Cromatografia em coluna (flash)

[G.Patton]

Introdução

A cromatografia em coluna é uma extensão da cromatografia em camada fina (TLC). Presume-se que o leitor tenha alguma experiência em práticas laboratoriais e que tenha lidado com a cromatografia de camada fina. Em vez de aplicar uma amostra em uma camada fina de sílica ou alumina, a amostra é depositada em um cilindro de adsorvente e o solvente é continuamente aplicado com pressão até que os componentes sejam completamente drenados do cilindro. Com essa modificação, os componentes podem ser não apenas separados, mas também coletados em diferentes recipientes, permitindo a purificação de misturas e a separação de medicamentos com poluentes. A cromatografia em coluna (também conhecida como "cromatografia flash") é usada com frequência em ambientes de pesquisa, como evidenciado por sua ocorrência comum nas seções de procedimentos de artigos de periódicos.

Discussão do procedimento

Os mesmos princípios básicos da cromatografia em camada fina (TLC) se aplicam à cromatografia em coluna. De fato, uma TLC é sempre executada antes da execução de uma coluna para avaliar a situação e determinar a proporção adequada de solvente. Para obter uma boa separação, o ideal é que o componente desejado tenha um Rf em torno de 0,35 (leia sobre Rf no tópico TLC) e esteja separado de outros componentes por pelo menos 0,2 unidades de Rf. Se os pontos a serem separados estiverem muito próximos (se a diferença em Rf for < 0,2), é melhor que o meio dos pontos tenha um Rf de 0,35. Um Rf próximo a 0,35 é ideal porque é lento o suficiente para que ocorra o equilíbrio da fase estacionária e móvel, mas rápido o suficiente para minimizar o alargamento da banda devido à difusão.

Há algumas variáveis que não se aplicam à TLC, mas que afetam a separação de componentes na cromatografia de coluna. Elas incluem o diâmetro da coluna, a quantidade de adsorvente usado e a taxa de fluxo do solvente. A figura. 1 mostra recomendações variáveis com base no tamanho da amostra e no grau de separação entre os componentes. Em todos os cenários, as colunas devem ser preparadas entre 12,5 e 15 cm de altura.

Spoiler: Fig. 1 Resumo dos valores recomendados para cromatografia em coluna

Por exemplo, uma coluna de 2,5 cm deve ser capaz de purificar cerca de 400 mg de material se a separação for boa (ΔRf > 0,2, terceira coluna na Figura 1), ou cerca de 160 mg se a separação for difícil (ΔRf > 0,1). A coluna deve poder ser preparada e eluída com cerca de 200 ml de solvente, e as frações podem ser coletadas com aproximadamente 10 ml de solução cada.

Há diversas variações sobre como executar fisicamente uma coluna. Uma grande diferença entre os métodos é a forma como a coluna é preparada. No método de "empacotamento a seco", a sílica ou a alumina seca é adicionada diretamente a uma coluna e o solvente é deixado escorrer em porções e, em seguida, com pressão. No método de "empacotamento úmido", a coluna é preenchida primeiro com solvente, depois a sílica ou a alumina seca é levemente agitada e, em seguida, empacotada com pressão. No método "slurry", o solvente é adicionado à sílica ou à alumina em um frasco Erlenmeyer, despejado na coluna como um material lamacento e, em seguida, embalado com pressão (a pressão pode ser produzida por uma seringa).

É importante saber que o calor é liberado quando o solvente é adicionado à sílica ou à alumina (elas têm um calor exotérmico de solvatação). O método de pasta é apresentado nesta seção, e o principal motivo é que ele permite que essa etapa exotérmica ocorra em um frasco Erlenmeyer em vez de na coluna. Se o calor for liberado durante o empacotamento da coluna, ele poderá gerar bolhas a partir da ebulição do solvente. Essas bolhas podem interferir na separação da coluna se não forem removidas adequadamente e podem rachar o material adsorvente na coluna.

Procedimentos passo a passo

Spoiler: Fig. 2

a) TLC da mistura de ferroceno/acetilferroceno, b) Cromatografia em coluna

A coluna retratada nesta seção mostra a purificação de uma amostra de 0,20 g contendo uma mistura de ferroceno e acetilferroceno (o TLC bruto está na Fig. 2 a). Foram coletadas frações de aproximadamente 8 ml em pequenos tubos de ensaio, e foram usados aproximadamente 400 ml de eluente.

Spoiler: Fig. 3

a) Placa TLC da mistura bruta de ferroceno/acetilferroceno antes da eluição, b) Após a eluição, c) Coluna com frita, d) Coluna com algodão preso no fundo, e) Coluna sem a cunha de algodão (precisaria ser inserida antes do uso)

Executar um TLC

1) Faça um TLC na amostra a ser purificada (Fig. 3 a e b) para determinar o solvente apropriado para a cromatografia. O componente desejado deve ter um Rf em torno de 0,35 e, idealmente, deve ser separado de todos os outros pontos por pelo menos 0,2 unidades de Rf.

2) Prepare um lote de eluente que forneça o valor Rf adequado. A quantidade preparada depende da quantidade de amostra, do tamanho da coluna e se a composição do solvente está planejada para ser alterada no meio do caminho. (Consulte a Fig. 1 para ver as diretrizes e a série eluotrópica para ver as tendências da "potência do solvente").

Preparar a coluna empacotada

3) Obtenha uma coluna apropriada (consulte a Fig. 1) e certifique-se de que haja algo próximo à torneira que permita a passagem de líquido, mas não de sólido. As colunas podem ter um disco sinterizado (também conhecido como "frit"), Fig. 3 c), ou um tampão de algodão ou lã de vidro remanescente do usuário anterior (Fig. 3 d). Se não houver disco ou plugue (Fig. 3 e), insira um pequeno chumaço de algodão ou lã de vidro no fundo da coluna usando uma haste longa.

Spoiler: Fig. 4

a) Verter a sílica a 12,5-15 cm de altura na capela de exaustão, b) Verter a sílica em um frasco Erlenmeyer, c e d) Fazer uma pasta

4) Fixe sua coluna perfeitamente na vertical em um suporte de anel ou treliça, prendendo-a com grampos de três dedos em dois locais. Na capela de exaustão, despeje a sílica gel ou o adsorvente de alumina na coluna a uma altura entre 12,5 e 15 cm (Fig. 4 a).

Observação de segurança: a sílica em pó e a alumina são irritantes para os pulmões e devem sempre ser manuseadas com cuidado em uma capela de exaustão. A poeira derramada deve ser descartada com uma toalha de papel molhada (se molhada, as partículas finas são menos dispersivas).

5) Na capela de exaustão, despeje o adsorvente medido na coluna em um frasco Erlenmeyer (Fig. 4 b) e, em seguida, adicione um pouco de eluente (Fig. 4 c). Faça uma pasta solta girando e mexendo com uma haste de agitação de vidro (Fig. 4 d) até que todo o adsorvente esteja completamente úmido, as bolhas de gás sejam liberadas e a consistência seja um pouco espessa, mas derramável.

Spoiler: Fig. 5

a) Despejando a pasta na coluna, b) Enxaguando o frasco, c) Adsorvente aderido às laterais da coluna, d) Enxaguando o adsorvente aderido

6) Coloque um béquer ou frasco Erlenmeyer sob a coluna fixada e abra a torneira. Em um movimento rápido, agite e despeje a pasta de sílica ou alumina na coluna usando um funil de boca larga (Fig. 5 a). Use imediatamente mais eluente para enxaguar a pasta residual do frasco Erlenmeyer (Fig. 5 b) e para a coluna.

7) Enxágue imediatamente qualquer sílica ou alumina das laterais do reservatório da coluna usando eluente e um movimento giratório de uma pipeta Pasteur (Fig. 5 c e d). Se deixar secar, o adsorvente se agarrará ao vidro e não poderá ser enxaguado facilmente.

Spoiler: Fig. 6

a) Empurrando a coluna para remover bolhas de ar, b) Aplicando pressão de ar, c) Adicionando areia, d) Enxaguando a areia das laterais

8) Empurre a coluna com firmeza usando um anel de cortiça ou os nós dos dedos (Fig. 6 a) para desalojar quaisquer bolhas de ar na coluna (que poderiam causar má separação ou rachaduras do adsorvente na coluna) e para promover uma deposição uniforme do adsorvente.

9) Aplique uma leve pressão de ar no topo da coluna (Fig. 6 b) para comprimi-la, parando quando o nível do eluente estiver a 1 cm do topo da coluna. Se um adaptador em T for usado com a linha de ar, como na Fig. 6 b, o controle fino do fluxo de ar poderá ser feito ajustando-se a braçadeira de aperto no tubo de borracha. Durante todo o processo de eluição, mantenha a coluna branca de adsorvente úmida, com o nível do eluente acima do topo da sílica ou da alumina. Quebre suavemente o lacre para interromper a aplicação de pressão e feche a torneira para evitar que o líquido continue escorrendo.

10) Adicione uma camada fina de areia (Fig. 6 c), com aproximadamente 0,5 cm de altura. Enxágue as laterais da coluna com eluente usando um movimento giratório para desalojar a areia das laterais do vidro (Fig. 6 d). Abra a torneira e deixe o líquido escorrer até que o líquido esteja logo acima da camada de areia. Aplique pressão de ar se o gotejamento estiver muito lento.

Adicione a amostra

Quando a amostra é aplicada à coluna, há uma corrida contra o tempo, pois a difusão começará a ampliar o material. Uma amostra não deve ser aplicada até que você esteja pronto para completar a coluna imediatamente e em sua totalidade. Esse processo pode levar de 15 a 90 minutos! Se estiver usando tubos de ensaio para coletar frações, os tubos de ensaio devem ser dispostos em um suporte antes de adicionar a amostra, e a altura da coluna deve ser ajustada de modo que o suporte para tubos de ensaio possa deslizar por baixo.

Spoiler: Fig. 7

a) Dissolvendo um sólido com uma pequena quantidade de diclorometano, b) Aplicando a amostra, c) Enxaguando a amostra em seu frasco, d) Aplicando pressão para empurrar a amostra para a coluna logo após a camada de areia

11) Se a amostra bruta for um líquido, use-o diretamente (vá para a etapa 13).

12) Se a amostra bruta for um sólido, faça uma das seguintes ações.

a) Situação ideal: dissolver o sólido na quantidade mínima do eluente (alguns ml, no máximo).

b) Se o sólido não for particularmente solúvel ou não se dissolver em alguns ml do eluente, dissolva-o na quantidade mínima de diclorometano (alguns ml, no máximo, Fig. 7 a).

c) Se o sólido for insolúvel no eluente, um procedimento alternativo também é possível. Dissolva o sólido em um frasco de fundo redondo usando alguns ml de um solvente de baixo ponto de ebulição (por exemplo, diclorometano ou acetona). Adicione ao frasco aproximadamente 1 g de sílica ou alumina e, em seguida, remova o solvente no evaporador rotativo para deixar um sólido que contenha a amostra depositada no adsorvente. Com uma polegada de eluente repousando sobre a coluna empacotada (pule a adição da camada de areia se esse método for usado), despeje a amostra adsorvida de sílica na coluna usando um funil de boca larga. Se houver poeira aderida ao vidro, enxágue-o com mais eluente (vá para a etapa 15).

13) Delicadamente, adicione a amostra à coluna por meio de uma pipeta, pingando o líquido ou a solução diretamente na areia com a ponta da pipeta o mais próximo possível, não pelas laterais (Fig. 7 b). Tome cuidado para não esguichar o líquido com força, de modo a causar reentrâncias na areia ou na coluna de sílica/alumina.

14) Enxágue o recipiente de amostra com um pouco de solvente (ou diclorometano, se usado, Fig. 7 c) e adicione o enxágue à coluna usando a mesma pipeta (para enxaguar a pipeta também).

15) Abra a torneira e deixe o líquido escorrer até que a amostra passe da camada de areia (Fig. 7 d) e entre na área branca da coluna (aplique pressão de ar se isso demorar mais de 20 segundos).

16) Enxágue suavemente as laterais da coluna com um movimento giratório usando uma ou duas pipetas cheias de eluente para enxaguar qualquer amostra respingada. Novamente, deixe o líquido escorrer (ou aplique pressão de ar) até que a amostra seja empurrada para dentro do adsorvente branco.

Repita a etapa de enxágue até ter certeza de que toda a amostra foi depositada no adsorvente. Se alguma amostra ainda estiver localizada na camada de areia, ela poderá se dissolver no eluente quando mais solvente for adicionado, levando a uma perda de rendimento. Se o composto for colorido, o enxágue deve ser completamente transparente.

Spoiler: Fig. 8

a e b) Enchimento do reservatório de solvente, c e d) Eluição da coluna

Enchercom eluente e eluir a coluna

17) Delicadamente, adicione mais eluente com uma pipeta (Fig. 8 a), agitando as laterais e, em seguida, quando a camada de areia não for mais perturbada pelas adições, despeje cuidadosamente quantidades maiores (Fig. 8 b) do eluente preparado para encher o reservatório (ou encha com a quantidade necessária). O eluente limpo coletado durante o empacotamento da coluna pode ser reutilizado.

18) Use a pressão do ar para eluir a amostra de forma suave e constante pela coluna (Fig. 8 c e d). Quanto mais vezes a pressão for iniciada e interrompida, maior a probabilidade de a coluna rachar. É melhor se a pressão puder ser mantida suave e constante durante todo o tempo.

A taxa de gotejamento ideal durante a eluição depende do tamanho da coluna. O fluxo ideal de eluente é quando o solvente na seção cilíndrica da coluna acima do adsorvente cai a 5 cm por minuto. Portanto, a taxa de gotejamento deve ser mais lenta em uma coluna estreita em comparação com uma coluna mais larga. A taxa de gotejamento para uma coluna de uma polegada deve ser aquela em que as gotas individuais mal podem ser distinguidas. Um fluxo de líquido saindo pela torneira com esse tamanho de coluna é um pouco rápido demais.

Spoiler: Fig. 9

a-c) Coleta de frações, d) Execução de uma coluna

Coleta de frações

19) Comece imediatamente a coletar o líquido de eluição em tubos de ensaio em um suporte (Fig. 9 a). Consulte a Fig. 1 para obter recomendações sobre os volumes a serem coletados em cada tubo de ensaio.

20) Quando o primeiro tubo de ensaio encher, ou se uma determinada altura de líquido tiver sido coletada conforme recomendado pelo instrutor ou pela Fig. 1, mova o rack para começar a coletar em um tubo diferente (Fig. 9 b e c). Encha e mantenha os tubos em ordem no rack.

Esses tubos diferentes são chamados de "frações". O objetivo de uma coluna é coletar frações pequenas o suficiente para que a maioria (ou algumas) das frações contenha material puro. Se a separação da mistura for difícil (se o ΔRf dos componentes for baixo), talvez seja melhor coletar frações pequenas (por exemplo, tubos preenchidos pela metade).

Spoiler: Fig. 10

a-c) Material de enxágue espirrado na ponta da coluna, d) Alunos operando uma coluna

21) Quando o líquido é drenado da coluna, ele geralmente respinga na parte externa da ponta da coluna e, quando o solvente evapora, você pode ver um anel de material na ponta (você verá um anel de sólido se o componente for sólido, como na Fig. 10 b, ou gotículas oleosas se o componente for líquido). Se os componentes forem coloridos, a ponta da coluna deverá ser enxaguada (Fig. 10 c) quando parecer que um componente foi completamente eluído e antes que o outro componente se aproxime.

22) Observe periodicamente o nível do eluente e reabasteça-o antes que ele caia abaixo da camada de areia.

Spoiler: Fig. 11

a) Eluição, b) Adição de acetato de etila para aumentar a polaridade do solvente, c) Nível do solvente próximo à camada de areia, d) Reabastecimento

Possivelmente aumentar a polaridade do solvente

23) Um eluente pode ser usado em toda a coluna, especialmente se os componentes a serem separados tiverem valores Rf semelhantes. Entretanto, se os componentes tiverem valores de Rf muito diferentes, a polaridade do solvente poderá ser aumentada depois que um componente tiver sido eluído da coluna (Fig. 11 a).

O aumento da polaridade do solvente fará com que os componentes viajem "mais rápido". Primeiro, se um componente já tiver saído da coluna, a coluna já fez seu trabalho de separação, portanto, acelerar o processo não afetará a pureza das frações coletadas. Em segundo lugar, quanto mais tempo for necessário para executar uma coluna, mais amplas serão as faixas de componentes (devido à difusão), e a coleta de uma faixa ampla de material usará (e desperdiçará) muito solvente.

Spoiler: Fig. 12

Contém uma lista parcial da série eluotrópica, uma lista de solventes comuns classificados de acordo com seu "poder solvente" na cromatografia de fase normal. O solvente mais polar causa o aumento mais drástico em Rf

24) Para aumentar a polaridade do solvente, o solvente polar pode ser gotejado diretamente no eluente no reservatório da coluna (Fig. 11 b). Por exemplo, se estiver usando uma mistura de hexanos:acetato de etila, a adição de acetato de etila puro ao eluente atualmente no reservatório aumentaria sua polaridade. Se o nível do eluente estiver baixo, é possível preparar uma solução que contenha uma porcentagem maior do componente mais polar. Por exemplo, se a coluna usou primeiro uma mistura de 4:1 de hexanos e acetato de etila, usar uma mistura de 1:1 seria um solvente mais polar.

25) Elua a coluna com o solvente mais polar como antes e lembre-se sempre de observar o nível do eluente e reabasteça (Fig. 11 d) antes que ele caia abaixo da camada de areia.

26) Para aumentar a polaridade do solvente, o solvente polar pode ser pingado diretamente no eluente no reservatório da coluna (Fig. 11 b). Por exemplo, se estiver usando uma mistura de hexanos e acetato de etila, a adição de acetato de etila puro ao eluente atualmente no reservatório aumentará sua polaridade. Se o nível do eluente estiver baixo, é possível preparar uma solução que contenha uma porcentagem maior do componente mais polar. Por exemplo, se a coluna usou primeiro uma mistura de 4:1 de hexanos e acetato de etila, usar uma mistura de 1:1 seria um solvente mais polar.

27) Elua a coluna com o solvente mais polar como antes e lembre-se sempre de observar o nível do eluente e reabasteça (Fig. 11 d) antes que ele caia abaixo da camada de areia.

Spoiler:Fig . 13

a) Placa de TLC original, b) Frações coletadas pela coluna, c) Frações de manchas em uma placa de TLC, d) Uma placa de TLC visualizada de amostras de cada fração

Localizar e concentrar o componente desejado

28) Para encontrar o componente desejado nas frações do tubo de ensaio, é útil entender a relação entre Rf e a ordem de eluição na cromatografia em coluna.

Na cromatografia em coluna, a amostra é depositada à frente da coluna e eluída para baixo, enquanto na cromatografia em camada fina, a amostra é colocada na parte inferior da placa e eluída para cima. Portanto, uma coluna pode ser considerada como uma placa de TLC invertida. Um composto com um Rf mais alto corre "mais rápido", o que significa que ficará mais alto em uma placa de TLC e será coletado primeiro com uma coluna. Na coluna mostrada nesta seção, o componente com o Rf mais baixo (laranja na placa de TLC na Fig. 13 a) é o segundo componente coletado da coluna.

29) Primeiro, determine quais tubos de ensaio contêm o composto dissolvido.

a) Coloque uma amostra de cada fração em uma placa de TLC rotulada com os números das frações correspondentes à ordem em que foram coletadas (Fig. 13 c). Pode ser melhor espalhar cada amostra 2 a 3 vezes uma sobre a outra, caso as frações estejam diluídas.

b) Se muitas frações tiverem sido coletadas, fazendo com que você hesite em coletar amostras de todas as frações, um método para identificar frações incolores que possam conter composto é procurar um indício de resíduo que conduza os tubos de ensaio. Após a evaporação, um resíduo sólido (Fig. 13) ou gotículas oleosas às vezes são deixados na parte superior do tubo de ensaio, tornando óbvio que essas frações contêm mais do que apenas solvente. Faça uma amostragem de todas as frações próximas aos tubos que contêm resíduos visíveis.

Spoiler: Fig.14 Anel de sólido visto nas bordas do tubo após a evaporação

c) Visualize a placa TLC manchada usando luz UV e/ou um corante para determinar quais frações contêm o composto (Fig. 13 d)

Spoiler: Fig. 15

a) Placas de TLC eluídas de frações contendo o possível composto, b) Combinação de frações, c) Enxágue de um tubo de fração

28) Execute um TLC de todas as frações que contenham o composto, manchando até cinco amostras por placa de TLC de 2,5 cm de largura. Placas de TLC mais largas podem ser usadas para essa finalidade, se disponíveis.

29) Identifique o composto com o Rf desejado por comparação com a placa de TLC bruta original. Escolha reter as frações que têm o composto desejado na forma pura, conforme evidenciado pela placa de TLC eluída. Por exemplo, se o composto com o Rf mais alto for desejado na Fig. 15 a, as frações 6-10 devem ser mantidas.

30) Combine as frações puras em um frasco de fundo redondo de tamanho adequado (não mais do que a metade, Fig. 15 b). Enxágue cada tubo de ensaio com uma pequena quantidade de eluente (ou outro solvente se a solubilidade for um problema) e adicione o enxágue ao frasco de fundo redondo (Fig. 15 c).

31) Evapore o solvente no evaporador rotativo para deixar o composto purificado no frasco.

Spoiler: Fig. 16

a) Usar a pressão do ar para secar a coluna, b) Permitir que a coluna seque de cabeça para baixo, c) Coletar a sílica residual

Limpeza da coluna

32) Para secar a coluna, aplique pressão de ar para drenar a maior parte do eluente da coluna para um recipiente de resíduos. Em seguida, seque mais a coluna usando um destes métodos.

a) Deixe conectado um fluxo suave de ar passando pela coluna para secá-la ainda mais enquanto você limpa outras coisas (Fig. 16 a).

b) Prenda a coluna de cabeça para baixo sobre um copo grande de resíduos na capela de exaustão, de modo que o adsorvente caia quando secar (Fig. 16 b). Isso levará muito tempo (até o próximo período de aula), mas é uma opção.

33) Quando estiver seco, o adsorvente pode ser despejado da coluna em um recipiente de lixo na capela (Fig. 16 c).

Observação de segurança: Os adsorventes em pó são irritantes para os pulmões e seu perigo é exacerbado se a coluna contiver compostos residuais que possam entrar em seus pulmões. O derramamento de sílica ou alumina em pó deve sempre ser feito na capela de exaustão.

34) Quando a maior parte do adsorvente tiver sido coletada em um recipiente de resíduos, use água para enxaguar qualquer sólido residual na pia e, em seguida, enxágue a coluna com acetona em um béquer de resíduos. Além disso, limpe a coluna com água e sabão e seque-a com as partes da torneira separadas.

Solução de problemas

Bolhas de ar são vistas na coluna

Uma bolha de ar é uma bolsa vazia onde não ocorre o equilíbrio entre a fase estacionária e a fase móvel, de modo que os componentes se movem mais rapidamente do que deveriam em torno de uma bolha de ar. Isso pode levar a bandas de eluição desiguais, o que pode causar sobreposição se a separação da mistura for difícil (se os componentes tiverem valores de Rf muito próximos, como na Fig. 17).

Spoiler: Fig. 17 Efeito de uma bolha de ar na separação em uma coluna

Se forem observadas bolhas de ar na coluna e a areia ou a amostra ainda não tiver sido aplicada, dê uma boa sacudida na coluna durante o empacotamento para remover todas as bolhas de ar. Consulte o instrutor se as bolhas não saírem do lugar, pois você pode estar abordando a tarefa com muita delicadeza. Se a areia ou a amostra já tiver sido aplicada, é melhor deixar a coluna como está e esperar que as bolhas de ar não afetem a separação.

As bandas estão sendo eluídas de forma desigual

Se os componentes de uma mistura forem coloridos, pode ser óbvio quando as bandas são eluídas de maneira torta. Isso provavelmente se deve ao fato de a coluna ter sido fixada em uma ligeira diagonal. Se a coluna for fixada de forma inclinada, os componentes se deslocarão de forma inclinada (Fig. 18). Isso pode causar problemas de separação se os componentes tiverem um Rf semelhante.

Spoiler: Fig. 18 Efeito de uma coluna torta na separação

Não há como resolver esse problema no meio de uma coluna, mas se os componentes tiverem valores de Rf muito diferentes, as faixas inclinadas podem não ter efeito sobre a separação. No futuro, certifique-se de verificar se a coluna está perfeitamente vertical nas direções de um lado para o outro e da frente para trás.

 

[davlovsky]

Assim, enquanto estivermos eluindo a amostra, a polaridade do eluente decidirá quais moléculas da amostra serão absorvidas pelo eluente e coletadas na série de tubos de ensaio. Mas o ponto de corte parece um pouco "impreciso", ou seja, a diferença de RF entre um tubo de ensaio e o seguinte pode ser relativamente pequena e, se você ainda não conhece o valor de RF associado à combinação amostra-eluente, como saberá quais tubos de ensaio contêm o quê?

Nos vídeos que vi, eles começaram com amostras basicamente puras, nas quais realizaram a TLC obtendo os valores de RF, de modo que, à medida que realizavam a cromatografia em coluna, puderam realizar mais TLC em cada tubo de ensaio para descobrir qual tubo de ensaio continha o quê, mas, novamente, se você não tivesse alguma referência de valor de RF, como procederia?

Esses valores de RF estão listados na literatura? Por exemplo, na síntese de LSD, eles fornecem a composição do eluente (mistura 3:1 C6H6/CHCl3), mas nenhum valor de RF associado a essa combinação LSD-eluente. Será que eles já sabem (por tentativa e erro ou por cálculos mais avançados) que a mistura 3:1 C6H6/CHCl3 resultará em um valor de RF de 0,35 para uma amostra de LSD freebase?

 

[Sue]

Para lisergídeos, eles geralmente usam uma luz UV (luz negra) para ver/acompanhar as bandas e gotas que saem da coluna...