Genetische technologieën, die aan het einde van de vorige eeuw hun intrede deden in het menselijk leven, hebben onze wereld zodanig veranderd dat deze nu al ondenkbaar is zonder deze technologieën. Deze technologieën zijn er ook in geslaagd door te dringen in de forensische wetenschap; al tientallen jaren wordt genetische identificatie gebruikt als een snelle en relatief goedkope methode om criminelen op te sporen en hun daden op te lossen zonder het laboratorium te verlaten. Als farmacoloog van opleiding ben ik zeer geïnteresseerd in genetica en bestudeer ik dit gebied graag in al zijn aspecten. In deze publicatie laat ik je kennismaken met klassieke genetische benaderingen op het gebied van forensisch onderzoek.
Een stukje geschiedenis of wat heeft het met ridders te maken?
150 jaar geleden ontdekte Johannes Friedrich Miescher nucleïnezuren, een concept dat uiteindelijk de wereld op zijn kop zette [1]. Tegen het midden van de 20e eeuw werd duidelijk dat DNA en RNA dragers waren van erfelijke informatie; toen werd hun structuur beschreven en iets later verschenen er talloze methoden waarmee deze moleculen in vitro konden worden "geknipt" met behulp van cellulaire enzymen - restrictases [2]; ze konden worden versterkt met behulp van PCR [3]; en zelfs de volgorde van specifieke genen en genomen kon worden afgelezen met behulp van meervoudige sequentiebepalingsmethoden [4].
Aanvankelijk werd het werk met genetisch materiaal letterlijk "in de keuken" uitgevoerd en kon het zelfs in het naburige wetenschappelijke laboratorium niet altijd gereproduceerd worden. Maar de tijd verstreek, benaderingen veranderden en methoden werden zodanig gestandaardiseerd dat ze geleidelijk werden geïntroduceerd in toegepast onderzoek en zelfs biotechnologische productie.
In 1984 werd de wetenschappelijke gemeenschap opgeschrikt door het nieuws dat wetenschappers erin waren geslaagd om een fragment DNA van de Burchell zebra te isoleren en af te lezen. Deze zebra is uitgestorven en komt alleen nog voor in museumcollecties [5]. Een jaar later bevestigde de Zweedse geneticus Svante Pääbo de mogelijkheid om museum- en archeologisch materiaal te gebruiken voor fundamenteel wetenschappelijk onderzoek, nadat hij eerst het genetisch materiaal van Egyptische mummies had geanalyseerd. Jaren later bleek dat de monsters die hij analyseerde besmet waren met modern genetisch materiaal [6], maar de ontwikkeling van sequentiemethoden maakte het toch mogelijk om zelfs met minimale hoeveelheden slecht bewaard DNA te werken.
Forensische wetenschappers waren ook geïnteresseerd in de nieuwe technieken voor de analyse van genetisch materiaal. De methoden van klassieke dactyloscopie en bloedgroepanalyse, die in die tijd gebruikelijk waren, hadden namelijk hun beperkingen en in sommige gevallen pakten ze verkeerd uit.
In 1984 ontwikkelde en presenteerde de Britse wetenschapper Sir Alec John Jeffreys (Afbeelding 3) een methode om een persoon te identificeren aan de hand van zijn genetisch materiaal. Later werd deze aanpak DNA-identificatie genoemd en won hij liefde en respect van criminologen over de hele wereld. Jeffreys werd geridderd voor zijn werk.
Een stukje geschiedenis of wat heeft het met ridders te maken?
150 jaar geleden ontdekte Johannes Friedrich Miescher nucleïnezuren, een concept dat uiteindelijk de wereld op zijn kop zette [1]. Tegen het midden van de 20e eeuw werd duidelijk dat DNA en RNA dragers waren van erfelijke informatie; toen werd hun structuur beschreven en iets later verschenen er talloze methoden waarmee deze moleculen in vitro konden worden "geknipt" met behulp van cellulaire enzymen - restrictases [2]; ze konden worden versterkt met behulp van PCR [3]; en zelfs de volgorde van specifieke genen en genomen kon worden afgelezen met behulp van meervoudige sequentiebepalingsmethoden [4].
Aanvankelijk werd het werk met genetisch materiaal letterlijk "in de keuken" uitgevoerd en kon het zelfs in het naburige wetenschappelijke laboratorium niet altijd gereproduceerd worden. Maar de tijd verstreek, benaderingen veranderden en methoden werden zodanig gestandaardiseerd dat ze geleidelijk werden geïntroduceerd in toegepast onderzoek en zelfs biotechnologische productie.
In 1984 werd de wetenschappelijke gemeenschap opgeschrikt door het nieuws dat wetenschappers erin waren geslaagd om een fragment DNA van de Burchell zebra te isoleren en af te lezen. Deze zebra is uitgestorven en komt alleen nog voor in museumcollecties [5]. Een jaar later bevestigde de Zweedse geneticus Svante Pääbo de mogelijkheid om museum- en archeologisch materiaal te gebruiken voor fundamenteel wetenschappelijk onderzoek, nadat hij eerst het genetisch materiaal van Egyptische mummies had geanalyseerd. Jaren later bleek dat de monsters die hij analyseerde besmet waren met modern genetisch materiaal [6], maar de ontwikkeling van sequentiemethoden maakte het toch mogelijk om zelfs met minimale hoeveelheden slecht bewaard DNA te werken.
Forensische wetenschappers waren ook geïnteresseerd in de nieuwe technieken voor de analyse van genetisch materiaal. De methoden van klassieke dactyloscopie en bloedgroepanalyse, die in die tijd gebruikelijk waren, hadden namelijk hun beperkingen en in sommige gevallen pakten ze verkeerd uit.
In 1984 ontwikkelde en presenteerde de Britse wetenschapper Sir Alec John Jeffreys (Afbeelding 3) een methode om een persoon te identificeren aan de hand van zijn genetisch materiaal. Later werd deze aanpak DNA-identificatie genoemd en won hij liefde en respect van criminologen over de hele wereld. Jeffreys werd geridderd voor zijn werk.
DNA dactyloscopie: voor- en nadelen
Genetische analyse van biologische monsters verkregen op plaatsen delict heeft het werk van rechercheurs enorm vereenvoudigd. Ze hebben nu een betrouwbaar hulpmiddel om de dader of het slachtoffer te identificeren, onweerlegbaar bewijs te verkrijgen en misdaden op te lossen.
De belangrijkste voordelen van genetische vingerafdrukken zijn de mogelijkheid om zelfs met kleine hoeveelheden biologisch materiaal te werken en de hoge nauwkeurigheid waarmee een persoon kan worden geïdentificeerd - als aan alle eisen voor analyse wordt voldaan, is de betrouwbaarheid meer dan 99%. Deze benadering is een van de belangrijkste geworden in het onderzoek naar misdaden [7].
Het is belangrijk om op te merken dat met klassieke DNA-dactyloscopiemethoden geen eeneiige tweelingen met hetzelfde genetische profiel kunnen worden geïdentificeerd, omdat ze uit dezelfde bevruchte eicel zijn ontstaan.
Voor DNA-analyse is allereerst DnA zelf nodig, maar het is lang niet altijd mogelijk om genetisch materiaal van hoge kwaliteit te extraheren uit biologische monsters die zijn blootgesteld aan chemische en thermische factoren. Eenmaal in de omgeving komt deze molecule in chemische reacties terecht, wordt vernietigd (gefragmenteerd) en gewijzigd, hoewel het in gunstige omstandigheden duizenden jaren kan overleven [8].
Het is bekend dat het oudste genetische materiaal van menselijke voorouders werd gewonnen uit de botresten van onze mensachtige verwanten die ongeveer 430 duizend jaar geleden leefden op het grondgebied van het Iberisch schiereiland (Sierra de Atapuerca) [9]. Het specifieke microklimaat van sommige grotten met lage vochtigheids- en temperatuurwaarden verhoogt de levensduur van het genetisch materiaal aanzienlijk. DNA in de monsters die op de plaats delict zijn gevonden, is echter vaak in minimale hoeveelheden aanwezig en is, net als in archeologische monsters, sterk aangetast.
In Europa en de Verenigde Staten wordt de aandacht gevestigd op een ander nadeel van genetische vingerafdrukken, dat te maken heeft met inmenging in iemands privacy en schending van de privacy.
Mensenrechtenactivisten vrezen dat de genetische informatie van criminelen en verdachten in handen van derden kan vallen en vervolgens kan worden misbruikt [10]. Er zijn bijvoorbeeld al gevallen bekend van het gebruik van genetische informatie om moslimminderheden in de Chinese provincie Xinjiang te controleren.
De VS zijn ook van plan om systematisch DNA-profielen te verzamelen van immigranten die in federale hechtenis zitten [11]. Het is duidelijk dat de angsten van mensenrechtenactivisten niet ongegrond zijn en reële gronden hebben.
De belangrijkste voordelen van genetische vingerafdrukken zijn de mogelijkheid om zelfs met kleine hoeveelheden biologisch materiaal te werken en de hoge nauwkeurigheid waarmee een persoon kan worden geïdentificeerd - als aan alle eisen voor analyse wordt voldaan, is de betrouwbaarheid meer dan 99%. Deze benadering is een van de belangrijkste geworden in het onderzoek naar misdaden [7].
Het is belangrijk om op te merken dat met klassieke DNA-dactyloscopiemethoden geen eeneiige tweelingen met hetzelfde genetische profiel kunnen worden geïdentificeerd, omdat ze uit dezelfde bevruchte eicel zijn ontstaan.
Voor DNA-analyse is allereerst DnA zelf nodig, maar het is lang niet altijd mogelijk om genetisch materiaal van hoge kwaliteit te extraheren uit biologische monsters die zijn blootgesteld aan chemische en thermische factoren. Eenmaal in de omgeving komt deze molecule in chemische reacties terecht, wordt vernietigd (gefragmenteerd) en gewijzigd, hoewel het in gunstige omstandigheden duizenden jaren kan overleven [8].
Het is bekend dat het oudste genetische materiaal van menselijke voorouders werd gewonnen uit de botresten van onze mensachtige verwanten die ongeveer 430 duizend jaar geleden leefden op het grondgebied van het Iberisch schiereiland (Sierra de Atapuerca) [9]. Het specifieke microklimaat van sommige grotten met lage vochtigheids- en temperatuurwaarden verhoogt de levensduur van het genetisch materiaal aanzienlijk. DNA in de monsters die op de plaats delict zijn gevonden, is echter vaak in minimale hoeveelheden aanwezig en is, net als in archeologische monsters, sterk aangetast.
In Europa en de Verenigde Staten wordt de aandacht gevestigd op een ander nadeel van genetische vingerafdrukken, dat te maken heeft met inmenging in iemands privacy en schending van de privacy.
Mensenrechtenactivisten vrezen dat de genetische informatie van criminelen en verdachten in handen van derden kan vallen en vervolgens kan worden misbruikt [10]. Er zijn bijvoorbeeld al gevallen bekend van het gebruik van genetische informatie om moslimminderheden in de Chinese provincie Xinjiang te controleren.
De VS zijn ook van plan om systematisch DNA-profielen te verzamelen van immigranten die in federale hechtenis zitten [11]. Het is duidelijk dat de angsten van mensenrechtenactivisten niet ongegrond zijn en reële gronden hebben.
Hoe werkt het?
DNA dactyloscopie methoden zijn gebaseerd op menselijke genetische variabiliteit. Nucleotidevervangingen in het DNA (afhankelijk van de frequentie in de populatie worden ze ook DNA-polymorfismen of mutaties genoemd) maken ons individueel verschillend. En deze verschillen zijn te vinden in zowel het nucleaire als het mitochondriale genoom, kleine cirkelvormige DNA-moleculen die het functioneren van mitochondriën, de energie-"fabrieken" van cellen, regelen.
Er moet worden opgemerkt dat DNA-polymorfismen in het genoom van ieder van ons te vinden zijn - ze worden onze unieke DNA-barcode. Sommige kunnen ernstige ziekten veroorzaken [12], maar in de meeste gevallen hebben ze geen effect op onze vitale functies.
Moderne DNA dactyloscopie methoden gebruiken een verscheidenheid aan genetische varianten in verschillende regio's van het genoom. Bijvoorbeeld, analyse van tandem herhalingen - korte herhalende genoomsequenties waarvan het aantal verschilt in twee willekeurig bemonsterde individuen [13] - maakt een duidelijke vaderschapstest of het vinden van aanvullend bewijs tegen een verdachte van een misdrijf mogelijk.
Y-chromosomale DNA-markers kunnen worden gebruikt om het geslacht van een persoon te bepalen. Genetische markers geven informatie over de etniciteit van iemands familieleden, oogkleur of haarkleur.
Bovendien maakt epigenetische informatie (bijv. DNA-methylering) het mogelijk om de biologische leeftijd van individuele cellen, weefsels en het organisme als geheel in te schatten [14]. In dit artikel zal ik meer vertellen over bovenstaande methoden van genetische analyse. En het gebruik van epigenetische methoden in de geneesmiddelenindustrie zal het onderwerp zijn van mijn volgende publicatie.
Y-chromosomale DNA-markers kunnen worden gebruikt om het geslacht van een persoon te bepalen. Genetische markers geven informatie over de etniciteit van iemands familieleden, oogkleur of haarkleur.
Bovendien maakt epigenetische informatie (bijv. DNA-methylering) het mogelijk om de biologische leeftijd van individuele cellen, weefsels en het organisme als geheel in te schatten [14]. In dit artikel zal ik meer vertellen over bovenstaande methoden van genetische analyse. En het gebruik van epigenetische methoden in de geneesmiddelenindustrie zal het onderwerp zijn van mijn volgende publicatie.
DNA verzamelen en isoleren uit biologisch materiaal
DNA-extractie en -analyse uit forensische monsters is op het eerste gezicht vergelijkbaar met kunst. Soms is het onmogelijk voor te stellen dat een paar druppels bloed of een stukje huid onder de vingernagels van een slachtoffer het belangrijkste bewijs in een strafrechtelijk onderzoek kunnen worden.
In feite zijn de handelingen van forensische specialisten op de plaats delict nauwkeurig afgestemd en volgen ze een enkel scenario, waarvan een van de hoofddoelen het vinden van biologisch materiaal is dat geschikt is voor DNA-extractie. Hiervoor kunnen alle biologische weefsels en menselijke afscheidingen worden gebruikt .
- Botresten
- Tanden
- Haarzakjes
- Bloed
- Epitheelcellen
- Zweet
- Speeksel
- Spermamonsters
- Uitwerpselen, enz.
Biomateriaal in het bewijsmateriaalmagazijn kan tientallen jaren meegaan. Vaak neemt de onderzoeker slechts een deel van het materiaal voor onderzoek, net zoveel als hij nodig heeft voor DNA-extractie. Als er bijvoorbeeld bloedsporen op het mes zitten, wast de expert niet al het bloed af, maar maakt hij een kleine spoeling vlak voor de DNA-extractie. Dit laat sporen achter op het mes, die gebruikt kunnen worden om tientallen jaren later een nieuw onderzoek uit te voeren.
In de celkern staat DNA in nauw contact met tal van organische moleculen die nodig zijn voor een goede werking. Voor genetische analyse moeten echter koolhydraten, lipiden en eiwitten uit het testmonster worden verwijderd, wat de efficiëntie van de gebruikte methoden kan verminderen en bijgevolg de oplosbaarheid van misdrijven kan beïnvloeden.DNA-extractie neemt weinig tijd in beslag dankzij een verscheidenheid aan commerciële kits en systemen die speciaal zijn ontworpen voor nucleïnezuurextractie (bijvoorbeeld het AutoMate Express DNA-extractiesysteem van Thermo Fisher Scientific). Bovendien wordt dit proces in grote forensische centra met duizenden analyses per dag volledig geautomatiseerd en uitgevoerd met behulp van robots onder toezicht van een operator.
Overigens worden robotsystemen niet alleen veel gebruikt in forensische laboratoria, maar ook in veel medische en biotechnologische centra, waardoor het proces sneller verloopt, de werkkosten lager zijn en de kans op fouten aanzienlijk kleiner is.
Na de extractie wordt het DNA opgelost in een speciale verbinding, waar het indien nodig jarenlang kan worden opgeslagen (bij -20°C of -80°C).
Genetische analyse
Onmiddellijk na de extractie van DnA staat een specialist voor de vraag hoe het verder te analyseren. Sinds de introductie van DNA-identificatie in het forensisch onderzoek zijn de technieken in de moleculaire biologie zo sterk veranderd dat er verschillende varianten mogelijk zijn. Ons verdere verhaal zal de verschillende technieken van DNA-analyse belichten die forensische experts in hun praktijk gebruiken.
Restrictiefragmentlengtepolymorfisme (RFLP-analyse)
RFLP-analyse is historisch gezien een van de eerste methoden voor DNA-identificatie. Het is gebaseerd op het gebruik van speciale cellulaire enzymen, restrictasen. Restrictie-enzymen kunnen bepaalde plaatsen op een nucleïnezuurmolecuul herkennen en deze plaatsen doorsnijden. Tot nu toe zijn er duizenden van dergelijke enzymen beschreven. Na het knippen van de DnA-molecule met restrictie-enzymen worden de lengtes van de verkregen fragmenten geëvalueerd met gelelektroforese (Figuur 9).
Onmiddellijk na de extractie van DnA staat een specialist voor de vraag hoe het verder te analyseren. Sinds de introductie van DNA-identificatie in het forensisch onderzoek zijn de technieken in de moleculaire biologie zo sterk veranderd dat er verschillende varianten mogelijk zijn. Ons verdere verhaal zal de verschillende technieken van DNA-analyse belichten die forensische experts in hun praktijk gebruiken.
Restrictiefragmentlengtepolymorfisme (RFLP-analyse)
RFLP-analyse is historisch gezien een van de eerste methoden voor DNA-identificatie. Het is gebaseerd op het gebruik van speciale cellulaire enzymen, restrictasen. Restrictie-enzymen kunnen bepaalde plaatsen op een nucleïnezuurmolecuul herkennen en deze plaatsen doorsnijden. Tot nu toe zijn er duizenden van dergelijke enzymen beschreven. Na het knippen van de DnA-molecule met restrictie-enzymen worden de lengtes van de verkregen fragmenten geëvalueerd met gelelektroforese (Figuur 9).
Aangezien er geen volledig identieke menselijke genomen bestaan (behalve bij eeneiige tweelingen), kan het verschil of de overeenkomst in de resulterende DNA-fragmentlengteprofielen een goede marker zijn voor zowel persoonlijke identificatie als verwantschapsbepaling.
Deze methode gaat echter gepaard met DNA-fragmentatie en is daarom gevoelig voor de kwaliteit en kwantiteit van het oorspronkelijke genetische materiaal. Daarom wordt de RFLP-analyse momenteel niet praktisch gebruikt - in tegenstelling tot andere methoden, die hieronder worden besproken.
Analyse van het aantal tandemherhalingen in het genoom
Tandemherhalingen zijn kopieën van dezelfde korte DnA-sequentie die achter elkaar worden herhaald [15]. Herhalingen die interessant zijn voor forensische wetenschappers zijn onder andere loci met een variërend aantal tandemherhalingen (VNTR) en korte tandemherhalingen (STR). Ze worden respectievelijk minisatellieten en microsatellieten genoemd.
De essentie van deze methode is de PCR-amplificatie van DNA-fragmenten die deze korte repetitieve sequenties bevatten waarvan de lengte verschilt in twee willekeurig bemonsterde individuen. Na amplificatie wordt de lengte van de verkregen fragmenten geëvalueerd met gelelektroforese of capillaire elektroforese.
De Quantifiler DNA Quantification Kit en het QuantStudio systeem van Termo Fisher Scientific kunnen hiervoor worden gebruikt. De QuantStudio is een compact laboratoriuminstrument met een groot aantal functies.
Net als bij de vorige methode is de belangrijkste identificatiefactor van de STR-analyse de lengte van de verkregen fragmenten, die uniek is voor elk individu en afhangt van het aantal herhalingen in de geanalyseerde site. STR-analyse wordt gekenmerkt door hoge nauwkeurigheid en snelheid, en door lage kosten. De kwaliteit van het genetisch materiaal is een belangrijke voorwaarde voor de analyse.
Deze methode gaat echter gepaard met DNA-fragmentatie en is daarom gevoelig voor de kwaliteit en kwantiteit van het oorspronkelijke genetische materiaal. Daarom wordt de RFLP-analyse momenteel niet praktisch gebruikt - in tegenstelling tot andere methoden, die hieronder worden besproken.
Analyse van het aantal tandemherhalingen in het genoom
Tandemherhalingen zijn kopieën van dezelfde korte DnA-sequentie die achter elkaar worden herhaald [15]. Herhalingen die interessant zijn voor forensische wetenschappers zijn onder andere loci met een variërend aantal tandemherhalingen (VNTR) en korte tandemherhalingen (STR). Ze worden respectievelijk minisatellieten en microsatellieten genoemd.
De essentie van deze methode is de PCR-amplificatie van DNA-fragmenten die deze korte repetitieve sequenties bevatten waarvan de lengte verschilt in twee willekeurig bemonsterde individuen. Na amplificatie wordt de lengte van de verkregen fragmenten geëvalueerd met gelelektroforese of capillaire elektroforese.
De Quantifiler DNA Quantification Kit en het QuantStudio systeem van Termo Fisher Scientific kunnen hiervoor worden gebruikt. De QuantStudio is een compact laboratoriuminstrument met een groot aantal functies.
Net als bij de vorige methode is de belangrijkste identificatiefactor van de STR-analyse de lengte van de verkregen fragmenten, die uniek is voor elk individu en afhangt van het aantal herhalingen in de geanalyseerde site. STR-analyse wordt gekenmerkt door hoge nauwkeurigheid en snelheid, en door lage kosten. De kwaliteit van het genetisch materiaal is een belangrijke voorwaarde voor de analyse.
STR-analyse verscheen bijna twintig jaar geleden in de forensische praktijk, maar is tot op de dag van vandaag de belangrijkste methode om individuen te identificeren. De resultaten van DNA-analyse van verdachten en criminelen - genetische profielen - worden door criminologen in speciale databases ingevoerd.
Als er op plaatsen delict biologische sporen worden gevonden waaruit DNA kan worden geïsoleerd, is het dus mogelijk geworden om alle mensen te identificeren die al onder de aandacht van wetshandhavingsinstanties zijn gekomen. Dezelfde markers worden gebruikt om vermiste personen op te sporen en het vaderschap vast te stellen.
Als er op plaatsen delict biologische sporen worden gevonden waaruit DNA kan worden geïsoleerd, is het dus mogelijk geworden om alle mensen te identificeren die al onder de aandacht van wetshandhavingsinstanties zijn gekomen. Dezelfde markers worden gebruikt om vermiste personen op te sporen en het vaderschap vast te stellen.
In de regel maken systemen die zijn ontworpen om individuen te identificeren het mogelijk om meerdere genoomloci (10-24) tegelijk te analyseren, waaronder het amelogenine-eiwitgen, waarmee het geslacht wordt bepaald. Het amelogenine gen komt voor op zowel het X als het Y chromosoom, maar verschilt in grootte, waardoor het geslacht van een persoon kan worden bepaald.
Dankzij het gebruik van high-throughput sequencing technologieën heeft de forensische wetenschap een effectief hulpmiddel gekregen dat nieuwe mogelijkheden biedt voor de gelijktijdige analyse van meerdere sites (loci) van het nucleaire en mitochondriale genoom.
Een belangrijk voordeel van deze methoden is de mogelijkheid om zelfs identieke tweelingen te onderscheiden (door somatische mutaties), wat onmogelijk is met RFLP- of STR-analyse.
Dankzij het gebruik van high-throughput sequencing technologieën heeft de forensische wetenschap een effectief hulpmiddel gekregen dat nieuwe mogelijkheden biedt voor de gelijktijdige analyse van meerdere sites (loci) van het nucleaire en mitochondriale genoom.
Een belangrijk voordeel van deze methoden is de mogelijkheid om zelfs identieke tweelingen te onderscheiden (door somatische mutaties), wat onmogelijk is met RFLP- of STR-analyse.
In het tweede deel van deze publicatie wordt beschreven hoe de hierboven beschreven methoden kunnen worden gebruikt om drugslabs en drugsdealers te identificeren, en hoe je forensisch onderzoek in de war kunt brengen door je sporen op te ruimen.
Lees DEEL II
