Mephedrone (4-methylmethcathinone) is een β-ketoamfetamine stimulerende drug met nauwe structurele en mechanistische overeenkomsten met methamfetamine. Een van de krachtigste effecten van mephedrone is het vermogen om de afgifte van dopamine (DA) te stimuleren en de heropname ervan te blokkeren door de interactie met de dopaminetransporter (DAT). Hoewel mephedrone geen toxiciteit veroorzaakt aan DA zenuwuiteinden, zou zijn vermogen om te dienen als DAT-blokker bescherming kunnen bieden tegen methamfetamine-geïnduceerde neurotoxiciteit, net als andere DAT-remmers. Om deze mogelijkheid te testen, werden muizen behandeld met mephedrone (10, 20 of 40 mg/kg) voorafgaand aan elke injectie van een neurotoxische behandeling met methamfetamine (4 injecties van 2,5 of 5,0 mg/kg met een interval van 2 uur). De integriteit van DA zenuwuiteinden van het striatum werd beoordeeld door metingen van DA, DAT en tyrosine hydroxylase niveaus. De matige tot ernstige DA-toxiciteit geassocieerd met de verschillende doses methamfetamine werd door geen enkele dosis mephedrone voorkomen, maar werd in feite significant versterkt. De hyperthermie veroorzaakt door een gecombineerde behandeling met mephedrone en methamfetamine was hetzelfde als na een van beide drugs alleen. Mephedrone versterkte ook de neurotoxische effecten van amfetamine en MDMA op DA zenuwuiteinden. Daarentegen beschermde nomifensine tegen methamfetamine-geïnduceerde neurotoxiciteit. Omdat mephedrone de neurotoxiciteit van methamfetamine verhoogt, suggereren de huidige resultaten dat het een wisselwerking heeft met de DAT op een manier die anders is dan die van andere typische DAT-remmers. De relatief onschuldige effecten van mephedrone alleen op DA zenuwuiteinden maskeren een potentieel gevaarlijke interactie met drugs die vaak samen met mephedrone worden gebruikt, wat leidt tot verhoogde neurotoxiciteit.
Mephedrone (4-methylmethcathinone) is een cathinone derivaat en structureel analoog van methamfetamine en 3,4-methyleendioxymethamfetamine (MDMA). Mephedrone is een psychoactief ingrediënt van "badzout", samen met andere verbindingen zoals methylone, butylone en 3,4-methyleendioxypyrovalerone (MDPV). β-ketamfetaminen worden steeds vaker misbruikt, wat voor een niet onbelangrijk deel te wijten is aan de zeer beperkte beschikbaarheid van precursoren die nodig zijn voor de synthese van methamfetamine en MDMA in clandestiene laboratoria en een overeenkomstige afname in de zuiverheid ervan (Winstock et al. 2011b, Brunt et al. 2011). Naarmate het misbruik van β-ketamfetaminen blijft toenemen, is de lijst met hun bijwerkingen uitgebreid met cardiovasculaire complicaties, agitatie, slapeloosheid, psychose en depressie (Schifano et al. 2011, Prosser en Nelson 2012).
Als chemische verwanten van methamfetamine en MDMA is het niet verrassend dat de β-ketoamfetaminen veel van dezelfde effecten hebben op het centrale zenuwstelsel als deze voormalige drugs. Deze drugs blokkeren bijvoorbeeld dopamine (DA) en serotonine (5-HT) transporters (DAT en SERT, respectievelijk) (Cozzi et al. 1999, Rothman et al. 2003, Fleckenstein et al. 2000, Lopez-Arnau et al. 2012) en ze stimuleren de afgifte van monoamines in vitro (Kalix en Glennon 1986, Gygi et al. 1997, Rothman et al. 2003) en in vivo (Gygi et al. 1997, Kehr et al. 2011). Methcathinon veroorzaakt aanhoudende verlagingen van de tryptofaan hydroxylase en tyrosine hydroxylase (TH) activiteit en depletie van DA en 5-HT (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). PET-beeldvormingsstudies bij abstinente methcathinongebruikers lieten een verminderde striatale DAT-dichtheid zien, wat wijst op een verlies van DA-terminals (McCann et al. 1998). De gelijktijdige stimulatie van DA afgifte en remming van de opname weerspiegelen de kritische elementen die ten grondslag liggen aan de neurotoxiciteit geassocieerd met methamfetamine (Kuhn et al. 2008, Yamamoto en Bankson 2005, Cadet et al. 2007, Fleckenstein et al. 2007).
Wij (Angoa-Perez et al. 2012) en anderen (Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011) hebben onlangs de mogelijkheid onderzocht dat mephedrone net als methamfetamine en MDMA neurotoxiciteit zou kunnen veroorzaken. Verrassend genoeg was mephedrone niet toxisch voor DA zenuwuiteinden van het striatum (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). De vraag of mephedrone schade toebrengt aan 5-HT zenuwuiteinden blijft onopgelost omdat één onderzoek positieve effecten aantoonde (Hadlock et al. 2011) terwijl een ander onderzoek negatief was (Baumann et al. 2012). In het licht van het relatief goedaardige effect van mephedrone op DA zenuwuiteinden en gezien zijn eigenschappen als een DAT blokker, stelden we de hypothese dat het in feite het DA neuronale systeem zou kunnen beschermen tegen de neurotoxische effecten van methamfetamine, zoals bekend is bij andere DAT blokkers zoals amfolonzuur (Pu et al. 1994, Schmidt en Gibb 1985, Marek et al. 1990) en nomifensine (Poth et al. 2012). We rapporteren nu dat mephedrone de neurotoxiciteit van methamfetamine significant versterkt. Dit effect strekt zich uit tot amfetamine en MDMA, drugs die vaak samen met mephedrone worden gebruikt (Feyissa en Kelly 2008, Schifano et al. 2011). Deze verrassende resultaten werpen een nieuw licht op het misbruik van mephedrone en maken de erkenning van deze subtiele en gevaarlijke eigenschap van deze β-ketamfetamine urgenter.
Materialen en methoden
Drugs en reagentia
Mephedrone hydrochloride en 3,4-methyleendioxymethamfetamine (MDMA) werden verkregen van het NIDA Research Resources Drug Supply Program. (+) Methamfetaminehydrochloride, nomifensinemaleaat, d-amfetaminesulfaat, pentobarbital, DA en alle buffers en HPLC-reagentia werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS). Bicinchoninezuur-eiwitbepalingskits werden verkregen van Pierce (Rockford, IL, VS). Polyklonale antilichamen tegen rat TH werden geproduceerd zoals eerder beschreven (Kuhn en Billingsley 1987). Monoklonale antilichamen tegen DAT van ratten werden genereus ter beschikking gesteld door Dr. Roxanne A. Vaughan (University of North Dakota, Grand Forks, ND, USA). HRP-geconjugeerde anti-IgG secundaire antilichamen werden geleverd door Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc (West Grove, PA, USA).
Dieren
Vrouwelijke C57BL/6 muizen (Harlan, Indianapolis, IN, VS) met een gewicht van 20-25 g op het moment van experimenteren werden gehuisvest met 5 muizen per kooi in grote schoenendooskooien in een lichte (12 uur licht/donker) en temperatuurgecontroleerde kamer. Er werden vrouwelijke muizen gebruikt omdat bekend is dat zij zeer gevoelig zijn voor neuronale schade door de neurotoxische amfetaminen en om consistent te blijven met onze eerdere studies naar neurotoxiciteit door methamfetamine (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Muizen hadden vrije toegang tot voedsel en water. De Institutional Care and Use Committee van Wayne State University keurde de dierverzorging en experimentele procedures goed. Alle procedures waren ook in overeenstemming met de NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
Farmacologische, fysiologische en gedragsprocedures
Muizen werden behandeld met mephedrone door middel van een binge-achtige behandeling bestaande uit 4 injecties van 10, 20 of 40 mg/kg met een interval van 2 uur tussen elke injectie. Wanneer deze behandeling gebruikt wordt om gesubstitueerde amfetaminen en cathinonderivaten te injecteren, resulteert dit in uitgebreide schade aan de DA-zenuwuiteinden. Van de doses mephedrone die nu worden gebruikt, is eerder aangetoond dat ze niet giftig zijn voor DA-zenuwuiteinden (Angoa-Perez et al. 2012). Muizen werden behandeld met methamfetamine (4X 2,5 of 5 mg/kg), amfetamine (4X 5 mg/kg) of MDMA (4X 20 mg/kg) alleen of in combinatie met mephedrone. Bij behandeling met twee drugs kregen de muizen 30 minuten voor elk van de 4 injecties met methamfetamine, amfetamine of MDMA een injectie met mephedrone. Controles kregen injecties met fysiologische zoutoplossing op hetzelfde schema dat werd gebruikt voor mephedrone alleen of in combinatie met andere amfetaminen. Als controle voor de effecten van een DAT-remmer op methamfetaminetoxiciteit werden muizen 30 minuten voor elke injectie methamfetamine (4X 5 mg/kg) behandeld met nomifensine (4X 5 mg/kg). Alle injecties werden toegediend via de i.p. route. Muizen werden 2 dagen na de laatste medicamenteuze behandeling gedood wanneer de met amfetamine geassocieerde neurotoxiciteit het maximum had bereikt. De lichaamstemperatuur werd bewaakt door telemetrie met behulp van IPTT-300 implanteerbare temperatuurtransponders van Bio Medic Data Systems, Inc. (Seaford, DE, USA). Temperaturen werden elke 20 minuten niet-invasief geregistreerd, te beginnen 60 minuten voor de eerste METH injectie en vervolgens gedurende 9 uur met behulp van het DAS-5001 console systeem van Bio Medic.
Bepaling van striatale DA-gehalte
Striataal weefsel werd bilateraal ontleed uit de hersenen na behandeling en bewaard bij -80°C. Bevroren weefsels werden gewogen en gesonikeerd in 10 volumes 0,16 N perchloorzuur bij 4°C. Onoplosbaar eiwit werd verwijderd door centrifugeren en DA werd bepaald door HPLC met elektrochemische detectie zoals eerder beschreven voor methamfetamine (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
Bepaling van TH- en DAT-eiwitniveaus door immunoblotting
De effecten van medicamenteuze behandelingen op de striatale TH- en DAT-spiegels werden bepaald door immunoblotting als een index van toxiciteit voor striatale DA-zenuwuiteinden. Muizen werden gedood door onthoofding na behandeling en het striatum werd bilateraal ontleed. Het weefsel werd bewaard bij -80°C. Bevroren weefsel werd ontleed door sonicatie in 1% SDS bij 95°C en onoplosbaar materiaal werd gesedimenteerd door centrifugatie. Eiwit werd bepaald met de bicinchoninezuurmethode en gelijke hoeveelheden eiwit (70 μg/liter) werden opgelost door SDS-polyacrylamide gelelektroforese en vervolgens geëlektrobloteerd op nitrocellulose. Blots werden geblokkeerd in Tris gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (0,1% v/v) en 5% vetvrije melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Primaire antilichamen tegen TH (1:1000) of DAT (1:1000) werden aan de blots toegevoegd en gedurende 16 uur bij 4 °C geïncubeerd. De blots werden 3X gewassen in Tris-gebufferde zoutoplossing om niet gereageerde antilichamen te verwijderen en vervolgens geïncubeerd met HRP-geconjugeerd anti-IgG secundair antilichaam (1:4000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Immunoreactieve banden werden gevisualiseerd door versterkte chemiluminescentie en de relatieve dichtheden van TH- en DAT-reactieve banden werden bepaald door beeldvorming met een Kodak Image Station (Carestream Molecular Systems, Rochester, NY, USA) en gekwantificeerd met ImageJ-software (NIH).
Gegevensanalyse
Twee-weg ANOVA's werden uitgevoerd om de dosis effecten van methamfetamine versus mephedrone op DA, DAT en TH te analyseren. De effecten van de behandelingen met drugs op het striatale DA-, TH- en DAT-gehalte werden getest op significantie door een eenzijdige ANOVA gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest. De resultaten van medicamenteuze behandelingen op de kerntemperatuur van het lichaam in de loop van de tijd werden geanalyseerd met behulp van een twee-weg ANOVA gevolgd door Bonferroni's test om de significantie van verschillen in temperatuur op individuele tijdstippen na de behandeling te bepalen. Verschillen werden significant geacht als p < 0,05. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism versie 5.02 voor Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com).
Ga naar:
Resultaten
Effecten van mephedrone op door methamfetamine geïnduceerde neurotoxiciteit
Mephedrone, in doses (10, 20 of 40 mg/kg) waarvan bekend is dat ze geen DA zenuwuiteinde toxiciteit veroorzaken (Angoa-Perez et al. 2012), werd 30 minuten voor elke injectie met methamfetamine toegediend. Methamfetamine werd toegediend in doses die matige (4X 2,5 mg/kg) of ernstige (4X 5 mg/kg) schade veroorzaken aan DA zenuwuiteinden van het striatum (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). De resultaten in Fig. 1 laten zien dat de hoofdeffecten van de dosis methamfetamine (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) en de dosis mephedrone (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) op de DA-niveaus in het striatum zeer significant waren met behulp van tweezijdige ANOVA. Het hoofdeffect van mephedrone gegeven in combinatie met ofwel 2,5 mg/kg (F4,22 = 35,96, p < 0,001) of 5,0 mg/kg methamfetamine (F4,17 = 953,9, p < 0,0001) was ook zeer significant bij een eenzijdige ANOVA. Alle behandelingen met een van beide doseringen methamfetamine ± mephedrone veroorzaakten significant grotere verminderingen in DA in vergelijking met de respectievelijke controle (p < 0,0001 voor alle). Fig. 1 laat ook zien dat mephedrone doses van 20 (p < 0,01) en 40 mg/kg (p < 0,001) de depleterende effecten van 2,5 mg/kg methamfetamine op DA significant versterkten, terwijl alle doses mephedrone de effecten van 5,0 mg/kg methamfetamine op DA-niveaus significant versterkten (p < 0,0001 voor alle).
Fig.1
Effecten van mephedrone op methamfetamine-geïnduceerde verminderingen in striatale DA. Muizen werden behandeld met de aangegeven doses mephedrone (MEPH) 30 minuten voorafgaand aan elke injectie van 2,5 (-) of 5,0 mg / kg (■) methamfetamine (METH) en 2d later opgeofferd voor bepaling van de striatale niveaus van DA door HPLC. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM voor 5-7 muizen per groep. Sommige foutbalkjes waren te klein om de grootte van de symbolen te overschrijden en zijn niet zichtbaar. ***p < 0,001 vs controles en #p < 0,01, ##p < 0,001 of ###p < 0,0001 vs de respectievelijke dosis methamfetamine (Tukey's meervoudige vergelijkingstest).
Fig. 2a laat zien dat mephedrone de door methamfetamine geïnduceerde verlaging van de DAT niveaus significant verhoogde, zoals bepaald door immunoblotting. Immunoblots werden gekwantificeerd en in overeenstemming met de resultaten voor DA, waren de hoofdeffecten van methamfetaminedosis (F1,92 = 9,48, p < 0,001) en mephedrone dosis (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) op DAT niveaus in striatum zeer significant door twee-weg ANOVA (Fig. 2b). Het hoofdeffect van mephedrone gegeven in combinatie met ofwel 2,5 mg/kg (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) of 5,0 mg/kg methamfetamine (F4,39 = 24,84, p < 0,0001) was ook zeer significant in een eenzijdige ANOVA. Alle behandelingen met een van beide doseringen methamfetamine ± mephedrone veroorzaakten significant grotere verlagingen van de DAT in vergelijking met de respectievelijke controle (p < 0,01 voor 2,5 mg/kg methamfetamine alleen; p < 0,0001 voor alle andere behandelingen). Fig. 2b laat ook zien dat mephedrone doses van 20 mg/kg (p < 0,01) en 40 mg/kg (p < 0,001) de verminderingen in DAT veroorzaakt door 2,5 mg/kg methamfetamine significant versterkten, terwijl alleen de dosis van 40 mg/kg mephedrone de effecten van 5,0 mg/kg methamfetamine op DAT verminderingen significant versterkte (p < 0,01).
Fig.2
Effecten van mephedrone op methamfetamine-geïnduceerde verminderingen in striatale DAT. Muizen werden behandeld met de aangegeven doses mephedrone (MEPH) 30 min voor elke injectie van 2,5 (●) of 5,0 mg / kg (■) methamfetamine (METH) en 2d later opgeofferd voor bepaling van de striatale niveaus van DAT door immunoblotting (a). Blots werden gekwantificeerd met ImageJ en gegevens zijn gemiddelde ± SEM voor 10-12 muizen per groep (b). *p < 0,01 of ***p < 0,0001 vs controle (C) en #p < 0,01 of ##p < 0,001 vs de respectievelijke dosis methamfetamine (Tukey's meervoudige vergelijkingstest).
Fig. 3a laat zien dat mephedrone de door methamfetamine geïnduceerde verlaging van de TH-spiegel significant verhoogde, zoals bepaald door immunoblotting. Immunoblots werden gekwantificeerd en in overeenstemming met bovenstaande resultaten voor DA en DAT, waren de hoofdeffecten van methamfetaminedosis (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) en mephedrone dosis (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) zeer significant door twee-weg ANOVA (Fig. 3b). Het hoofdeffect van mephedrone gegeven in combinatie met 2,5 mg/kg (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) of 5,0 mg/kg methamfetamine (F4,49 = 99,16, p < 0,0001) was ook zeer significant in een eenzijdige ANOVA. Alle behandelingen met één van beide doseringen methamfetamine ± mephedrone veroorzaakten significant grotere verlagingen van TH in vergelijking met de respectievelijke controle (p < 0,001 voor 2,5 mg/kg methamfetamine + 10 mg/kg mephedrone; p < 0,0001 voor alle andere combinaties), met uitzondering van 2,5 mg/kg methamfetamine alleen, dat de TH-niveaus niet significant veranderde (d.w.z. geen toxiciteit). Fig. 3b laat ook zien dat mephedrone doses van 20 mg/kg (p < 0,01) en 40 mg/kg (p < 0,001) de TH-verlagingen veroorzaakt door 2,5 mg/kg methamfetamine significant versterkten en alle drie de doses mephedrone versterkten significant (p < 0,0001) de effecten van 5,0 mg/kg methamfetamine op TH-verlagingen.
Fig. 3
Effecten van mephedrone op methamfetamine-geïnduceerde reducties in striatale TH. Muizen werden behandeld met de aangegeven doses mephedrone (MEPH) 30 minuten voor elke injectie van 2,5 (●) of 5,0 mg / kg (■) methamfetamine (METH) en 2d later opgeofferd voor bepaling van de striatale niveaus van TH door immunoblotting (a). Blots werden gekwantificeerd met ImageJ en gegevens zijn gemiddelde ± SEM voor 10-12 muizen per groep (b). Sommige foutbalken waren te klein om de grootte van de symbolen te overschrijden en zijn niet zichtbaar. **p < 0,001 of ***p < 0,0001 vs controle (C) en #p < 0,01, ##p < 0,001 of ###p < 0,0001) vs de respectievelijke dosis methamfetamine (Tukey's meervoudige vergelijkingstest).
Effecten van mephedrone op door methamfetamine geïnduceerde hyperthermie
Mephedrone veroorzaakt, net als methamfetamine, aanzienlijke hyperthermie (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Wanneer mephedrone 30 minuten voor elke injectie met methamfetamine werd toegediend, is in Fig. 4 te zien dat de hoofdeffecten van de doses methamfetamine en mephedrone (F1.300 = 11,99, p < 0,0001) en de tijd (F4.300 = 51,73, p < 0,0001) zeer significant waren met behulp van tweezijdige ANOVA. De hoofdeffecten van mephedrone gegeven in combinatie met ofwel 2,5 mg/kg methamfetamine (F4.120 = 41,44, p < 0,0001, paneel a) in de tijd (F30.120 = 3,84, p < 0,0001) of 5,0 mg/kg methamfetamine (F4.120 = 78,09, p < 0,0001, paneel b) in de tijd (F30.120 = 9,98, p < 0,0001) waren ook zeer significant door tweezijdige ANOVA. Alle behandelingen met een van beide doseringen methamfetamine ± mephedrone verschilden significant van de respectievelijke controles (p < 0,0001 voor alle behandelingen).
Fig. 4
Effecten van mephedrone op door methamfetamine geïnduceerde hyperthermie. Muizen werden behandeld met de aangegeven doses mephedrone (MEPH) 30 min voor elke injectie van 2,5 (a) of 5,0 mg/kg (b) methamfetamine (METH). Kerntemperaturen werden gemeten met intervallen van 20 minuten door telemetrie vanaf 60 minuten voor de eerste injectie met methamfetamine. De 4 methamfetamine-injecties worden aangegeven door de pijlen die op de x-as rusten. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde lichaamstemperatuur van 6-8 muizen per groep. SEM's waren altijd < 10% van het gemiddelde en zijn weggelaten voor de duidelijkheid.
Effecten van mephedrone op amfetamine- en MDMA-geïnduceerde neurotoxiciteit
Om te testen of de versterkende effecten van mephedrone op methamfetamine kunnen worden uitgebreid naar andere neurotoxische amfetaminen, werden muizen behandeld met deze β-ketoamfetamine (20 mg/kg) plus amfetamine (4X 5 mg/kg) of MDMA (4X 20 mg/kg) en de resultaten worden gepresenteerd in Fig. 5. Onthoud dat mephedrone zelf geen striatale DA, DAT of TH vermindert (Angoa-Perez et al. 2012). Het hoofdeffect van de drug (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) was zeer significant door een eenzijdige ANOVA voor DA reducties (Fig. 5a). Het is ook te zien in Fig. 5a dat alle behandelingen met amfetamine (p < 0,001) of MDMA (p < 0,001) alleen of in combinatie met mephedrone (p < 0,0001 voor beide drugs) de DA-niveaus significant verlaagden ten opzichte van de controle. Mephedrone versterkte DA-verlagingen veroorzaakt door amfetamine (p < 0,01) of MDMA (p < 0,01) aanzienlijk. Fig. 5b toont vergelijkbare effecten van behandelingen met combinatiemedicijnen op DAT niveaus in het striatum. Het hoofdeffect van de drug (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) was zeer significant door een eenzijdige ANOVA voor DAT. Het is ook te zien in Fig. 5b dat alle behandelingen met amfetamine of MDMA significant (p < 0,0001 voor alle) lager waren in vergelijking met de controle. Mephedrone versterkte ook significant DAT-verlagingen veroorzaakt door amfetamine of MDMA (p < 0,0001 in beide gevallen). Tot slot laat Fig. 5c zien dat het hoofdeffect van de drug (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) zeer significant was door een eenzijdige ANOVA voor verminderingen in TH. Het is ook te zien in Fig. 5c dat alle behandelingen met amfetamine of MDMA significant (p < 0,0001 voor alle) lager waren in vergelijking met de controle. Mephedrone versterkte ook significant de TH-verlagingen veroorzaakt door amfetamine of MDMA (p < 0,0001 in beide gevallen).
Fig. 5
Effecten van mephedrone op amfetamine- of MDMA-geïnduceerde DA zenuwuiteinde neurotoxiciteit. Muizen werden behandeld met 20 mg / kg mephedrone (MEPH) 30 min voor elke injectie van 5,0 mg / kg amfetamine (AMPH) of 20 mg / kg MDMA en opgeofferd 2 d na de behandeling voor de bepaling van de striatale niveaus van (a) DA door HPLC. (b) DAT en (c) TH werden bepaald door immunoblotting en blots werden gekwantificeerd met ImageJ. Representatieve immunoblots voor DAT en TH zijn opgenomen als inzet bij panelen (b) en (c) respectievelijk en behandelingen voor beide panelen worden aangeduid met 1,5: controle; 2,6: MEPH; 3: AMPH; 4: AMPH + MEPH; 7: MDMA; en 8: MDMA + MEPH. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM voor 5-12 muizen in elke groep. **p < 0,001 of ***p < 0,0001 vs controle en #p < 0,01 of ###p < 0,0001 vs AMPH of MDMA (Tukey's meervoudige vergelijkingstest).
Effecten van nomifensine op methamfetamine-geïnduceerde neurotoxiciteit
Nomifensine, een krachtige DAT-blokker zonder bekend misbruik of neurotoxisch potentieel, werd getest op zijn vermogen om te beschermen tegen methamfetamine-geïnduceerde neurotoxiciteit en in contrast met de werking van mephedrone op de toxiciteit voor DA-zenuwuiteinden veroorzaakt door methamfetamine, amfetamine en MDMA. De resultaten in Fig. 6a laten zien dat het hoofdeffect van de drug (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) op de DA-niveaus zeer significant was met een eenzijdige ANOVA. Nomifensine alleen veranderde de DA-niveaus niet, maar de vermindering veroorzaakt door methamfetamine (p < 0,0001) werd licht maar significant omgekeerd door nomifensine (p < 0,01). Het hoofdeffect van de drug (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) op DAT-niveaus was zeer significant door een eenzijdige ANOVA zoals weergegeven in Fig. 6b. Nomifensine veranderde de DAT niveaus niet, maar bood significante bescherming (p < 0,001) tegen de afname in striatale DAT veroorzaakt door methamfetamine (p < 0,0001) in vergelijking met de controle. Tot slot laat Fig. 6c zien dat het hoofdeffect van drug (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) op TH niveaus zeer significant was door een eenzijdige ANOVA. Zoals gezien voor DA en DAT, werd de vermindering in TH veroorzaakt door methamfetamine (p < 0,0001) licht maar significant voorkomen door nomifensine (p < 0,01).
Fig. 6
Effecten van nomifensine op methamfetamine-geïnduceerde DA zenuwuiteinde neurotoxiciteit. Muizen werden behandeld met 5,0 mg / kg nomifensine (NOM) 30 min voor elke injectie van 5,0 mg / kg methamfetamine (METH) en 2d later opgeofferd voor bepaling van de striatale niveaus van (a) DA door HPLC. (b) DAT en (c) TH werden bepaald door immunoblotting en blots werden gekwantificeerd met ImageJ. Representatieve immunoblots voor DAT en TH zijn opgenomen als inzet van panelen (b) en (c) respectievelijk. Gegevens zijn gemiddelde plus SEM voor 5-7 muizen per groep. ***p < 0,0001 vs controle (C) en #p < 0,01 of ##p < 0,001 vs methamfetamine alleen (Tukey's meervoudige vergelijkingstest).
Discussie
Het doel van de huidige studie was om te bepalen of mephedrone DA zenuwuiteinde toxiciteit veroorzaakt door methamfetamine zou voorkomen. Op basis van de chemische gelijkenis met methamfetamine en MDMA werd aanvankelijk verwacht dat mephedrone schadelijke effecten zou hebben op het DA neuronale systeem. Verschillende studies stelden echter bijna gelijktijdig vast dat mephedrone niet toxisch was voor DA zenuwuiteinden (Angoa-Perez et al. 2012, Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011). De vraag of deze drug schade veroorzaakt aan het 5-HT neuronale systeem blijft open. Eén onderzoek rapporteerde aanhoudende verminderingen in de functie van 5-HT zenuwuiteinden (Hadlock et al. 2011), terwijl een ander onderzoek vond dat mephedrone geen schade veroorzaakte (Baumann et al. 2012). Mephedrone interageert met de DA zenuwuiteinden op een manier die suggereert dat het inderdaad de afgifte stimuleert en de DA heropname blokkeert via de interacties met de DAT. Een belangrijk facet van het neurotoxische werkingsmechanisme van methamfetamine is het vermogen om toegang te krijgen tot DA zenuwuiteinden via de DAT en de DA homeostase te verstoren (Sulzer 2011). Als deze vroege stap in de neurotoxische cascade van methamfetamine wordt voorkomen door remming van de DAT, wordt toxiciteit voorkomen (Pu et al. 1994, Poth et al. 2012, Marek et al. 1990, Schmidt en Gibb 1985). We dachten dat mephedrone dezelfde beschermende eigenschap zou kunnen hebben als andere DAT-remmers, maar in plaats daarvan zagen we een significante toename van toxiciteit. Deze interactie werd gezien bij gebruik van twee verschillende doses methamfetamine die matige of ernstige schade veroorzaken aan DA zenuwuiteinden (respectievelijk 4X 2,5 of 5,0 mg/kg). Dit versterkende effect van mephedrone was niet beperkt tot methamfetamine en breidde zich uit tot amfetamine en MDMA, twee drugs die vaak samen met mephedrone en andere β-ketoamfetaminen worden gebruikt (Feyissa en Kelly 2008, Schifano et al. 2011, Kelly 2011). Dus ondanks het feit dat mephedrone geen toxiciteit veroorzaakt aan ten minste DA-zenuwuiteinden van het striatum, versterkt het de neurotoxische effecten van andere misbruikte drugs. Deze nieuwe bevinding zou misbruik van mephedrone nog grimmiger moeten maken, omdat het gebrek aan intrinsieke neurotoxiciteit het middel onschuldig kan laten lijken.
Hyperthermie is een vaak gerapporteerd acuut schadelijk effect van inname van methamfetamine (Greene et al. 2008) en β-ketoamfetamine bij mensen (Borek en Holstege 2012, Prosser en Nelson 2012). Net als methamfetamine veroorzaken veel van de β-ketamfetamine drugs ook aanzienlijke verhogingen van de kerntemperatuur bij knaagdieren (Angoa-Perez et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Rockhold et al. 1997). Hoewel de hyperthermie veroorzaakt door methamfetamine kan bijdragen aan de morfologische en neuronale schadelijke effecten, is het niet noodzakelijkerwijs zo dat hyperthermie de directe oorzaak is van deze effecten (Kiyatkin en Sharma 2009). We registreerden de kerntemperatuur van het lichaam bij muizen die werden behandeld met mephedrone en methamfetamine en zagen dat de gecombineerde behandeling de temperatuur niet verder liet stijgen dan de maximale stijging die werd waargenomen na een van beide drugs alleen. Methamfetamine veroorzaakte een dosisgerelateerde stijging van de lichaamstemperatuur en deze hyperthermie was onveranderlijk over het gehele geteste dosisbereik van mephedrone. In feite bleef de daling van de lichaamstemperatuur na injectie, die werd waargenomen na behandeling met mephedrone (Angoa-Perez et al. 2012), behouden bij hogere doses mephedrone plus methamfetamine. Hoewel de door drugs veroorzaakte hyperthermie niet werd versterkt door gecombineerde behandeling met drugs, waren de neurotoxische effecten additief. Daarom lijkt het er, in ieder geval in dit geval, op dat de neurotoxische effecten van methamfetamine kunnen worden versterkt door mephedrone op een manier die onafhankelijk is van hyperthermie.
Mephedrone remt duidelijk de DAT-functie en blokkeert de DA-heropname in vitro (Lopez-Arnau et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Kehr et al. 2011, Martinez-Clemente et al. 2012, Cozzi et al. 1999). Mephedrone verdringt WIN-35.428 van zijn bindingsplaats op de DAT, wat suggereert dat het een competitieve remmer van DA-opname is (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). De potentie van mephedrone in dit opzicht lijkt erg op die van methamfetamine (Cozzi et al. 1999) en MDMA (Escubedo et al. 2011). Het is niet bekend of mephedrone wordt getransporteerd door de DAT, maar methcathinone wel (Cozzi en Foley 2003). Nomifensine en amfononzuur, die binden aan de DAT en de DA-opname remmen, bieden aanzienlijke bescherming tegen methamfetamine-geïnduceerde neurotoxiciteit (Pu et al. 1994, Marek et al. 1990, Schmidt en Gibb 1985, Poth et al. 2012) en muizen zonder DAT zijn resistent tegen de neuronale toxiciteit van methamfetamine (Fumagalli et al. 1998). Wetende dat mephedrone niet neurotoxisch is en een DAT-blokker leidt tot de voorspelling dat het toxiciteit zou moeten voorkomen. We testten nomifensine in dit verband als een positieve controle en bevestigden dat het beschermt tegen methamfetamine-geïnduceerde depletie van DA, DAT en TH. Nomifensine remt ook de noradrenaline transporter (Brogden et al. 1979) maar deze eigenschap kan de huidige resultaten niet verklaren omdat de meeste β-ketoamfetaminen waaronder mephedrone de noradrenaline transporter remmen en de noradrenaline opname blokkeren (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). Een rol van het 5-HT neuronale systeem in sommige farmacologische effecten van mephedrone is mogelijk in het licht van het vermogen van deze drug, net als MDMA (Yamamoto et al. 1995), om efflux van striatale DA te veroorzaken via de interacties met 5-HT2A receptoren (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). De hyper-locomotie veroorzaakt door mephedrone is afhankelijk van endogeen 5-HT (Lopez-Arnau et al. 2012) en dit middel stimuleert ook de afgifte van 5-HT en remt de opname ervan in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) en in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). We kunnen echter een rol van endogeen 5-HT in de DA neurotoxiciteit van ten minste methamfetamine uitsluiten door aan te tonen dat muizen die genetisch zijn verarmd van 5-HT hun gevoeligheid voor neurotoxiciteit behouden (Thomas et al. 2010).
Mephedrone zou de neurotoxiciteit van methamfetamine door verschillende mogelijke mechanismen kunnen versterken. Ten eerste zou mephedrone kunnen interageren met de VMAT om lekkage van DA in het cytoplasma van de presynaptische zenuwuiteinden te veroorzaken. Behandelingen die de cytoplasmatische pool (d.w.z. drug-releasable) van DA verhogen, verhogen de methamfetamine neurotoxiciteit (Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009, Schmidt et al. 1985). Dit mechanisme is niet waarschijnlijk omdat methcathinon slechts een zwakke interactie heeft met de VMAT (Cozzi et al. 1999). Ten tweede zou de combinatie van mephedrone plus methamfetamine een synergetisch effect kunnen hebben op de niet-vesiculaire afgifte van DA, maar deze mogelijkheid lijkt ook onwaarschijnlijk in het licht van resultaten waaruit blijkt dat behandeling van DAT- of SERT-expressie CHO-cellen met methylone plus methamfetamine geen additief effect heeft op de afgifte van DA of 5-HT (Sogawa et al. 2011). Ten derde zou mephedrone kunnen interageren met de DAT op een nieuwe manier die bijdraagt aan additieve toxiciteit. Er is aangetoond dat methylone in combinatie met methamfetamine synergetische cytotoxiciteit veroorzaakt in CHO-cellen die de DAT of SERT tot expressie brengen, maar niet in wild type CHO-cellen zonder de transporteurs (Sogawa e.a. 2011). De cytotoxiciteit gezien in gekweekte cellen in deze studies (d.w.z. vrijkomen van LDH) is heel anders dan de schade aan DA zenuwuiteinden veroorzaakt door methamfetamine, maar dit mechanisme suggereert een interessante maar ongedefinieerde rol voor de DAT in verhoogde cytotoxiciteit. Ten slotte zou mephedrone het metabolisme van methamfetamine kunnen veranderen. Mephedrone wordt voornamelijk gemetaboliseerd door N-demethylering (Meyer en Maurer 2010), net als methamfetamine en MDMA (Caldwell 1976). Ondersteuning voor dit mechanisme komt van de demonstratie dat methamfetamine en MDMA wederzijds de productie van hun respectieve primaire metabolieten remmen en de plasmaspiegels van de drugs verhogen tot boven de niveaus die worden waargenomen na toediening van een van beide drugs alleen (Kuwayama et al. 2012). De doses mephedrone die nu en in onze vorige studie (Angoa-Perez et al. 2012) zijn gebruikt, zijn weliswaar hoog, maar niet neurotoxisch en vallen binnen het bereik dat door mensen wordt misbruikt (McErath en O'Neill 2011). Daarom zou mephedrone net als MDMA de plasmaspiegels van methamfetamine kunnen verhogen door het metabolisme ervan te remmen. Een diepgaande farmacokinetische analyse is nodig om deze laatste mogelijkheid te bevestigen.
Misbruik van de β-ketamfetaminen neemt schrikbarend toe en mephedrone is nu een van de meest gebruikte drugs na cannabis, MDMA en cocaïne (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Bovendien wekt mephedrone bij mensen sterkere verlangens op dan MDMA (Brunt et al. 2011) en gebruikers die mephedrone snuiven, vinden het verslavender dan cocaïne (Winstock et al. 2011b). Mephedrone wordt door mensen op een binge-achtige manier geconsumeerd (d.w.z. "stapelen") en wordt vaak samen met andere drugs gebruikt, zoals cannabis en de amfetamine psychostimulantia (Schifano et al. 2011, Fass et al. 2012, Winstock et al. 2011a, Kelly 2011, Torrance en Cooper 2010). Mephedrone wordt steeds vaker aangetroffen in tabletten die worden verkocht als MDMA (Brunt et al. 2011) en het gebruik ervan zal dat van MDMA waarschijnlijk overtreffen naarmate de zuiverheid van deze laatste drug verder afneemt (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Op basis van de veelvoorkomende misbruikpatronen van mephedrone en andere bestanddelen van "badzout" is het belangrijk om na te gaan of er extra gezondheidsrisico's ontstaan bij mensen wanneer deze drugs opzettelijk of onbewust worden gecombineerd met amfetaminen. Onze resultaten die aantonen dat ten minste mephedrone de neurotoxiciteit van DA zenuwuiteinden van het striatum veroorzaakt door methamfetamine, amfetamine en MDMA aanzienlijk versterkt, onthullen een bijzonder gevaarlijke en onverwachte eigenschap van deze β-ketamfetamine.
Gebruikte afkortingen
5-HT serotonine
DA dopamine
DAT DA transporter
MDMA 3,4-methyleendioxymethamfetamine
TH tyrosine hydroxylase
VMAT vesiculaire monoaminetransporter
Mephedrone (4-methylmethcathinone) is een cathinone derivaat en structureel analoog van methamfetamine en 3,4-methyleendioxymethamfetamine (MDMA). Mephedrone is een psychoactief ingrediënt van "badzout", samen met andere verbindingen zoals methylone, butylone en 3,4-methyleendioxypyrovalerone (MDPV). β-ketamfetaminen worden steeds vaker misbruikt, wat voor een niet onbelangrijk deel te wijten is aan de zeer beperkte beschikbaarheid van precursoren die nodig zijn voor de synthese van methamfetamine en MDMA in clandestiene laboratoria en een overeenkomstige afname in de zuiverheid ervan (Winstock et al. 2011b, Brunt et al. 2011). Naarmate het misbruik van β-ketamfetaminen blijft toenemen, is de lijst met hun bijwerkingen uitgebreid met cardiovasculaire complicaties, agitatie, slapeloosheid, psychose en depressie (Schifano et al. 2011, Prosser en Nelson 2012).
Als chemische verwanten van methamfetamine en MDMA is het niet verrassend dat de β-ketoamfetaminen veel van dezelfde effecten hebben op het centrale zenuwstelsel als deze voormalige drugs. Deze drugs blokkeren bijvoorbeeld dopamine (DA) en serotonine (5-HT) transporters (DAT en SERT, respectievelijk) (Cozzi et al. 1999, Rothman et al. 2003, Fleckenstein et al. 2000, Lopez-Arnau et al. 2012) en ze stimuleren de afgifte van monoamines in vitro (Kalix en Glennon 1986, Gygi et al. 1997, Rothman et al. 2003) en in vivo (Gygi et al. 1997, Kehr et al. 2011). Methcathinon veroorzaakt aanhoudende verlagingen van de tryptofaan hydroxylase en tyrosine hydroxylase (TH) activiteit en depletie van DA en 5-HT (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). PET-beeldvormingsstudies bij abstinente methcathinongebruikers lieten een verminderde striatale DAT-dichtheid zien, wat wijst op een verlies van DA-terminals (McCann et al. 1998). De gelijktijdige stimulatie van DA afgifte en remming van de opname weerspiegelen de kritische elementen die ten grondslag liggen aan de neurotoxiciteit geassocieerd met methamfetamine (Kuhn et al. 2008, Yamamoto en Bankson 2005, Cadet et al. 2007, Fleckenstein et al. 2007).
Wij (Angoa-Perez et al. 2012) en anderen (Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011) hebben onlangs de mogelijkheid onderzocht dat mephedrone net als methamfetamine en MDMA neurotoxiciteit zou kunnen veroorzaken. Verrassend genoeg was mephedrone niet toxisch voor DA zenuwuiteinden van het striatum (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). De vraag of mephedrone schade toebrengt aan 5-HT zenuwuiteinden blijft onopgelost omdat één onderzoek positieve effecten aantoonde (Hadlock et al. 2011) terwijl een ander onderzoek negatief was (Baumann et al. 2012). In het licht van het relatief goedaardige effect van mephedrone op DA zenuwuiteinden en gezien zijn eigenschappen als een DAT blokker, stelden we de hypothese dat het in feite het DA neuronale systeem zou kunnen beschermen tegen de neurotoxische effecten van methamfetamine, zoals bekend is bij andere DAT blokkers zoals amfolonzuur (Pu et al. 1994, Schmidt en Gibb 1985, Marek et al. 1990) en nomifensine (Poth et al. 2012). We rapporteren nu dat mephedrone de neurotoxiciteit van methamfetamine significant versterkt. Dit effect strekt zich uit tot amfetamine en MDMA, drugs die vaak samen met mephedrone worden gebruikt (Feyissa en Kelly 2008, Schifano et al. 2011). Deze verrassende resultaten werpen een nieuw licht op het misbruik van mephedrone en maken de erkenning van deze subtiele en gevaarlijke eigenschap van deze β-ketamfetamine urgenter.
Materialen en methoden
Drugs en reagentia
Mephedrone hydrochloride en 3,4-methyleendioxymethamfetamine (MDMA) werden verkregen van het NIDA Research Resources Drug Supply Program. (+) Methamfetaminehydrochloride, nomifensinemaleaat, d-amfetaminesulfaat, pentobarbital, DA en alle buffers en HPLC-reagentia werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS). Bicinchoninezuur-eiwitbepalingskits werden verkregen van Pierce (Rockford, IL, VS). Polyklonale antilichamen tegen rat TH werden geproduceerd zoals eerder beschreven (Kuhn en Billingsley 1987). Monoklonale antilichamen tegen DAT van ratten werden genereus ter beschikking gesteld door Dr. Roxanne A. Vaughan (University of North Dakota, Grand Forks, ND, USA). HRP-geconjugeerde anti-IgG secundaire antilichamen werden geleverd door Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc (West Grove, PA, USA).
Dieren
Vrouwelijke C57BL/6 muizen (Harlan, Indianapolis, IN, VS) met een gewicht van 20-25 g op het moment van experimenteren werden gehuisvest met 5 muizen per kooi in grote schoenendooskooien in een lichte (12 uur licht/donker) en temperatuurgecontroleerde kamer. Er werden vrouwelijke muizen gebruikt omdat bekend is dat zij zeer gevoelig zijn voor neuronale schade door de neurotoxische amfetaminen en om consistent te blijven met onze eerdere studies naar neurotoxiciteit door methamfetamine (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Muizen hadden vrije toegang tot voedsel en water. De Institutional Care and Use Committee van Wayne State University keurde de dierverzorging en experimentele procedures goed. Alle procedures waren ook in overeenstemming met de NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
Farmacologische, fysiologische en gedragsprocedures
Muizen werden behandeld met mephedrone door middel van een binge-achtige behandeling bestaande uit 4 injecties van 10, 20 of 40 mg/kg met een interval van 2 uur tussen elke injectie. Wanneer deze behandeling gebruikt wordt om gesubstitueerde amfetaminen en cathinonderivaten te injecteren, resulteert dit in uitgebreide schade aan de DA-zenuwuiteinden. Van de doses mephedrone die nu worden gebruikt, is eerder aangetoond dat ze niet giftig zijn voor DA-zenuwuiteinden (Angoa-Perez et al. 2012). Muizen werden behandeld met methamfetamine (4X 2,5 of 5 mg/kg), amfetamine (4X 5 mg/kg) of MDMA (4X 20 mg/kg) alleen of in combinatie met mephedrone. Bij behandeling met twee drugs kregen de muizen 30 minuten voor elk van de 4 injecties met methamfetamine, amfetamine of MDMA een injectie met mephedrone. Controles kregen injecties met fysiologische zoutoplossing op hetzelfde schema dat werd gebruikt voor mephedrone alleen of in combinatie met andere amfetaminen. Als controle voor de effecten van een DAT-remmer op methamfetaminetoxiciteit werden muizen 30 minuten voor elke injectie methamfetamine (4X 5 mg/kg) behandeld met nomifensine (4X 5 mg/kg). Alle injecties werden toegediend via de i.p. route. Muizen werden 2 dagen na de laatste medicamenteuze behandeling gedood wanneer de met amfetamine geassocieerde neurotoxiciteit het maximum had bereikt. De lichaamstemperatuur werd bewaakt door telemetrie met behulp van IPTT-300 implanteerbare temperatuurtransponders van Bio Medic Data Systems, Inc. (Seaford, DE, USA). Temperaturen werden elke 20 minuten niet-invasief geregistreerd, te beginnen 60 minuten voor de eerste METH injectie en vervolgens gedurende 9 uur met behulp van het DAS-5001 console systeem van Bio Medic.
Bepaling van striatale DA-gehalte
Striataal weefsel werd bilateraal ontleed uit de hersenen na behandeling en bewaard bij -80°C. Bevroren weefsels werden gewogen en gesonikeerd in 10 volumes 0,16 N perchloorzuur bij 4°C. Onoplosbaar eiwit werd verwijderd door centrifugeren en DA werd bepaald door HPLC met elektrochemische detectie zoals eerder beschreven voor methamfetamine (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
Bepaling van TH- en DAT-eiwitniveaus door immunoblotting
De effecten van medicamenteuze behandelingen op de striatale TH- en DAT-spiegels werden bepaald door immunoblotting als een index van toxiciteit voor striatale DA-zenuwuiteinden. Muizen werden gedood door onthoofding na behandeling en het striatum werd bilateraal ontleed. Het weefsel werd bewaard bij -80°C. Bevroren weefsel werd ontleed door sonicatie in 1% SDS bij 95°C en onoplosbaar materiaal werd gesedimenteerd door centrifugatie. Eiwit werd bepaald met de bicinchoninezuurmethode en gelijke hoeveelheden eiwit (70 μg/liter) werden opgelost door SDS-polyacrylamide gelelektroforese en vervolgens geëlektrobloteerd op nitrocellulose. Blots werden geblokkeerd in Tris gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (0,1% v/v) en 5% vetvrije melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Primaire antilichamen tegen TH (1:1000) of DAT (1:1000) werden aan de blots toegevoegd en gedurende 16 uur bij 4 °C geïncubeerd. De blots werden 3X gewassen in Tris-gebufferde zoutoplossing om niet gereageerde antilichamen te verwijderen en vervolgens geïncubeerd met HRP-geconjugeerd anti-IgG secundair antilichaam (1:4000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Immunoreactieve banden werden gevisualiseerd door versterkte chemiluminescentie en de relatieve dichtheden van TH- en DAT-reactieve banden werden bepaald door beeldvorming met een Kodak Image Station (Carestream Molecular Systems, Rochester, NY, USA) en gekwantificeerd met ImageJ-software (NIH).
Gegevensanalyse
Twee-weg ANOVA's werden uitgevoerd om de dosis effecten van methamfetamine versus mephedrone op DA, DAT en TH te analyseren. De effecten van de behandelingen met drugs op het striatale DA-, TH- en DAT-gehalte werden getest op significantie door een eenzijdige ANOVA gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest. De resultaten van medicamenteuze behandelingen op de kerntemperatuur van het lichaam in de loop van de tijd werden geanalyseerd met behulp van een twee-weg ANOVA gevolgd door Bonferroni's test om de significantie van verschillen in temperatuur op individuele tijdstippen na de behandeling te bepalen. Verschillen werden significant geacht als p < 0,05. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism versie 5.02 voor Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com).
Ga naar:
Resultaten
Effecten van mephedrone op door methamfetamine geïnduceerde neurotoxiciteit
Mephedrone, in doses (10, 20 of 40 mg/kg) waarvan bekend is dat ze geen DA zenuwuiteinde toxiciteit veroorzaken (Angoa-Perez et al. 2012), werd 30 minuten voor elke injectie met methamfetamine toegediend. Methamfetamine werd toegediend in doses die matige (4X 2,5 mg/kg) of ernstige (4X 5 mg/kg) schade veroorzaken aan DA zenuwuiteinden van het striatum (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). De resultaten in Fig. 1 laten zien dat de hoofdeffecten van de dosis methamfetamine (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) en de dosis mephedrone (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) op de DA-niveaus in het striatum zeer significant waren met behulp van tweezijdige ANOVA. Het hoofdeffect van mephedrone gegeven in combinatie met ofwel 2,5 mg/kg (F4,22 = 35,96, p < 0,001) of 5,0 mg/kg methamfetamine (F4,17 = 953,9, p < 0,0001) was ook zeer significant bij een eenzijdige ANOVA. Alle behandelingen met een van beide doseringen methamfetamine ± mephedrone veroorzaakten significant grotere verminderingen in DA in vergelijking met de respectievelijke controle (p < 0,0001 voor alle). Fig. 1 laat ook zien dat mephedrone doses van 20 (p < 0,01) en 40 mg/kg (p < 0,001) de depleterende effecten van 2,5 mg/kg methamfetamine op DA significant versterkten, terwijl alle doses mephedrone de effecten van 5,0 mg/kg methamfetamine op DA-niveaus significant versterkten (p < 0,0001 voor alle).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/sywobkqrnd-jpg.47/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Fig.1
Effecten van mephedrone op methamfetamine-geïnduceerde verminderingen in striatale DA. Muizen werden behandeld met de aangegeven doses mephedrone (MEPH) 30 minuten voorafgaand aan elke injectie van 2,5 (-) of 5,0 mg / kg (■) methamfetamine (METH) en 2d later opgeofferd voor bepaling van de striatale niveaus van DA door HPLC. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM voor 5-7 muizen per groep. Sommige foutbalkjes waren te klein om de grootte van de symbolen te overschrijden en zijn niet zichtbaar. ***p < 0,001 vs controles en #p < 0,01, ##p < 0,001 of ###p < 0,0001 vs de respectievelijke dosis methamfetamine (Tukey's meervoudige vergelijkingstest).
Fig. 2a laat zien dat mephedrone de door methamfetamine geïnduceerde verlaging van de DAT niveaus significant verhoogde, zoals bepaald door immunoblotting. Immunoblots werden gekwantificeerd en in overeenstemming met de resultaten voor DA, waren de hoofdeffecten van methamfetaminedosis (F1,92 = 9,48, p < 0,001) en mephedrone dosis (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) op DAT niveaus in striatum zeer significant door twee-weg ANOVA (Fig. 2b). Het hoofdeffect van mephedrone gegeven in combinatie met ofwel 2,5 mg/kg (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) of 5,0 mg/kg methamfetamine (F4,39 = 24,84, p < 0,0001) was ook zeer significant in een eenzijdige ANOVA. Alle behandelingen met een van beide doseringen methamfetamine ± mephedrone veroorzaakten significant grotere verlagingen van de DAT in vergelijking met de respectievelijke controle (p < 0,01 voor 2,5 mg/kg methamfetamine alleen; p < 0,0001 voor alle andere behandelingen). Fig. 2b laat ook zien dat mephedrone doses van 20 mg/kg (p < 0,01) en 40 mg/kg (p < 0,001) de verminderingen in DAT veroorzaakt door 2,5 mg/kg methamfetamine significant versterkten, terwijl alleen de dosis van 40 mg/kg mephedrone de effecten van 5,0 mg/kg methamfetamine op DAT verminderingen significant versterkte (p < 0,01).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/bfu3sx5dnr-jpg.4797/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Fig.2
Effecten van mephedrone op methamfetamine-geïnduceerde verminderingen in striatale DAT. Muizen werden behandeld met de aangegeven doses mephedrone (MEPH) 30 min voor elke injectie van 2,5 (●) of 5,0 mg / kg (■) methamfetamine (METH) en 2d later opgeofferd voor bepaling van de striatale niveaus van DAT door immunoblotting (a). Blots werden gekwantificeerd met ImageJ en gegevens zijn gemiddelde ± SEM voor 10-12 muizen per groep (b). *p < 0,01 of ***p < 0,0001 vs controle (C) en #p < 0,01 of ##p < 0,001 vs de respectievelijke dosis methamfetamine (Tukey's meervoudige vergelijkingstest).
Fig. 3a laat zien dat mephedrone de door methamfetamine geïnduceerde verlaging van de TH-spiegel significant verhoogde, zoals bepaald door immunoblotting. Immunoblots werden gekwantificeerd en in overeenstemming met bovenstaande resultaten voor DA en DAT, waren de hoofdeffecten van methamfetaminedosis (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) en mephedrone dosis (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) zeer significant door twee-weg ANOVA (Fig. 3b). Het hoofdeffect van mephedrone gegeven in combinatie met 2,5 mg/kg (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) of 5,0 mg/kg methamfetamine (F4,49 = 99,16, p < 0,0001) was ook zeer significant in een eenzijdige ANOVA. Alle behandelingen met één van beide doseringen methamfetamine ± mephedrone veroorzaakten significant grotere verlagingen van TH in vergelijking met de respectievelijke controle (p < 0,001 voor 2,5 mg/kg methamfetamine + 10 mg/kg mephedrone; p < 0,0001 voor alle andere combinaties), met uitzondering van 2,5 mg/kg methamfetamine alleen, dat de TH-niveaus niet significant veranderde (d.w.z. geen toxiciteit). Fig. 3b laat ook zien dat mephedrone doses van 20 mg/kg (p < 0,01) en 40 mg/kg (p < 0,001) de TH-verlagingen veroorzaakt door 2,5 mg/kg methamfetamine significant versterkten en alle drie de doses mephedrone versterkten significant (p < 0,0001) de effecten van 5,0 mg/kg methamfetamine op TH-verlagingen.
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/tggfrjpqru-jpg.4798/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Fig. 3
Effecten van mephedrone op methamfetamine-geïnduceerde reducties in striatale TH. Muizen werden behandeld met de aangegeven doses mephedrone (MEPH) 30 minuten voor elke injectie van 2,5 (●) of 5,0 mg / kg (■) methamfetamine (METH) en 2d later opgeofferd voor bepaling van de striatale niveaus van TH door immunoblotting (a). Blots werden gekwantificeerd met ImageJ en gegevens zijn gemiddelde ± SEM voor 10-12 muizen per groep (b). Sommige foutbalken waren te klein om de grootte van de symbolen te overschrijden en zijn niet zichtbaar. **p < 0,001 of ***p < 0,0001 vs controle (C) en #p < 0,01, ##p < 0,001 of ###p < 0,0001) vs de respectievelijke dosis methamfetamine (Tukey's meervoudige vergelijkingstest).
Effecten van mephedrone op door methamfetamine geïnduceerde hyperthermie
Mephedrone veroorzaakt, net als methamfetamine, aanzienlijke hyperthermie (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Wanneer mephedrone 30 minuten voor elke injectie met methamfetamine werd toegediend, is in Fig. 4 te zien dat de hoofdeffecten van de doses methamfetamine en mephedrone (F1.300 = 11,99, p < 0,0001) en de tijd (F4.300 = 51,73, p < 0,0001) zeer significant waren met behulp van tweezijdige ANOVA. De hoofdeffecten van mephedrone gegeven in combinatie met ofwel 2,5 mg/kg methamfetamine (F4.120 = 41,44, p < 0,0001, paneel a) in de tijd (F30.120 = 3,84, p < 0,0001) of 5,0 mg/kg methamfetamine (F4.120 = 78,09, p < 0,0001, paneel b) in de tijd (F30.120 = 9,98, p < 0,0001) waren ook zeer significant door tweezijdige ANOVA. Alle behandelingen met een van beide doseringen methamfetamine ± mephedrone verschilden significant van de respectievelijke controles (p < 0,0001 voor alle behandelingen).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/x0ik9hdwsw-jpg.4799/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Fig. 4
Effecten van mephedrone op door methamfetamine geïnduceerde hyperthermie. Muizen werden behandeld met de aangegeven doses mephedrone (MEPH) 30 min voor elke injectie van 2,5 (a) of 5,0 mg/kg (b) methamfetamine (METH). Kerntemperaturen werden gemeten met intervallen van 20 minuten door telemetrie vanaf 60 minuten voor de eerste injectie met methamfetamine. De 4 methamfetamine-injecties worden aangegeven door de pijlen die op de x-as rusten. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde lichaamstemperatuur van 6-8 muizen per groep. SEM's waren altijd < 10% van het gemiddelde en zijn weggelaten voor de duidelijkheid.
Effecten van mephedrone op amfetamine- en MDMA-geïnduceerde neurotoxiciteit
Om te testen of de versterkende effecten van mephedrone op methamfetamine kunnen worden uitgebreid naar andere neurotoxische amfetaminen, werden muizen behandeld met deze β-ketoamfetamine (20 mg/kg) plus amfetamine (4X 5 mg/kg) of MDMA (4X 20 mg/kg) en de resultaten worden gepresenteerd in Fig. 5. Onthoud dat mephedrone zelf geen striatale DA, DAT of TH vermindert (Angoa-Perez et al. 2012). Het hoofdeffect van de drug (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) was zeer significant door een eenzijdige ANOVA voor DA reducties (Fig. 5a). Het is ook te zien in Fig. 5a dat alle behandelingen met amfetamine (p < 0,001) of MDMA (p < 0,001) alleen of in combinatie met mephedrone (p < 0,0001 voor beide drugs) de DA-niveaus significant verlaagden ten opzichte van de controle. Mephedrone versterkte DA-verlagingen veroorzaakt door amfetamine (p < 0,01) of MDMA (p < 0,01) aanzienlijk. Fig. 5b toont vergelijkbare effecten van behandelingen met combinatiemedicijnen op DAT niveaus in het striatum. Het hoofdeffect van de drug (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) was zeer significant door een eenzijdige ANOVA voor DAT. Het is ook te zien in Fig. 5b dat alle behandelingen met amfetamine of MDMA significant (p < 0,0001 voor alle) lager waren in vergelijking met de controle. Mephedrone versterkte ook significant DAT-verlagingen veroorzaakt door amfetamine of MDMA (p < 0,0001 in beide gevallen). Tot slot laat Fig. 5c zien dat het hoofdeffect van de drug (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) zeer significant was door een eenzijdige ANOVA voor verminderingen in TH. Het is ook te zien in Fig. 5c dat alle behandelingen met amfetamine of MDMA significant (p < 0,0001 voor alle) lager waren in vergelijking met de controle. Mephedrone versterkte ook significant de TH-verlagingen veroorzaakt door amfetamine of MDMA (p < 0,0001 in beide gevallen).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/onvypkgxvn-jpg.4800/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Fig. 5
Effecten van mephedrone op amfetamine- of MDMA-geïnduceerde DA zenuwuiteinde neurotoxiciteit. Muizen werden behandeld met 20 mg / kg mephedrone (MEPH) 30 min voor elke injectie van 5,0 mg / kg amfetamine (AMPH) of 20 mg / kg MDMA en opgeofferd 2 d na de behandeling voor de bepaling van de striatale niveaus van (a) DA door HPLC. (b) DAT en (c) TH werden bepaald door immunoblotting en blots werden gekwantificeerd met ImageJ. Representatieve immunoblots voor DAT en TH zijn opgenomen als inzet bij panelen (b) en (c) respectievelijk en behandelingen voor beide panelen worden aangeduid met 1,5: controle; 2,6: MEPH; 3: AMPH; 4: AMPH + MEPH; 7: MDMA; en 8: MDMA + MEPH. Gegevens zijn gemiddelde ± SEM voor 5-12 muizen in elke groep. **p < 0,001 of ***p < 0,0001 vs controle en #p < 0,01 of ###p < 0,0001 vs AMPH of MDMA (Tukey's meervoudige vergelijkingstest).
Effecten van nomifensine op methamfetamine-geïnduceerde neurotoxiciteit
Nomifensine, een krachtige DAT-blokker zonder bekend misbruik of neurotoxisch potentieel, werd getest op zijn vermogen om te beschermen tegen methamfetamine-geïnduceerde neurotoxiciteit en in contrast met de werking van mephedrone op de toxiciteit voor DA-zenuwuiteinden veroorzaakt door methamfetamine, amfetamine en MDMA. De resultaten in Fig. 6a laten zien dat het hoofdeffect van de drug (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) op de DA-niveaus zeer significant was met een eenzijdige ANOVA. Nomifensine alleen veranderde de DA-niveaus niet, maar de vermindering veroorzaakt door methamfetamine (p < 0,0001) werd licht maar significant omgekeerd door nomifensine (p < 0,01). Het hoofdeffect van de drug (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) op DAT-niveaus was zeer significant door een eenzijdige ANOVA zoals weergegeven in Fig. 6b. Nomifensine veranderde de DAT niveaus niet, maar bood significante bescherming (p < 0,001) tegen de afname in striatale DAT veroorzaakt door methamfetamine (p < 0,0001) in vergelijking met de controle. Tot slot laat Fig. 6c zien dat het hoofdeffect van drug (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) op TH niveaus zeer significant was door een eenzijdige ANOVA. Zoals gezien voor DA en DAT, werd de vermindering in TH veroorzaakt door methamfetamine (p < 0,0001) licht maar significant voorkomen door nomifensine (p < 0,01).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/daczg9cwfv-jpg.4801/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Fig. 6
Effecten van nomifensine op methamfetamine-geïnduceerde DA zenuwuiteinde neurotoxiciteit. Muizen werden behandeld met 5,0 mg / kg nomifensine (NOM) 30 min voor elke injectie van 5,0 mg / kg methamfetamine (METH) en 2d later opgeofferd voor bepaling van de striatale niveaus van (a) DA door HPLC. (b) DAT en (c) TH werden bepaald door immunoblotting en blots werden gekwantificeerd met ImageJ. Representatieve immunoblots voor DAT en TH zijn opgenomen als inzet van panelen (b) en (c) respectievelijk. Gegevens zijn gemiddelde plus SEM voor 5-7 muizen per groep. ***p < 0,0001 vs controle (C) en #p < 0,01 of ##p < 0,001 vs methamfetamine alleen (Tukey's meervoudige vergelijkingstest).
Discussie
Het doel van de huidige studie was om te bepalen of mephedrone DA zenuwuiteinde toxiciteit veroorzaakt door methamfetamine zou voorkomen. Op basis van de chemische gelijkenis met methamfetamine en MDMA werd aanvankelijk verwacht dat mephedrone schadelijke effecten zou hebben op het DA neuronale systeem. Verschillende studies stelden echter bijna gelijktijdig vast dat mephedrone niet toxisch was voor DA zenuwuiteinden (Angoa-Perez et al. 2012, Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011). De vraag of deze drug schade veroorzaakt aan het 5-HT neuronale systeem blijft open. Eén onderzoek rapporteerde aanhoudende verminderingen in de functie van 5-HT zenuwuiteinden (Hadlock et al. 2011), terwijl een ander onderzoek vond dat mephedrone geen schade veroorzaakte (Baumann et al. 2012). Mephedrone interageert met de DA zenuwuiteinden op een manier die suggereert dat het inderdaad de afgifte stimuleert en de DA heropname blokkeert via de interacties met de DAT. Een belangrijk facet van het neurotoxische werkingsmechanisme van methamfetamine is het vermogen om toegang te krijgen tot DA zenuwuiteinden via de DAT en de DA homeostase te verstoren (Sulzer 2011). Als deze vroege stap in de neurotoxische cascade van methamfetamine wordt voorkomen door remming van de DAT, wordt toxiciteit voorkomen (Pu et al. 1994, Poth et al. 2012, Marek et al. 1990, Schmidt en Gibb 1985). We dachten dat mephedrone dezelfde beschermende eigenschap zou kunnen hebben als andere DAT-remmers, maar in plaats daarvan zagen we een significante toename van toxiciteit. Deze interactie werd gezien bij gebruik van twee verschillende doses methamfetamine die matige of ernstige schade veroorzaken aan DA zenuwuiteinden (respectievelijk 4X 2,5 of 5,0 mg/kg). Dit versterkende effect van mephedrone was niet beperkt tot methamfetamine en breidde zich uit tot amfetamine en MDMA, twee drugs die vaak samen met mephedrone en andere β-ketoamfetaminen worden gebruikt (Feyissa en Kelly 2008, Schifano et al. 2011, Kelly 2011). Dus ondanks het feit dat mephedrone geen toxiciteit veroorzaakt aan ten minste DA-zenuwuiteinden van het striatum, versterkt het de neurotoxische effecten van andere misbruikte drugs. Deze nieuwe bevinding zou misbruik van mephedrone nog grimmiger moeten maken, omdat het gebrek aan intrinsieke neurotoxiciteit het middel onschuldig kan laten lijken.
Hyperthermie is een vaak gerapporteerd acuut schadelijk effect van inname van methamfetamine (Greene et al. 2008) en β-ketoamfetamine bij mensen (Borek en Holstege 2012, Prosser en Nelson 2012). Net als methamfetamine veroorzaken veel van de β-ketamfetamine drugs ook aanzienlijke verhogingen van de kerntemperatuur bij knaagdieren (Angoa-Perez et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Rockhold et al. 1997). Hoewel de hyperthermie veroorzaakt door methamfetamine kan bijdragen aan de morfologische en neuronale schadelijke effecten, is het niet noodzakelijkerwijs zo dat hyperthermie de directe oorzaak is van deze effecten (Kiyatkin en Sharma 2009). We registreerden de kerntemperatuur van het lichaam bij muizen die werden behandeld met mephedrone en methamfetamine en zagen dat de gecombineerde behandeling de temperatuur niet verder liet stijgen dan de maximale stijging die werd waargenomen na een van beide drugs alleen. Methamfetamine veroorzaakte een dosisgerelateerde stijging van de lichaamstemperatuur en deze hyperthermie was onveranderlijk over het gehele geteste dosisbereik van mephedrone. In feite bleef de daling van de lichaamstemperatuur na injectie, die werd waargenomen na behandeling met mephedrone (Angoa-Perez et al. 2012), behouden bij hogere doses mephedrone plus methamfetamine. Hoewel de door drugs veroorzaakte hyperthermie niet werd versterkt door gecombineerde behandeling met drugs, waren de neurotoxische effecten additief. Daarom lijkt het er, in ieder geval in dit geval, op dat de neurotoxische effecten van methamfetamine kunnen worden versterkt door mephedrone op een manier die onafhankelijk is van hyperthermie.
Mephedrone remt duidelijk de DAT-functie en blokkeert de DA-heropname in vitro (Lopez-Arnau et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Kehr et al. 2011, Martinez-Clemente et al. 2012, Cozzi et al. 1999). Mephedrone verdringt WIN-35.428 van zijn bindingsplaats op de DAT, wat suggereert dat het een competitieve remmer van DA-opname is (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). De potentie van mephedrone in dit opzicht lijkt erg op die van methamfetamine (Cozzi et al. 1999) en MDMA (Escubedo et al. 2011). Het is niet bekend of mephedrone wordt getransporteerd door de DAT, maar methcathinone wel (Cozzi en Foley 2003). Nomifensine en amfononzuur, die binden aan de DAT en de DA-opname remmen, bieden aanzienlijke bescherming tegen methamfetamine-geïnduceerde neurotoxiciteit (Pu et al. 1994, Marek et al. 1990, Schmidt en Gibb 1985, Poth et al. 2012) en muizen zonder DAT zijn resistent tegen de neuronale toxiciteit van methamfetamine (Fumagalli et al. 1998). Wetende dat mephedrone niet neurotoxisch is en een DAT-blokker leidt tot de voorspelling dat het toxiciteit zou moeten voorkomen. We testten nomifensine in dit verband als een positieve controle en bevestigden dat het beschermt tegen methamfetamine-geïnduceerde depletie van DA, DAT en TH. Nomifensine remt ook de noradrenaline transporter (Brogden et al. 1979) maar deze eigenschap kan de huidige resultaten niet verklaren omdat de meeste β-ketoamfetaminen waaronder mephedrone de noradrenaline transporter remmen en de noradrenaline opname blokkeren (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). Een rol van het 5-HT neuronale systeem in sommige farmacologische effecten van mephedrone is mogelijk in het licht van het vermogen van deze drug, net als MDMA (Yamamoto et al. 1995), om efflux van striatale DA te veroorzaken via de interacties met 5-HT2A receptoren (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). De hyper-locomotie veroorzaakt door mephedrone is afhankelijk van endogeen 5-HT (Lopez-Arnau et al. 2012) en dit middel stimuleert ook de afgifte van 5-HT en remt de opname ervan in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) en in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). We kunnen echter een rol van endogeen 5-HT in de DA neurotoxiciteit van ten minste methamfetamine uitsluiten door aan te tonen dat muizen die genetisch zijn verarmd van 5-HT hun gevoeligheid voor neurotoxiciteit behouden (Thomas et al. 2010).
Mephedrone zou de neurotoxiciteit van methamfetamine door verschillende mogelijke mechanismen kunnen versterken. Ten eerste zou mephedrone kunnen interageren met de VMAT om lekkage van DA in het cytoplasma van de presynaptische zenuwuiteinden te veroorzaken. Behandelingen die de cytoplasmatische pool (d.w.z. drug-releasable) van DA verhogen, verhogen de methamfetamine neurotoxiciteit (Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009, Schmidt et al. 1985). Dit mechanisme is niet waarschijnlijk omdat methcathinon slechts een zwakke interactie heeft met de VMAT (Cozzi et al. 1999). Ten tweede zou de combinatie van mephedrone plus methamfetamine een synergetisch effect kunnen hebben op de niet-vesiculaire afgifte van DA, maar deze mogelijkheid lijkt ook onwaarschijnlijk in het licht van resultaten waaruit blijkt dat behandeling van DAT- of SERT-expressie CHO-cellen met methylone plus methamfetamine geen additief effect heeft op de afgifte van DA of 5-HT (Sogawa et al. 2011). Ten derde zou mephedrone kunnen interageren met de DAT op een nieuwe manier die bijdraagt aan additieve toxiciteit. Er is aangetoond dat methylone in combinatie met methamfetamine synergetische cytotoxiciteit veroorzaakt in CHO-cellen die de DAT of SERT tot expressie brengen, maar niet in wild type CHO-cellen zonder de transporteurs (Sogawa e.a. 2011). De cytotoxiciteit gezien in gekweekte cellen in deze studies (d.w.z. vrijkomen van LDH) is heel anders dan de schade aan DA zenuwuiteinden veroorzaakt door methamfetamine, maar dit mechanisme suggereert een interessante maar ongedefinieerde rol voor de DAT in verhoogde cytotoxiciteit. Ten slotte zou mephedrone het metabolisme van methamfetamine kunnen veranderen. Mephedrone wordt voornamelijk gemetaboliseerd door N-demethylering (Meyer en Maurer 2010), net als methamfetamine en MDMA (Caldwell 1976). Ondersteuning voor dit mechanisme komt van de demonstratie dat methamfetamine en MDMA wederzijds de productie van hun respectieve primaire metabolieten remmen en de plasmaspiegels van de drugs verhogen tot boven de niveaus die worden waargenomen na toediening van een van beide drugs alleen (Kuwayama et al. 2012). De doses mephedrone die nu en in onze vorige studie (Angoa-Perez et al. 2012) zijn gebruikt, zijn weliswaar hoog, maar niet neurotoxisch en vallen binnen het bereik dat door mensen wordt misbruikt (McErath en O'Neill 2011). Daarom zou mephedrone net als MDMA de plasmaspiegels van methamfetamine kunnen verhogen door het metabolisme ervan te remmen. Een diepgaande farmacokinetische analyse is nodig om deze laatste mogelijkheid te bevestigen.
Misbruik van de β-ketamfetaminen neemt schrikbarend toe en mephedrone is nu een van de meest gebruikte drugs na cannabis, MDMA en cocaïne (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Bovendien wekt mephedrone bij mensen sterkere verlangens op dan MDMA (Brunt et al. 2011) en gebruikers die mephedrone snuiven, vinden het verslavender dan cocaïne (Winstock et al. 2011b). Mephedrone wordt door mensen op een binge-achtige manier geconsumeerd (d.w.z. "stapelen") en wordt vaak samen met andere drugs gebruikt, zoals cannabis en de amfetamine psychostimulantia (Schifano et al. 2011, Fass et al. 2012, Winstock et al. 2011a, Kelly 2011, Torrance en Cooper 2010). Mephedrone wordt steeds vaker aangetroffen in tabletten die worden verkocht als MDMA (Brunt et al. 2011) en het gebruik ervan zal dat van MDMA waarschijnlijk overtreffen naarmate de zuiverheid van deze laatste drug verder afneemt (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Op basis van de veelvoorkomende misbruikpatronen van mephedrone en andere bestanddelen van "badzout" is het belangrijk om na te gaan of er extra gezondheidsrisico's ontstaan bij mensen wanneer deze drugs opzettelijk of onbewust worden gecombineerd met amfetaminen. Onze resultaten die aantonen dat ten minste mephedrone de neurotoxiciteit van DA zenuwuiteinden van het striatum veroorzaakt door methamfetamine, amfetamine en MDMA aanzienlijk versterkt, onthullen een bijzonder gevaarlijke en onverwachte eigenschap van deze β-ketamfetamine.
Gebruikte afkortingen
5-HT serotonine
DA dopamine
DAT DA transporter
MDMA 3,4-methyleendioxymethamfetamine
TH tyrosine hydroxylase
VMAT vesiculaire monoaminetransporter
