 injekcijas pa 10, 20 vai 40 mg/kg ar 2 stundu intervālu starp katru injekciju. Šāda "binge" terapijas shēma, ja to izmanto aizvietotu amfetamīnu un katinona atvasinājumu injicēšanai, izraisa plašus DA nervu galu bojājumus. Pašlaik izmantotās mefedrona devas iepriekš tika pierādīts, ka tās nav toksiskas DA nervu galiem (Angoa-Perez et al. 2012). Peles tika apstrādātas ar metamfetamīnu (4X 2,5 vai 5 mg/kg), amfetamīnu (4X 5 mg/kg) vai MDMA (4X 20 mg/kg) atsevišķi vai kombinācijā ar mefedronu. Ja peles ārstēja ar divām narkotikām, 30 minūtes pirms katras no četrām metamfetamīna, amfetamīna vai MDMA injekcijām tām 30 min. injicēja mefedronu. Kontroles saņēma fizioloģiskā šķīduma injekcijas pēc tāda paša grafika kā mefedronam atsevišķi vai kombinācijā ar citiem amfetamīniem. Lai pārbaudītu DAT inhibitora ietekmi uz metamfetamīna toksicitāti, 30 min pirms katras metamfetamīna (4X 5 mg/kg) injekcijas pelēm 30 min pirms katras metamfetamīna (4X 5 mg/kg) injekcijas ievadīja nomifenzīnu (4X 5 mg/kg). Visas injekcijas tika ievadītas i.p. veidā. Peles tika nogalinātas 2 dienas pēc pēdējās zāļu lietošanas, kad ar amfetamīnu saistītā neirotoksicitāte bija sasniegusi maksimumu. Ķermeņa temperatūru uzraudzīja ar telemetrijas palīdzību, izmantojot Bio Medic Data Systems, Inc. (Seaford, DE, ASV) implantējamus temperatūras transponderus IPTT-300. Temperatūru neinvazīvi reģistrēja ik pēc 20 minūtēm, sākot 60 minūtes pirms pirmās METH injekcijas un turpinot 9 stundas pēc tam, izmantojot Bio Medic DAS-5001 konsoles sistēmu.
Striatālā DA satura noteikšana
Pēc apstrādes abpusēji no smadzenēm tika atdalīti striatālie audi un uzglabāti -80 °C temperatūrā. Sasaldētos audus nosvēra un sonicēja 10 tilpumos 0,16 N perhlorskābes 4 °C temperatūrā. Nešķīstošās olbaltumvielas atdalīja ar centrifugēšanu, un DA noteica ar HPLC ar elektroķīmisko detektoru, kā iepriekš aprakstīts metamfetamīna noteikšanai (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
TH un DAT olbaltumvielu līmeņa noteikšana, izmantojot imūnblotingu
Ārstēšanas ar zālēm ietekmi uz striatālā TH un DAT līmeni noteica, izmantojot imūnblotingu kā toksicitātes rādītāju striatālā DA nervu galiem. Pēc ārstēšanas peles tika nogalinātas, dekapitējot galvu, un striatums tika izoperēts abpusēji. Audus uzglabāja -80 °C temperatūrā. Sasaldētos audus izjauca ar sonikāciju 1 % SDS šķīdumā 95 °C temperatūrā, un nešķīstošo materiālu sedimentēja centrifugējot. Olbaltumvielas noteica ar bikinchonīnskābes metodi, un vienādu olbaltumvielu daudzumu (70 μg/l) izdalīja ar SDS-poliakrilamīda gēla elektroforēzi un pēc tam elektroblotēja uz nitrocelulozes. Blotus bloķēja Trisa buferšķīdumā, kas satur Tween 20 (0,1 % v/v) un 5 % beztauku sausā piena, 1 h istabas temperatūrā. Blotiem pievienoja primārās antivielas pret TH (1:1000) vai DAT (1:1000) un ļāva inkubēties 16 h 4 °C temperatūrā. Blotus 3 reizes mazgāja Trisa buferšķīduma fizioloģiskajā šķīdumā, lai noņemtu nereaģējušās antivielas, un pēc tam 1 h istabas temperatūrā inkubēja ar HRP konjugētu anti-IgG sekundāro antivielu (1:4000). Imūnreaktīvās joslas vizualizēja ar pastiprinātu ķīmiluminiscenci, un TH un DAT reaģējošo joslu relatīvo blīvumu noteica, izmantojot attēlu ar Kodak Image Station (Carestream Molecular Systems, Ročestera, Ņujorka, ASV) un kvantitatīvi, izmantojot ImageJ programmatūru (NIH).
Datu analīze
Lai analizētu metamfetamīna un mefedrona devas ietekmi uz DA, DAT un TH, tika veikta divvirzienu ANOVA. Narkotiku terapijas ietekme uz striatālā DA, TH un DAT saturu tika pārbaudīta, izmantojot vienvirziena ANOVA, kam sekoja Tukija daudzkārtējas salīdzināšanas tests. Narkotiku terapijas rezultāti attiecībā uz ķermeņa kodola temperatūru laika gaitā tika analizēti, izmantojot divvirzienu ANOVA, kam sekoja Bonferroni tests, lai noteiktu temperatūras atšķirību nozīmīgumu atsevišķos laikos pēc terapijas. Atšķirības uzskatīja par būtiskām, ja p < 0,05. Visas statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot GraphPad Prism 5.02 versiju operētājsistēmai Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, ASV, www.graphpad.com).
Iet uz:
Rezultāti
Mefedrona ietekme uz metamfetamīna izraisīto neirotoksicitāti
Mefedronu devās (10, 20 vai 40 mg/kg), par kurām ir zināms, ka tās neizraisa DA nervu galu toksicitāti (Angoa-Perez et al. 2012), ievadīja 30 min pirms katras metamfetamīna injekcijas. Metamfetamīns tika ievadīts devās, kas izraisa vidēji smagus (4X 2,5 mg/kg) vai smagus (4X 5 mg/kg) striatuma DA nervu galu bojājumus (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). Rezultāti, kas attēloti 1. attēlā, liecina, ka metamfetamīna devas (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) un mefedrona devas (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) galvenā ietekme uz DA līmeni striatumā bija ļoti nozīmīga, izmantojot divvirzienu ANOVA. Mefedrona, kas tika lietots kombinācijā ar 2,5 mg/kg (F4,22 = 35,96, p < 0,001) vai 5,0 mg/kg metamfetamīna (F4,17 = 953,9, p < 0,0001), galvenā ietekme bija ļoti nozīmīga arī ar vienvirziena ANOVA. Visas apstrādes ar abām metamfetamīna ± mefedrona devām izraisīja ievērojami lielāku DA samazinājumu salīdzinājumā ar attiecīgo kontroli (p < 0,0001 visiem). Turklāt 1. attēlā redzams, ka mefedrona devas 20 (p < 0,01) un 40 mg/kg (p < 0,001) būtiski pastiprināja 2,5 mg/kg metamfetamīna devu samazinošo ietekmi uz DA, savukārt visas mefedrona devas būtiski pastiprināja 5,0 mg/kg metamfetamīna devu ietekmi uz DA līmeni (p < 0,0001 visiem).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/sywobkqrnd-jpg.47/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
1. attēls
Mefedrona ietekme uz metamfetamīna izraisīto striatālā DA samazināšanos. Peles 30 minūtes pirms katras 2,5 (-) vai 5,0 mg/kg (■) metamfetamīna (METH) injekcijas tika apstrādātas ar norādītajām mefedrona (MEPH) devām, un pēc 2 dienām tās tika nogalinātas, lai ar HPLC noteiktu striatālā DA līmeni. Dati ir vidēji ± SEM 5-7 pelēm katrā grupā. Dažas kļūdu joslas bija pārāk mazas, lai pārsniegtu simbolu lielumu, un nav redzamas. ***p < 0,001 pret kontrolēm un #p < 0,01, ##p < 0,001 vai ###p < 0,0001 pret attiecīgo metamfetamīna devu (Tukija daudzkārtējs salīdzināšanas tests).
attēlā 2a. attēlā redzams, ka mefedrons ievērojami palielināja metamfetamīna izraisīto DAT līmeņa samazināšanos, ko nosaka ar imūnblotinga metodi. Tika veikta imunoblotu kvantitatīva noteikšana, un saskaņā ar rezultātiem attiecībā uz DA metamfetamīna devas (F1,92 = 9,48, p < 0,001) un mefedrona devas (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) galvenā ietekme uz DAT līmeni striatumā bija ļoti nozīmīga, izmantojot divvirzienu ANOVA (2.b attēls). Mefedrona, kas tika lietots kombinācijā ar 2,5 mg/kg (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) vai 5,0 mg/kg metamfetamīna (F4,39 = 24,84, p < 0,0001), galvenā ietekme bija ļoti nozīmīga arī ar vienvirziena ANOVA. Visas apstrādes ar kādu no metamfetamīna ± mefedrona devām izraisīja ievērojami lielāku DAT samazināšanos salīdzinājumā ar attiecīgo kontroli (p < 0,01 tikai 2,5 mg/kg metamfetamīna; p < 0,0001 visām pārējām apstrādēm). 2.b attēlā arī redzams, ka mefedrona devas 20 mg/kg (p < 0,01) un 40 mg/kg (p < 0,001) ievērojami pastiprināja DAT samazināšanos, ko izraisīja 2,5 mg/kg metamfetamīna, savukārt tikai 40 mg/kg mefedrona deva ievērojami pastiprināja (p < 0,01) 5,0 mg/kg metamfetamīna ietekmi uz DAT samazināšanos.
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/bfu3sx5dnr-jpg.4797/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
2. attēls
Mefedrona ietekme uz metamfetamīna izraisīto striatālā DAT samazināšanos. Peles 30 minūtes pirms katras 2,5 (●) vai 5,0 mg/kg (■) metamfetamīna (METH) injekcijas tika apstrādātas ar norādītajām mefedrona (MEPH) devām, un pēc 2 dienām tās tika nogalinātas, lai noteiktu striatālā DAT līmeni ar imūnblotinga metodi (a). Blotus kvantitatīvi novērtēja, izmantojot ImageJ, un dati ir vidēji ± SEM 10-12 pelēm katrā grupā (b). *p < 0,01 vai ***p < 0,0001 pret kontroli (C) un #p < 0,01 vai ##p < 0,001 pret attiecīgo metamfetamīna devu (Tukey's daudzkārtējs salīdzināšanas tests).
attēlā 3a. attēlā redzams, ka mefedrons ievērojami palielināja metamfetamīna izraisīto TH līmeņa samazināšanos, ko nosaka ar imūnblotinga metodi. Tika veikta imunoblotu kvantitatīva noteikšana, un saskaņā ar iepriekš minētajiem rezultātiem attiecībā uz DA un DAT metamfetamīna devas (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) un mefedrona devas (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) galvenie efekti bija ļoti nozīmīgi, izmantojot divvirzienu ANOVA (3.b attēls). Mefedrona, kas lietots kombinācijā ar 2,5 mg/kg (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) vai 5,0 mg/kg metamfetamīna (F4,49 = 99,16, p < 0,0001), galvenā ietekme bija ļoti nozīmīga arī vienvirziena ANOVA. Visas apstrādes ar kādu no metamfetamīna ± mefedrona devām izraisīja ievērojami lielāku TH samazinājumu salīdzinājumā ar attiecīgo kontroli (p < 0,001 2,5 mg/kg metamfetamīna + 10 mg/kg mefedrona gadījumā; p < 0,0001 visām pārējām kombinācijām), izņemot tikai 2,5 mg/kg metamfetamīna, kas būtiski nemainīja TH līmeni (t. i., nebija toksicitātes). 3.b attēlā arī redzams, ka mefedrona devas 20 mg/kg (p < 0,01) un 40 mg/kg (p < 0,001) būtiski pastiprināja TH samazināšanos, ko izraisīja 2,5 mg/kg metamfetamīna, un visas trīs mefedrona devas būtiski (p < 0,0001) pastiprināja 5,0 mg/kg metamfetamīna ietekmi uz TH samazināšanos.
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/tggfrjpqru-jpg.4798/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
3. attēls
Mefedrona ietekme uz metamfetamīna izraisīto striatālā TH samazināšanos. Peles 30 minūtes pirms katras 2,5 (●) vai 5,0 mg/kg (■) metamfetamīna (METH) injekcijas tika apstrādātas ar norādītajām mefedrona (MEPH) devām, un pēc 2 dienām tās tika nogalinātas, lai noteiktu TH līmeni striatā ar imūnblotinga metodi (a). Blotus kvantitatīvi novērtēja, izmantojot ImageJ, un dati ir vidēji ± SEM 10-12 pelēm katrā grupā (b). Dažas kļūdu svītras bija pārāk mazas, lai pārsniegtu simbolu lielumu, un nav redzamas. **p < 0,001 vai ***p < 0,0001 pret kontroli (C) un #p < 0,01, ##p < 0,001 vai ####p < 0,0001) pret attiecīgo metamfetamīna devu (Tukey's multiple comparison test).
Mefedrona ietekme uz metamfetamīna izraisītu hipertermiju
Mefedrons, tāpat kā metamfetamīns, izraisa ievērojamu hipertermiju (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Kad mefedrons tika ievadīts 30 minūtes pirms katras metamfetamīna injekcijas, 4. attēlā redzams, ka metamfetamīna un mefedrona devas (F1,300 = 11,99, p < 0,0001) galvenā ietekme uz laiku (F4,300 = 51,73, p < 0,0001) bija ļoti nozīmīga, izmantojot divvirzienu ANOVA. Mefedrona, kas tika lietots kombinācijā ar 2,5 mg/kg metamfetamīna (F4,120 = 41,44, p < 0,0001, a panelis) laika gaitā (F30,120 = 3,84, p < 0,0001) vai 5,0 mg/kg metamfetamīna (F4,120 = 78,09, p < 0,0001, b panelis) laika gaitā (F30,120 = 9,98, p < 0,0001), galvenā ietekme arī bija ļoti nozīmīga ar divvirzienu ANOVA. Visas apstrādes ar abām metamfetamīna ± mefedrona devām būtiski atšķīrās no attiecīgajām kontrolēm (p < 0,0001 visām apstrādēm).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/x0ik9hdwsw-jpg.4799/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
4. attēls
Mefedrona ietekme uz metamfetamīna izraisītu hipertermiju. Peles tika apstrādātas ar norādītajām mefedrona (MEPH) devām 30 min pirms katras 2,5 (a) vai 5,0 mg/kg (b) metamfetamīna (METH) injekcijas. Ar telemetrijas palīdzību ar 20 min intervālu tika mērīta serdes temperatūra, sākot 60 min pirms pirmās metamfetamīna injekcijas. Četras metamfetamīna injekcijas ir norādītas ar bultiņām, kas atrodas uz x ass. Dati izteikti kā vidējā ķermeņa temperatūra 6-8 pelēm katrā grupā. SEM vienmēr bija < 10 % no vidējās vērtības, un skaidrības labad tie nav norādīti.
Mefedrona ietekme uz amfetamīna un MDMA izraisīto neirotoksicitāti
Lai pārbaudītu, vai mefedrona pastiprinošo ietekmi uz metamfetamīnu var attiecināt arī uz citiem neirotoksiskiem amfetamīniem, peles tika apstrādātas ar šo β-ketoamfetamīnu (20 mg/kg) plus amfetamīnu (4X 5 mg/kg) vai MDMA (4X 20 mg/kg), un rezultāti ir parādīti 5. attēlā. Atgādinām, ka mefedrons pats par sevi nesamazina striatālā DA, DAT vai TH (Angoa-Perez et al. 2012). Galvenā zāļu ietekme (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) bija ļoti nozīmīga, izmantojot vienvirziena ANOVA attiecībā uz DA samazinājumu (5.a attēls). Tāpat 5.a attēlā redzams, ka visas apstrādes ar amfetamīnu (p < 0,001) vai MDMA (p < 0,001) atsevišķi vai kombinācijā ar mefedronu (p < 0,0001 abām zālēm) būtiski pazemināja DA līmeni salīdzinājumā ar kontroli. Mefedrons ievērojami pastiprināja amfetamīna (p < 0,01) vai MDMA (p < 0,01) izraisīto DA samazināšanos. b attēlā redzama līdzīga kombinētās zāļu terapijas ietekme uz DAT līmeni striatumā. Galvenā zāļu ietekme (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) bija ļoti nozīmīga, izmantojot vienvirziena ANOVA attiecībā uz DAT. Arī 5.b attēlā redzams, ka visu apstrādes ar amfetamīnu vai MDMA līmenis bija ievērojami (p < 0,0001 visiem) zemāks, salīdzinot ar kontroli. Mefedrons arī būtiski palielināja DAT samazinājumu, ko izraisīja amfetamīns vai MDMA (p < 0,0001 abos gadījumos). Visbeidzot, 5.c attēlā redzams, ka zāļu galvenā ietekme (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) bija ļoti nozīmīga, izmantojot vienvirziena ANOVA attiecībā uz TH samazināšanos. Tāpat 5.c attēlā redzams, ka visos apstrādes gadījumos ar amfetamīnu vai MDMA TH līmenis bija ievērojami (p < 0,0001 visos gadījumos) zemāks, salīdzinot ar kontroli. Mefedrons arī būtiski palielināja amfetamīna vai MDMA izraisīto TH samazinājumu (p < 0,0001 abos gadījumos).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/onvypkgxvn-jpg.4800/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
5. attēls
Mefedrona ietekme uz amfetamīna vai MDMA izraisīto DA nervu galu neirotoksicitāti. Peles 30 min pirms katras 5,0 mg/kg amfetamīna (AMPH) vai 20 mg/kg MDMA injekcijas tika apstrādātas ar 20 mg/kg mefedrona (MEPH) un 2d pēc apstrādes nogalinātas, lai ar HPLC noteiktu a) DA līmeni striatālajā striatā. (b) DAT un (c) TH noteica, izmantojot imūnblotu, un blotus kvantitatīvi novērtēja, izmantojot ImageJ. Reprezentatīvi imūnblotu paraugi DAT un TH ir iekļauti attiecīgi b) un c) paneļa ieliktņos, un abu paneļu apstrādes veidi ir apzīmēti ar 1,5: kontrole; 2,6: MEPH; 3: AMPH; 4: AMPH + MEPH; 7: MDMA; un 8: MDMA + MEPH. Dati ir vidēji ± SEM 5-12 pelēm katrā grupā. **p < 0,001 vai ***p < 0,0001 pret kontroli un #p < 0,01 vai ###p < 0,0001 pret AMPH vai MDMA (Tukey's multiple comparison test).
Nomifensīna ietekme uz metamfetamīna izraisītu neirotoksicitāti
Nomifensīna, spēcīga DAT blokatora, kam nav zināms ļaunprātīgas izmantošanas vai neirotoksisks potenciāls, spēja aizsargāt pret metamfetamīna izraisītu neirotoksicitāti un pretstatā mefedrona ietekmei uz metamfetamīna, amfetamīna un MDMA izraisīto DA nervu galu toksicitāti tika pārbaudīta. Rezultāti 6.a attēlā liecina, ka, izmantojot vienvirziena ANOVA, zāļu galvenā ietekme (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) uz DA līmeni bija ļoti nozīmīga. Nomifensīns vien nemainīja DA līmeni, bet metamfetamīna (p < 0,0001) izraisīto samazinājumu nedaudz, bet būtiski mazināja nomifensīns (p < 0,01). Galvenā zāļu ietekme (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) uz DAT līmeni bija ļoti nozīmīga, izmantojot vienvirziena ANOVA, kā parādīts 6.b attēlā. Nomifensīns nemainīja DAT līmeni, bet nodrošināja nozīmīgu aizsardzību (p < 0,001) pret metamfetamīna (p < 0,0001) izraisīto striatālā DAT samazināšanos salīdzinājumā ar kontroli. Visbeidzot, 6.c attēlā redzams, ka zāļu galvenā ietekme (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) uz TH līmeni bija ļoti nozīmīga, izmantojot vienvirziena ANOVA. Kā redzams attiecībā uz DA un DAT, metamfetamīna (p < 0,0001) izraisīto TH samazināšanos nedaudz, bet nozīmīgi novērsa nomifensīns (p < 0,01).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/daczg9cwfv-jpg.4801/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
attēls. 6. attēls.
Nomifensīna ietekme uz metamfetamīna izraisīto DA nervu galu neirotoksicitāti. Peles 30 min pirms katras 5,0 mg/kg metamfetamīna (METH) injekcijas tika apstrādātas ar 5,0 mg/kg nomifensīna (NOM) un 2d vēlāk nogalinātas, lai ar HPLC noteiktu (a) DA līmeni striatālā. (b) DAT un (c) TH noteica, izmantojot imūnblotu, un blotus kvantitatīvi novērtēja, izmantojot ImageJ. Reprezentatīvi imūnblotu paraugi DAT un TH ir iekļauti b) un c) paneļu ieliktņos. Dati ir vidēji plus SEM 5-7 pelēm katrā grupā. ***p < 0,0001 pret kontroli (C) un #p < 0,01 vai ##p < 0,001 pret metamfetamīnu vien (Tukey's multiple comparison test).
Diskusija .
Šī pētījuma mērķis bija noteikt, vai mefedrons novērš metamfetamīna izraisīto DA nervu galu toksicitāti. Pamatojoties uz tā ķīmisko līdzību ar metamfetamīnu un MDMA, sākotnēji tika sagaidīts, ka mefedrons kaitīgi ietekmēs DA neironu sistēmu. Tomēr vairākos pētījumos gandrīz vienlaicīgi tika konstatēts, ka mefedrons nav toksisks DA nervu galiem (Angoa-Perez u. c. 2012, Baumann u. c. 2012, Hadlock u. c. 2011). Jautājums par to, vai šis medikaments izraisa 5-HT neironu sistēmas bojājumus, joprojām ir atklāts. Vienā pētījumā ziņots par noturīgu 5-HT nervu galotņu funkcijas samazināšanos (Hadlock et al. 2011), savukārt citā pētījumā konstatēts, ka mefedrons neizraisa bojājumus (Baumann et al. 2012). Mefedrons mijiedarbojas ar DA nervu galotni tādā veidā, kas liek domāt, ka tas patiešām stimulē atbrīvošanos un bloķē DA atpakaļsaistīšanos, mijiedarbojoties ar DAT. Metamfetamīna neirotoksiskā darbības mehānisma galvenais aspekts ir tā spēja caur DAT piekļūt DA nervu galotnēm un izjaukt DA homeostāzi (Sulzer 2011). Ja šo agrīno metamfetamīna neirotoksiskās kaskādes posmu novērš, inhibējot DAT, toksicitāte tiek novērsta (Pu et al. 1994, Poth et al. 2012, Marek et al. 1990, Schmidt and Gibb 1985). Mēs uzskatījām, ka mefedronam varētu būt tāda pati aizsargājošā īpašība kā citiem DAT inhibitoriem, bet tā vietā novērojām būtisku toksicitātes pastiprināšanos. Šī mijiedarbība tika novērota, izmantojot divas dažādas metamfetamīna devas, kas izraisa vidējus vai smagus DA nervu galu bojājumus (attiecīgi 4X 2,5 vai 5,0 mg/kg). Šī mefedrona pastiprinošā ietekme neaprobežojās tikai ar metamfetamīnu un attiecās arī uz amfetamīnu un MDMA - divām narkotikām, kuras bieži lieto kopā ar mefedronu un citiem β-ketoamfetamīniem (Feyissa un Kelly 2008, Schifano et al. 2011, Kelly 2011). Tāpēc, neraugoties uz to, ka mefedrons neizraisa toksicitāti vismaz striatuma DA nervu galiem, tas pastiprina citu narkotisko vielu neirotoksisko iedarbību. Šim jaunajam atklājumam vajadzētu vēl vairāk saasināt mefedrona ļaunprātīgu lietošanu, jo mefedronam piemītošās neirotoksicitātes trūkums var likt tam šķist nekaitīgam.
Hipertermija ir bieži ziņots par metamfetamīna (Greene et al. 2008) un β-ketoamfetamīna uzņemšanas akūtu nelabvēlīgu ietekmi uz cilvēkiem (Borek un Holstege 2012, Prosser un Nelson 2012). Tāpat kā metamfetamīns, arī daudzas β-ketoamfetamīna narkotikas grauzējiem izraisa būtisku ķermeņa temperatūras paaugstināšanos (Angoa-Perez et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Rockhold et al. 1997). Lai gan metamfetamīna izraisītā hipertermija varētu veicināt tā morfoloģisko un neironus bojājošo ietekmi, nav obligāti, ka hipertermija ir šo seku tiešais cēlonis (Kiyatkin un Sharma 2009). Mēs reģistrējām ar mefedronu un metamfetamīnu ārstētu peļu ķermeņa vidējo temperatūru un novērojām, ka kombinētā terapija nepalielināja temperatūru vairāk par maksimālo pieaugumu, kas novērots pēc vienas vai otras zāles lietošanas atsevišķi. Metamfetamīns izraisīja ar devu saistītu ķermeņa temperatūras paaugstināšanos, un šī hipertermija bija nemainīga visā testētajā mefedrona devu diapazonā. Patiesībā pēc mefedrona lietošanas novērotais ķermeņa temperatūras kritums pēc injekcijas (Angoa-Perez u. c. 2012) saglabājās, lietojot lielākas mefedrona un metamfetamīna devas. Lai gan narkotiku izraisītā hipertermija netika pastiprināta, lietojot kombinētās zāles, neirotoksiskā ietekme bija papildinoša. Tāpēc vismaz šajā gadījumā šķiet, ka mefedrons var pastiprināt metamfetamīna neirotoksisko iedarbību neatkarīgi no hipertermijas.
Mefedrons nepārprotami inhibē DAT funkciju un bloķē DA atpakaļsaistīšanu in vitro (Lopez-Arnau et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Kehr et al. 2011, Martinez-Clemente et al. 2012, Cozzi et al. 1999). Mefedrons izspiež WIN-35,428 no tā saistīšanās vietas DAT, kas liecina, ka tas ir konkurējošs DA uzņemšanas inhibitors (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). Mefedrona iedarbība šajā ziņā ir ļoti līdzīga metamfetamīna (Cozzi et al. 1999) un MDMA (Escubedo et al. 2011) iedarbībai. Nav zināms, vai mefedronu pārnēsā DAT, bet metkatinonu pārnēsā (Cozzi un Foley 2003). Nomifenzīns un amfonelskābe, kas saistās ar DAT un inhibē DA uzņemšanu, nodrošina būtisku aizsardzību pret metamfetamīna izraisītu neirotoksicitāti (Pu et al. 1994, Marek et al. 1990, Schmidt un Gibb 1985, Poth et al. 2012), un peles, kurām trūkst DAT, ir rezistentas pret metamfetamīna neironālo toksicitāti (Fumagalli et al. 1998). Zinot, ka mefedrons nav neirotoksisks un ir DAT blokators, var prognozēt, ka tam vajadzētu novērst toksicitāti. Šajā sakarā mēs pārbaudījām nomifenzīnu kā pozitīvu kontroli un apstiprinājām, ka tas aizsargā pret metamfetamīna izraisītu DA, DAT un TH izsmelšanu. Nomifensīns inhibē arī norepinefrīna transportētāju (Brogden et al. 1979), bet šī īpašība nevar izskaidrot pašreizējos rezultātus, jo lielākā daļa β-ketoamfetamīnu, tostarp mefedrons, inhibē norepinefrīna transportētāju un bloķē norepinefrīna uzsūkšanos (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). Iespējama 5-HT neironu sistēmas nozīme dažās mefedrona farmakoloģiskajās darbībās, ņemot vērā šīs narkotikas, tāpat kā MDMA (Yamamoto et al. 1995), spēju izraisīt striatālā DA izplūdi, mijiedarbojoties ar 5-HT2A receptoriem (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). Mefedrona izraisītā hiperlokomocija ir atkarīga no endogēnā 5-HT (Lopez-Arnau et al. 2012), un šī narkotika arī stimulē 5-HT izdalīšanos un kavē tā uzsūkšanos in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) un in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). Tomēr mēs varam izslēgt endogēnā 5-HT lomu vismaz metamfetamīna DA neirotoksicitātē, pierādot, ka peles, kurām ģenētiski atņemts 5-HT, saglabā jutību pret neirotoksicitāti (Thomas et al. 2010).
Mefedrons varētu pastiprināt metamfetamīna neirotoksicitāti, izmantojot vairākus iespējamus mehānismus. Pirmkārt, mefedrons varētu mijiedarboties ar VMAT, izraisot DA noplūdi presinaptisko nervu galu citoplazmā. Ārstēšana, kas palielina citoplazmas (t. i., zāļu izvadāmā) DA daudzumu, palielina metamfetamīna neirotoksicitāti (Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009, Schmidt et al. 1985). Šis mehānisms ir maz ticams, jo metkatinons tikai vāji mijiedarbojas ar VMAT (Cozzi et al. 1999). Otrkārt, mefedrona un metamfetamīna kombinācijai varētu būt sinerģiska ietekme uz DA atbrīvošanos ārpus vezikulām, bet arī šī iespēja šķiet maz ticama, ņemot vērā rezultātus, kas liecina, ka DAT vai SERT ekspresējošu CHO šūnu apstrādei ar mefedronu un metamfetamīnu nav aditīvas ietekmes uz DA vai 5-HT atbrīvošanos (Sogawa et al. 2011). Treškārt, mefedrons varētu mijiedarboties ar DAT jaunā veidā, kas veicina papildu toksicitāti. Ir pierādīts, ka metilons kombinācijā ar metamfetamīnu izraisa sinerģisku citotoksicitāti CHO šūnās, kas ekspresē DAT vai SERT, bet ne savvaļas tipa CHO šūnās, kurās nav transportieru (Sogawa et al. 2011). Šajos pētījumos kultivētajās šūnās novērotā citotoksicitāte (t. i., LDH izdalīšanās) ļoti atšķiras no metamfetamīna izraisītā DA nervu galu bojājuma, taču šis mehānisms liecina par interesantu, bet nenoteiktu DAT lomu pastiprinātā citotoksicitātē. Visbeidzot, mefedrons varētu mainīt metamfetamīna metabolismu. Mefedrons, tāpat kā metamfetamīns un MDMA, galvenokārt tiek metabolizēts N-demetilējot (Meyer un Maurer 2010) (Caldwell 1976). Šo mehānismu apstiprina pierādījumi, ka metamfetamīns un MDMA savstarpēji inhibē savu primāro metabolītu veidošanos un paaugstina narkotiku līmeni plazmā virs tā, kāds novērojams pēc vienas vai otras narkotikas lietošanas (Kuwayama et al. 2012). Pašlaik un mūsu iepriekšējā pētījumā (Angoa-Perez et al. 2012) izmantotās mefedrona devas, lai gan tās ir lielas, nav neirotoksiskas un ietilpst cilvēku ļaunprātīgi lietoto devu diapazonā (McErath and O'Neill 2011). Tāpēc mefedrons varētu darboties tāpat kā MDMA, palielinot metamfetamīna līmeni plazmā, kavējot tā metabolismu. Lai apstiprinātu šo pēdējo iespēju, būs jāveic padziļināta farmakokinētiskā analīze.
β-ketoamfetamīnu ļaunprātīga lietošana pieaug satraucošā ātrumā, un mefedrons pašlaik ir viena no visbiežāk lietotajām narkotikām pēc marihuānas, MDMA un kokaīna (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Turklāt, salīdzinot ar MDMA, mefedrons cilvēkiem izraisa spēcīgāku alkas sajūtu (Brunt et al. 2011), un lietotāji, kas šņauc mefedronu, uzskata, ka tas izraisa lielāku atkarību nekā kokaīns (Winstock et al. 2011b). Mefedronu cilvēki patērē uzdzeršanas veidā (t. i., "stacking"), un to bieži lieto kopā ar citām narkotikām, piemēram, marihuānu un amfetamīna psihostimulantiem (Schifano et al. 2011, Fass et al. 2012, Winstock et al. 2011a, Kelly 2011, Torrance and Cooper 2010). Mefedrons aizvien biežāk ir sastopams tabletēs, ko pārdod kā MDMA (Brunt et al. 2011), un tā lietošana, visticamāk, pārsniegs MDMA lietošanu, jo šīs pēdējās narkotikas tīrība turpina samazināties (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Pamatojoties uz mefedrona un citu "vannas sāļu" sastāvdaļu izplatītajiem ļaunprātīgas lietošanas veidiem, ir svarīgi apsvērt, vai cilvēkiem rodas papildu risks veselībai, ja šīs narkotikas tiek apzināti vai neapzināti kombinētas ar amfetamīniem. Mūsu rezultāti, kas liecina, ka vismaz mefedrons ievērojami pastiprina metamfetamīna, amfetamīna un MDMA izraisīto neirotoksicitāti striatuma DA nervu galiem, atklāj īpaši bīstamu un negaidītu šī β-ketoamfetamīna īpašību.
Izmantotie saīsinājumi
5-HT serotonīns
DA dopamīns
DAT DA transportieris
MDMA 3,4-metilēndioksimetamfetamīns
TH tirozīna hidroksilāze
VMAT vezikulārais monoamīnu transportētājs
