As tecnologias genéticas, que surgiram na vida humana no final do século passado, mudaram nosso mundo a tal ponto que já é inimaginável sem elas. Essas tecnologias também conseguiram penetrar na área forense; há décadas a identificação genética tem sido usada como um método rápido e relativamente barato que permite encontrar criminosos e solucionar seus atos sem sair do laboratório. Como farmacologista por formação, tenho muito interesse em genética e estou ansioso para estudar esse campo em seus vários aspectos. Nesta publicação, apresentarei a você as abordagens genéticas clássicas no campo da ciência forense.
Um pouco de história ou o que isso tem a ver com cavaleiros?
Há 150 anos, Johannes Friedrich Miescher descobriu os ácidos nucleicos, um conceito que acabou virando o mundo de cabeça para baixo [1]. Em meados do século XX, ficou claro que o DNA e o RNA eram portadores de informações hereditárias; em seguida, sua estrutura foi descrita e, um pouco mais tarde, surgiram vários métodos que permitiram que essas moléculas fossem "cortadas" in vitro usando enzimas celulares - restrictases [2]; amplificá-las usando PCR [3]; e até mesmo ler a sequência de genes e genomas específicos usando vários métodos de sequenciamento [4].
Inicialmente, o trabalho com material genético era realizado literalmente "na cozinha" e nem sempre podia ser reproduzido, mesmo no laboratório científico vizinho. Mas o tempo passou, as abordagens mudaram e os métodos foram padronizados a tal ponto que foram gradualmente introduzidos na pesquisa aplicada e até mesmo na produção biotecnológica.
Em 1984, a comunidade científica foi agitada pela notícia de que os cientistas conseguiram isolar e ler um fragmento de DNA da zebra Burchell, que está extinta e sobrevive apenas em coleções de museus [5]. Um ano depois, o geneticista sueco Svante Pääbo confirmou a possibilidade de usar material arqueológico e de museu para pesquisas científicas fundamentais, tendo analisado pela primeira vez o material genético de múmias egípcias. Anos mais tarde, descobriu-se que as amostras que ele analisou estavam contaminadas com material genético moderno [6], mas o desenvolvimento de métodos de sequenciamento ainda tornou possível trabalhar até mesmo com quantidades mínimas de DNA mal preservado.
Os cientistas forenses também se interessaram pelas novas técnicas de análise de material genético. O fato é que os métodos de dactiloscopia clássica e de análise de grupos sanguíneos, que eram comuns na época, tinham suas limitações e, em alguns casos, falhavam.
Em 1984, o cientista britânico Sir Alec John Jeffreys (Figura 3) desenvolveu e apresentou um método de identificação de uma pessoa usando seu material genético. Mais tarde, essa abordagem foi chamada de identificação por DNA, conquistando o amor e o respeito de criminologistas de todo o mundo. Jeffreys recebeu o título de cavaleiro por seu trabalho.
Um pouco de história ou o que isso tem a ver com cavaleiros?
Há 150 anos, Johannes Friedrich Miescher descobriu os ácidos nucleicos, um conceito que acabou virando o mundo de cabeça para baixo [1]. Em meados do século XX, ficou claro que o DNA e o RNA eram portadores de informações hereditárias; em seguida, sua estrutura foi descrita e, um pouco mais tarde, surgiram vários métodos que permitiram que essas moléculas fossem "cortadas" in vitro usando enzimas celulares - restrictases [2]; amplificá-las usando PCR [3]; e até mesmo ler a sequência de genes e genomas específicos usando vários métodos de sequenciamento [4].
Inicialmente, o trabalho com material genético era realizado literalmente "na cozinha" e nem sempre podia ser reproduzido, mesmo no laboratório científico vizinho. Mas o tempo passou, as abordagens mudaram e os métodos foram padronizados a tal ponto que foram gradualmente introduzidos na pesquisa aplicada e até mesmo na produção biotecnológica.
Em 1984, a comunidade científica foi agitada pela notícia de que os cientistas conseguiram isolar e ler um fragmento de DNA da zebra Burchell, que está extinta e sobrevive apenas em coleções de museus [5]. Um ano depois, o geneticista sueco Svante Pääbo confirmou a possibilidade de usar material arqueológico e de museu para pesquisas científicas fundamentais, tendo analisado pela primeira vez o material genético de múmias egípcias. Anos mais tarde, descobriu-se que as amostras que ele analisou estavam contaminadas com material genético moderno [6], mas o desenvolvimento de métodos de sequenciamento ainda tornou possível trabalhar até mesmo com quantidades mínimas de DNA mal preservado.
Os cientistas forenses também se interessaram pelas novas técnicas de análise de material genético. O fato é que os métodos de dactiloscopia clássica e de análise de grupos sanguíneos, que eram comuns na época, tinham suas limitações e, em alguns casos, falhavam.
Em 1984, o cientista britânico Sir Alec John Jeffreys (Figura 3) desenvolveu e apresentou um método de identificação de uma pessoa usando seu material genético. Mais tarde, essa abordagem foi chamada de identificação por DNA, conquistando o amor e o respeito de criminologistas de todo o mundo. Jeffreys recebeu o título de cavaleiro por seu trabalho.
Dactiloscopia de DNA: vantagens e desvantagens
A análise genética de amostras biológicas obtidas em cenas de crime simplificou muito o trabalho dos investigadores. Eles agora têm uma ferramenta confiável para identificar o perpetrador ou a vítima, obter provas incontestáveis e solucionar crimes.
As principais vantagens da impressão digital genética são a capacidade de trabalhar mesmo com pequenas quantidades de material biológico e a alta precisão que permite a identificação de um indivíduo - se todos os requisitos para a análise forem atendidos, sua confiabilidade ultrapassa 99%. Essa abordagem tornou-se uma das mais importantes na investigação de crimes [7].
É importante observar que os métodos clássicos de dactiloscopia de DNA não permitem a identificação de gêmeos idênticos cujo perfil genético seja o mesmo, uma vez que eles são formados a partir do mesmo óvulo fertilizado.
Para a análise de DNA, em primeiro lugar, é necessário o próprio DnA, mas nem sempre é possível extrair material genético de alta qualidade de amostras biológicas que foram expostas a fatores químicos e térmicos. Uma vez no ambiente, essa molécula entra em reações químicas, é destruída (fragmentada) e modificada, embora em condições favoráveis possa persistir por milhares de anos [8].
Sabe-se que o material genético mais antigo dos ancestrais humanos foi extraído dos restos ósseos de nossos parentes humanoides que viveram no território da Península Ibérica (Sierra de Atapuerca) há cerca de 430 mil anos [9]. O microclima específico de algumas cavernas, com baixos valores de umidade e temperatura, aumenta significativamente a vida útil do material genético. No entanto, o DNA nas amostras encontradas na cena do crime geralmente é representado em quantidades mínimas e, como nas amostras arqueológicas, está gravemente degradado.
Na Europa e nos Estados Unidos, chama-se a atenção para outra desvantagem da impressão digital genética, relacionada à interferência na privacidade de uma pessoa e à violação da privacidade.
Os ativistas de direitos humanos temem que as informações genéticas de criminosos e suspeitos de crimes possam cair nas mãos de terceiros e ser usadas indevidamente [10]. Por exemplo, já existem casos conhecidos de uso de informações genéticas para controlar minorias muçulmanas na província chinesa de Xinjiang.
Os EUA também estão planejando coletar sistematicamente perfis de DNA de imigrantes sob custódia federal [11]. Obviamente, os temores dos ativistas de direitos humanos não são infundados e têm fundamentos reais.
As principais vantagens da impressão digital genética são a capacidade de trabalhar mesmo com pequenas quantidades de material biológico e a alta precisão que permite a identificação de um indivíduo - se todos os requisitos para a análise forem atendidos, sua confiabilidade ultrapassa 99%. Essa abordagem tornou-se uma das mais importantes na investigação de crimes [7].
É importante observar que os métodos clássicos de dactiloscopia de DNA não permitem a identificação de gêmeos idênticos cujo perfil genético seja o mesmo, uma vez que eles são formados a partir do mesmo óvulo fertilizado.
Para a análise de DNA, em primeiro lugar, é necessário o próprio DnA, mas nem sempre é possível extrair material genético de alta qualidade de amostras biológicas que foram expostas a fatores químicos e térmicos. Uma vez no ambiente, essa molécula entra em reações químicas, é destruída (fragmentada) e modificada, embora em condições favoráveis possa persistir por milhares de anos [8].
Sabe-se que o material genético mais antigo dos ancestrais humanos foi extraído dos restos ósseos de nossos parentes humanoides que viveram no território da Península Ibérica (Sierra de Atapuerca) há cerca de 430 mil anos [9]. O microclima específico de algumas cavernas, com baixos valores de umidade e temperatura, aumenta significativamente a vida útil do material genético. No entanto, o DNA nas amostras encontradas na cena do crime geralmente é representado em quantidades mínimas e, como nas amostras arqueológicas, está gravemente degradado.
Na Europa e nos Estados Unidos, chama-se a atenção para outra desvantagem da impressão digital genética, relacionada à interferência na privacidade de uma pessoa e à violação da privacidade.
Os ativistas de direitos humanos temem que as informações genéticas de criminosos e suspeitos de crimes possam cair nas mãos de terceiros e ser usadas indevidamente [10]. Por exemplo, já existem casos conhecidos de uso de informações genéticas para controlar minorias muçulmanas na província chinesa de Xinjiang.
Os EUA também estão planejando coletar sistematicamente perfis de DNA de imigrantes sob custódia federal [11]. Obviamente, os temores dos ativistas de direitos humanos não são infundados e têm fundamentos reais.
Como funciona
Os métodos de dactiloscopia de DNA são baseados na variabilidade genética humana. As substituições de nucleotídeos no DNA (dependendo da frequência na população, elas também são chamadas de polimorfismos ou mutações do DNA) nos tornam individualmente diferentes. E essas diferenças podem ser encontradas nos genomas nuclear e mitocondrial, pequenas moléculas circulares de DNA que regulam o funcionamento das mitocôndrias, as "fábricas" de energia das células.
Deve-se observar que os polimorfismos de DNA podem ser encontrados no genoma de cada um de nós - eles se tornam nosso código de barras de DNA exclusivo. Alguns deles podem causar doenças graves [12], mas, na maioria dos casos, não têm efeito sobre nossas funções vitais.
Os métodos modernos de dactiloscopia de DNA usam uma variedade de variantes genéticas em diferentes regiões do genoma. Por exemplo, a análise de repetições em tandem - sequências genômicas curtas e repetitivas cujo número difere em dois indivíduos amostrados aleatoriamente [13] - permite um teste de paternidade claro ou a descoberta de evidências adicionais contra um suspeito de crime.
Os marcadores de DNA do cromossomo Y podem ser usados para determinar o sexo de uma pessoa. Os marcadores genéticos fornecem informações sobre a etnia dos parentes de um indivíduo, a cor dos olhos ou dos cabelos.
Além disso, as informações epigenéticas (por exemplo, metilação do DNA) permitem estimar a idade biológica de células individuais, tecidos e do organismo como um todo [14]. Neste artigo, falarei mais sobre os métodos de análise genética mencionados acima. E o uso de métodos epigenéticos no negócio de medicamentos será o tema de minha próxima publicação.
Os marcadores de DNA do cromossomo Y podem ser usados para determinar o sexo de uma pessoa. Os marcadores genéticos fornecem informações sobre a etnia dos parentes de um indivíduo, a cor dos olhos ou dos cabelos.
Além disso, as informações epigenéticas (por exemplo, metilação do DNA) permitem estimar a idade biológica de células individuais, tecidos e do organismo como um todo [14]. Neste artigo, falarei mais sobre os métodos de análise genética mencionados acima. E o uso de métodos epigenéticos no negócio de medicamentos será o tema de minha próxima publicação.
Coleta e isolamento de DNA de material biológico
A extração e a análise de DNA de amostras forenses são, à primeira vista, comparáveis à arte. Às vezes, é impossível imaginar que algumas gotas de sangue ou um pedaço de pele sob as unhas de uma vítima possam se tornar a evidência mais importante em uma investigação criminal.
De fato, as ações dos especialistas forenses na cena do crime são bem ajustadas e seguem um único cenário, sendo que um dos principais objetivos é encontrar material biológico adequado para a extração de DNA. Qualquer tecido biológico e secreções humanas podem ser usados para essa finalidade .
- Restos ósseos
- Dentes
- Folículos capilares
- Sangue
- Células epiteliais
- Suor
- Saliva
- Amostras de esperma
- Excrementos, etc.
O biomaterial no depósito de provas pode durar décadas. Muitas vezes, o examinador pega apenas uma parte do material para exame, o quanto for necessário para a extração do DNA. Por exemplo, se houver vestígios de sangue na faca, o perito não lava todo o sangue, mas faz um pequeno enxágue logo antes da extração do DNA. Isso deixa rastros na faca, que podem ser usados para realizar um reexame várias décadas depois.
No núcleo da célula, o DNA está em contato próximo com várias moléculas orgânicas necessárias para seu funcionamento eficaz. No entanto, para a análise genética, os carboidratos, lipídios e proteínas devem ser removidos da amostra de teste, o que pode reduzir a eficiência dos métodos utilizados e, consequentemente, afetar a solvência dos crimes.A extração de DNA leva pouco tempo graças a uma variedade de kits e sistemas comerciais projetados especificamente para a extração de ácidos nucleicos (por exemplo, o AutoMate Express DNA Extraction System da Thermo Fisher Scientific). Além disso, em grandes centros forenses com milhares de análises por dia, esse processo é totalmente automatizado e realizado com a participação de robôs sob a supervisão de um operador.
A propósito, os sistemas robóticos são amplamente utilizados não apenas em laboratórios forenses, mas também em muitos centros médicos e de biotecnologia, permitindo acelerar o processo, reduzir o custo do trabalho e diminuir significativamente a chance de erro.
Após a extração, o DNA é dissolvido em um composto especial, onde pode ser armazenado por anos (a -20°C ou -80°C), se necessário.
Análise genética
Imediatamente após a extração do DnA, um especialista se depara com a questão de outras formas de analisá-lo. Desde a introdução da identificação de DNA na ciência forense, as técnicas de biologia molecular mudaram tanto que há diversas variantes possíveis. Nossa próxima história destacará as várias técnicas de análise de DNA que os especialistas forenses usam em sua prática.
Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (análise RFLP)
Historicamente, a análise de RFLP é um dos primeiros métodos de identificação de DNA. Ela se baseia no uso de enzimas celulares especiais, as restrictases. As enzimas de restrição podem reconhecer determinados locais em uma molécula de ácido nucleico e cortá-la através desses locais. Vários milhares dessas enzimas foram descritas até o momento. Após cortar a molécula de DnA com enzimas de restrição, os comprimentos dos fragmentos obtidos são avaliados por meio de eletroforese em gel (Figura 9).
Imediatamente após a extração do DnA, um especialista se depara com a questão de outras formas de analisá-lo. Desde a introdução da identificação de DNA na ciência forense, as técnicas de biologia molecular mudaram tanto que há diversas variantes possíveis. Nossa próxima história destacará as várias técnicas de análise de DNA que os especialistas forenses usam em sua prática.
Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (análise RFLP)
Historicamente, a análise de RFLP é um dos primeiros métodos de identificação de DNA. Ela se baseia no uso de enzimas celulares especiais, as restrictases. As enzimas de restrição podem reconhecer determinados locais em uma molécula de ácido nucleico e cortá-la através desses locais. Vários milhares dessas enzimas foram descritas até o momento. Após cortar a molécula de DnA com enzimas de restrição, os comprimentos dos fragmentos obtidos são avaliados por meio de eletroforese em gel (Figura 9).
Como não há genomas humanos completamente idênticos (exceto para gêmeos idênticos), a diferença ou semelhança nos perfis de comprimento de fragmentos de DNA resultantes pode ser um bom marcador para identificação pessoal e determinação de parentesco.
Entretanto, esse método envolve a fragmentação do DNA e, portanto, é sensível à qualidade e à quantidade do material genético original. É por isso que a análise de RFLP não é usada na prática atualmente, ao contrário de outros métodos que serão discutidos a seguir.
Análise do número de repetições em tandem no genoma
As repetições em tandem são cópias da mesma sequência curta de DnA repetidas uma após a outra [15]. As repetições que são de interesse para os cientistas forenses incluem loci com um número variável de repetições em tandem (VNTR) e repetições curtas em tandem (STR). Eles também são chamados de minissatélites e microssatélites, respectivamente.
A essência desse método é a amplificação por PCR de fragmentos de DNA contendo essas sequências repetitivas curtas cujos comprimentos são diferentes em dois indivíduos amostrados aleatoriamente. Após a amplificação, o comprimento dos fragmentos obtidos é avaliado por meio de eletroforese em gel ou eletroforese capilar.
O Quantifiler DNA Quantification Kit e o sistema QuantStudio da Termo Fisher Scientific podem ser usados para essa finalidade. O QuantStudio é um instrumento compacto de bancada com uma ampla gama de recursos.
Como no método anterior, o principal fator de identificação do ensaio STR é o comprimento dos fragmentos obtidos, que é único para cada indivíduo e depende do número de repetições no local analisado. A análise STR é caracterizada por alta precisão e velocidade, além de baixo custo. A qualidade do material genético é uma condição importante para a análise.
Entretanto, esse método envolve a fragmentação do DNA e, portanto, é sensível à qualidade e à quantidade do material genético original. É por isso que a análise de RFLP não é usada na prática atualmente, ao contrário de outros métodos que serão discutidos a seguir.
Análise do número de repetições em tandem no genoma
As repetições em tandem são cópias da mesma sequência curta de DnA repetidas uma após a outra [15]. As repetições que são de interesse para os cientistas forenses incluem loci com um número variável de repetições em tandem (VNTR) e repetições curtas em tandem (STR). Eles também são chamados de minissatélites e microssatélites, respectivamente.
A essência desse método é a amplificação por PCR de fragmentos de DNA contendo essas sequências repetitivas curtas cujos comprimentos são diferentes em dois indivíduos amostrados aleatoriamente. Após a amplificação, o comprimento dos fragmentos obtidos é avaliado por meio de eletroforese em gel ou eletroforese capilar.
O Quantifiler DNA Quantification Kit e o sistema QuantStudio da Termo Fisher Scientific podem ser usados para essa finalidade. O QuantStudio é um instrumento compacto de bancada com uma ampla gama de recursos.
Como no método anterior, o principal fator de identificação do ensaio STR é o comprimento dos fragmentos obtidos, que é único para cada indivíduo e depende do número de repetições no local analisado. A análise STR é caracterizada por alta precisão e velocidade, além de baixo custo. A qualidade do material genético é uma condição importante para a análise.
A análise de STR surgiu na prática forense há quase vinte anos, mas até hoje continua sendo o principal método de identificação de indivíduos. Os resultados da análise de DNA de suspeitos e criminosos - perfis genéticos - são inseridos pelos criminologistas em bancos de dados especiais.
Portanto, quando são encontrados vestígios biológicos em cenas de crime dos quais o DNA pode ser isolado, torna-se possível identificar todas as pessoas que já chamaram a atenção dos órgãos policiais. Os mesmos marcadores são usados na busca de pessoas desaparecidas e para estabelecer a paternidade.
Portanto, quando são encontrados vestígios biológicos em cenas de crime dos quais o DNA pode ser isolado, torna-se possível identificar todas as pessoas que já chamaram a atenção dos órgãos policiais. Os mesmos marcadores são usados na busca de pessoas desaparecidas e para estabelecer a paternidade.
Em geral, os sistemas projetados para identificar indivíduos permitem a análise de vários loci do genoma (10-24) de uma só vez, incluindo o gene da proteína amelogenina, pelo qual o sexo é determinado. O gene da amelogenina é encontrado tanto no cromossomo X quanto no Y, mas difere em tamanho, o que permite a determinação do sexo de uma pessoa.
Graças ao uso de tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, a ciência forense obteve uma ferramenta eficaz que abriu novas oportunidades para a análise simultânea de vários locais (loci) dos genomas nuclear e mitocondrial.
Uma vantagem importante desses métodos é a capacidade de distinguir até mesmo gêmeos idênticos (por mutações somáticas), o que é impossível com a análise de RFLP ou STR.
Graças ao uso de tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, a ciência forense obteve uma ferramenta eficaz que abriu novas oportunidades para a análise simultânea de vários locais (loci) dos genomas nuclear e mitocondrial.
Uma vantagem importante desses métodos é a capacidade de distinguir até mesmo gêmeos idênticos (por mutações somáticas), o que é impossível com a análise de RFLP ou STR.
A segunda parte desta publicação descreverá como os métodos descritos acima podem ser usados para identificar laboratórios de drogas e traficantes de drogas, e como você pode confundir a perícia limpando seus rastros.
Leia a PARTE II
