Resumo.
A realização de um estudo dos efeitos pró-inflamatórios da mefedrona e a identificação de suas características etológicas são uma etapa obrigatória na pesquisa do 4-MMC, que é considerado uma das substâncias psicoativas mais populares em termos de uso recreativo. A administração, o transporte e a concentração da mefedrona em seus tecidos-alvo dependem não apenas da dose administrada, mas também de vários outros fatores: a distribuição da substância, o grau e a velocidade de absorção, o caminho do metabolismo e da excreção. Ao longo do estudo, é importante determinar a proporção da substância distribuída nos tecidos-alvo ou nos fluidos biológicos com os quais é transportada, para que se possa descobrir qual parte da substância administrada sofre biotransformação e qual parte entra inalterada na circulação sanguínea sistêmica. Além disso, na fase de testes pré-clínicos, além de estudar os principais mecanismos de ação, é preciso fazer uma ampla triagem fenotípica, necessária para uma compreensão aprofundada da farmacodinâmica e dos efeitos colaterais da substância. Um dos aspectos importantes dessa triagem é o estudo das propriedades psicoativas da substância.
Objetivos do estudo.
1. Determinar padrões cognitivos, motivacionais e comportamentais em ratos que receberam 4-metilmetacatinona.
2. Estudar a função endotelial por meio da realização de testes farmacológicos vasculares usando o bloqueio da síntese de NO sob o controle de ultrassom da velocidade do fluxo sanguíneo na artéria femoral de ratos e monitoramento por fluxometria Doppler a laser da hemodinâmica geral e da velocidade da microcirculação no músculo medial.
3. Identificar e avaliar as atividades pró-inflamatórias e imunorregulatórias da 4-metilmetacinona usando o modelo de edema de pata induzido por formalina e o teste NBT.
Materiais e métodos.
O estudo foi realizado com 40 ratos Wistar machos pesando de 180 a 200 g. Foram identificados quatro grupos: 1) Grupo de controle (ratos intactos); 2) Ratos aos quais foi administrada mefedrona por via intraperitoneal a cada 48 horas na dose de 5 mg/kg dissolvida em solução de NaCl 0,9 (0,5 ml). 3) Ratos que receberam mefedrona por via oral (através de um tubo) a cada 48 horas em uma dose de 5 mg/kg dissolvida em solução de NaCl 0,9 (0,5 ml). 4) Ratos aos quais foi administrada mefedrona por via intraperitoneal a cada 48 horas em uma dose de 5 mg/kg dissolvida em solução de NaCl 0,9 (0,5 ml) antes da administração de formalina para o modelo de edema de pata induzido por formalina.
Descrição e discussão do estudo.
Determinação dos padrões cognitivos, motivacionais e comportamentais em ratos que receberam 4-metilmetacatinona. Para atingir essa meta, foram formulados os seguintes objetivos: avaliar a influência da 4-metilmetcatinona no nível de excitação, ansiedade e resistência ao estresse em ratos. Para determinar o estado psicoemocional dos animais estudados, usamos um protocolo de teste de Hall atualizado, que envolve a colocação de um objeto em uma arena padronizada e o registro de indicadores de atividade usando o complexo de software e hardware PANLAB Harvard Apparatus. Atos comportamentais discretos registrados usando o complexo de software e hardware foram selecionados como unidades de avaliação.
O estudo foi realizado com 30 ratos (Grupos 1, 2 e 3, respectivamente). Antes do experimento, os animais foram mantidos em um viveiro de laboratório com 10 indivíduos em uma gaiola, com um regime de 12 horas não convertido, a uma temperatura ambiente de 22-24 °C e umidade de 60%, com uma dieta padrão. Os experimentos foram realizados no verão. Os resultados obtidos foram verificados quanto à normalidade da distribuição usando o critério de Shapiro-Wilk e processados por métodos de estatística variacional usando o teste t de Student e o pacote de software STATISTICA. A figura mostra esquematicamente o desenho do experimento. A atividade horizontal, a reação de grooming, a atividade de busca, a atividade locomotora, a micção e a defecação foram registradas para avaliar o comportamento exploratório. O experimento foi realizado em uma sala escura, isolada de ruídos externos e da luz solar, no período de 10 a 14 horas. O campo aberto era uma área quadrada de 150x150 cm de tamanho com lados de 30 cm de altura. A temperatura da sala foi mantida em 23 graus Celsius. Depois de cada animal, o campo aberto era higienizado para desodorização. Antes do estudo de cada grupo, um animal zero foi solto no campo aberto.
No dia 21, os ratos foram retirados do experimento. Após a anestesia dos ratos, o isolamento da artéria carótida direita foi realizado em uma plataforma fixa, o músculo medial da coxa foi exposto e a veia femoral esquerda foi cateterizada. O estudo multicomponente dos parâmetros hemodinâmicos foi investigado pelo método de testes de provocação especializados envolvendo a administração de acetilcolina e nitroprussiato de sódio (NO) no cateter femoral. Os parâmetros (pressão arterial sistólica, pressão arterial diastólica, frequência cardíaca) foram registrados usando um sensor TDS. O sensor foi instalado sobre o terço médio da artéria femoral direita e os seguintes indicadores foram registrados: velocidade máxima sistólica (VS) e diastólica (VD), velocidade média (QAs) e volumétrica (QAM) do fluxo sanguíneo, índice de pulsação (PL, índice de Gosling) e índice de resistividade (RI, índice de Pourcelot). Para medir a velocidade das células sanguíneas nos vasos do leito microcirculatório, foi usado um sensor de sonda em forma de agulha, que foi colocado no terço inferior do músculo vasto medial da coxa. Agentes vasoativos (acetilcolina - 40 mcg/kg, nitroprussiato de sódio - 30 mcg/kg) foram injetados por meio de um cateter inserido na veia femoral esquerda sequencialmente em intervalos de 15 minutos. Assim, houve a possibilidade de monitoramento paralelo dos parâmetros hemodinâmicos e de microcirculação em um sistema de três níveis (circulação central - sistema vascular elástico - sistema vascular periférico). O processamento estatístico dos resultados foi realizado usando o software STATISTICA 10. Em seguida, foi calculado o coeficiente de disfunção endotelial (QED). A análise estatística foi realizada usando o teste de classificação de Spearman, o cálculo da confiabilidade entre os grupos foi realizado usando o teste t paramétrico de Student.
Os diagramas apresentados mostram que a influência da mefedrona no comportamento animal corresponde aos seus principais efeitos, associados ao seu mecanismo de ação conhecido. Assim, o diagrama 1 ilustra um aumento significativo na atividade motora horizontal em comparação com o grupo de controle. O diagrama 2 mostra que os atos de grooming são significativamente reduzidos. Esse fenômeno é causado por uma diminuição da influência motivacional em relação à necessidade atual. O Diagrama 3 visualiza claramente um aumento nos atos de defecação e micção, que é um dos efeitos frequentes da ingestão de 4-mmc. Um aumento na atividade horizontal pode indicar efeitos ansiolíticos, ansiogênicos, de agitação ou um aumento na atividade motora sem um componente emocional (excitação motora). As reações de grooming também podem ser interpretadas de forma ambígua, pois a frequência dos atos de grooming aumenta tanto em um ambiente estressante quanto em um ambiente favorável. As manifestações de atividade exploratória, bem como a frequência de micções e defecações, podem ser interpretadas de forma mais inequívoca. Usando esse algoritmo, pode-se concluir que o efeito farmacodinâmico em relação à maior atividade nervosa pode ser interpretado como excitação motora com um componente emocional.
O grupo de controle demonstrou o mesmo tipo de resposta à introdução de ACH e NO, que se manifestou como uma queda na pressão arterial sistólica, diastólica e média, uma diminuição na velocidade linear da microcirculação, bem como a velocidade diastólica do movimento do sangue na artéria femoral (doravante FA), (indicadores de dados - Vd, Vad); 2) um aumento na velocidade sistólica do movimento do sangue na FA (VS, Vas), os índices de Purcello e Gosling. Os parâmetros retornaram aos seus valores originais em 2 minutos.
Foi realizado um processamento estatístico adicional ao determinar um número de valores ao longo do tempo para cada amostra, que foram expressos como uma porcentagem. O critério de Spearman, que foi usado para análise estatística, mostrou a melhor expressão da diferença necessária em parâmetros estatisticamente importantes. O maior grau de correlação (p<0,05) foi determinado entre o índice de pressão arterial média (doravante denominado MAD), a velocidade linear da microcirculação, a velocidade sistólica e a diferença de velocidade sistólica-diastólica na artéria femoral. Outros parâmetros ultrassonográficos demonstraram uma correlação baixa e menos confiável com a dinâmica da pressão arterial e a taxa de microcirculação. O estudo da 4-mmc administrada por via oral revelou um aumento estatisticamente significativo nos indicadores de SAD, DAD e o coeficiente de disfunção endotelial (QED) em comparação com o grupo de controle. Os indicadores de velocidade sistólica máxima (VS) e velocidade diastólica máxima (VD) foram significativamente reduzidos durante os testes de provocação em ratos do Grupo 3, nos quais a mefedrona foi administrada por via oral.
A eficácia dos fatores de relaxamento dependentes do endotélio liberados e ativados pela administração de acetilcolina é quantitativa e qualitativamente reduzida. O efeito mediado pelo NO em resposta ao teste de provocação com ACH diminui, devido ao efeito negativo do 4-mmc na produção e expressão desse fator e na atividade da guanilato ciclase. O relaxamento dependente do endotélio induzido pela ACH dos vasos microcirculatórios, mediado por receptores muscarínicos, também é interrompido devido à degeneração da atividade do receptor e também devido a uma diminuição na densidade de receptores na superfície dos endoteliócitos. É provável que o mecanismo de redução da reação dependente do endotélio mediada por ACH em resposta ao uso de mefedrona seja causado por um aumento significativo na formação de radicais livres (superóxido e hidroxila) no estado hipóxico da célula, que interagem com NO2 e NO3.
Houve uma redução estatisticamente significativa na atividade metabólica dos neutrófilos em 38,4% (Me = 13,1 com um intervalo interquartil de 10,3 a 15,9 com uma diferença de 5,3 em p=0,002; z = 3,008) em comparação com os indicadores do grupo de controle. No estudo da capacidade de absorção de fagocitose com a adição de látex, os indicadores aumentaram de 13,1 Me para 16,5 Me, com um aumento percentual de 18,2% para o Grupo 3 (administração intraperitoneal), no entanto, a diferença percentual em comparação com o grupo de controle é de 18,0%, o que é uma evidência significativa e estatisticamente confiável de ação imunossupressora. Além disso, foi constatada uma diminuição estatisticamente significativa na fagocitose espontânea no Grupo 3, que foi reduzida em 25,3% (p>0,0001, z=2,84) em comparação com os animais intactos.
A realização de um estudo dos efeitos pró-inflamatórios da mefedrona e a identificação de suas características etológicas são uma etapa obrigatória na pesquisa do 4-MMC, que é considerado uma das substâncias psicoativas mais populares em termos de uso recreativo. A administração, o transporte e a concentração da mefedrona em seus tecidos-alvo dependem não apenas da dose administrada, mas também de vários outros fatores: a distribuição da substância, o grau e a velocidade de absorção, o caminho do metabolismo e da excreção. Ao longo do estudo, é importante determinar a proporção da substância distribuída nos tecidos-alvo ou nos fluidos biológicos com os quais é transportada, para que se possa descobrir qual parte da substância administrada sofre biotransformação e qual parte entra inalterada na circulação sanguínea sistêmica. Além disso, na fase de testes pré-clínicos, além de estudar os principais mecanismos de ação, é preciso fazer uma ampla triagem fenotípica, necessária para uma compreensão aprofundada da farmacodinâmica e dos efeitos colaterais da substância. Um dos aspectos importantes dessa triagem é o estudo das propriedades psicoativas da substância.
Objetivos do estudo.
1. Determinar padrões cognitivos, motivacionais e comportamentais em ratos que receberam 4-metilmetacatinona.
2. Estudar a função endotelial por meio da realização de testes farmacológicos vasculares usando o bloqueio da síntese de NO sob o controle de ultrassom da velocidade do fluxo sanguíneo na artéria femoral de ratos e monitoramento por fluxometria Doppler a laser da hemodinâmica geral e da velocidade da microcirculação no músculo medial.
3. Identificar e avaliar as atividades pró-inflamatórias e imunorregulatórias da 4-metilmetacinona usando o modelo de edema de pata induzido por formalina e o teste NBT.
Materiais e métodos.
O estudo foi realizado com 40 ratos Wistar machos pesando de 180 a 200 g. Foram identificados quatro grupos: 1) Grupo de controle (ratos intactos); 2) Ratos aos quais foi administrada mefedrona por via intraperitoneal a cada 48 horas na dose de 5 mg/kg dissolvida em solução de NaCl 0,9 (0,5 ml). 3) Ratos que receberam mefedrona por via oral (através de um tubo) a cada 48 horas em uma dose de 5 mg/kg dissolvida em solução de NaCl 0,9 (0,5 ml). 4) Ratos aos quais foi administrada mefedrona por via intraperitoneal a cada 48 horas em uma dose de 5 mg/kg dissolvida em solução de NaCl 0,9 (0,5 ml) antes da administração de formalina para o modelo de edema de pata induzido por formalina.
Descrição e discussão do estudo.
Determinação dos padrões cognitivos, motivacionais e comportamentais em ratos que receberam 4-metilmetacatinona. Para atingir essa meta, foram formulados os seguintes objetivos: avaliar a influência da 4-metilmetcatinona no nível de excitação, ansiedade e resistência ao estresse em ratos. Para determinar o estado psicoemocional dos animais estudados, usamos um protocolo de teste de Hall atualizado, que envolve a colocação de um objeto em uma arena padronizada e o registro de indicadores de atividade usando o complexo de software e hardware PANLAB Harvard Apparatus. Atos comportamentais discretos registrados usando o complexo de software e hardware foram selecionados como unidades de avaliação.
O estudo foi realizado com 30 ratos (Grupos 1, 2 e 3, respectivamente). Antes do experimento, os animais foram mantidos em um viveiro de laboratório com 10 indivíduos em uma gaiola, com um regime de 12 horas não convertido, a uma temperatura ambiente de 22-24 °C e umidade de 60%, com uma dieta padrão. Os experimentos foram realizados no verão. Os resultados obtidos foram verificados quanto à normalidade da distribuição usando o critério de Shapiro-Wilk e processados por métodos de estatística variacional usando o teste t de Student e o pacote de software STATISTICA. A figura mostra esquematicamente o desenho do experimento. A atividade horizontal, a reação de grooming, a atividade de busca, a atividade locomotora, a micção e a defecação foram registradas para avaliar o comportamento exploratório. O experimento foi realizado em uma sala escura, isolada de ruídos externos e da luz solar, no período de 10 a 14 horas. O campo aberto era uma área quadrada de 150x150 cm de tamanho com lados de 30 cm de altura. A temperatura da sala foi mantida em 23 graus Celsius. Depois de cada animal, o campo aberto era higienizado para desodorização. Antes do estudo de cada grupo, um animal zero foi solto no campo aberto.
No dia 21, os ratos foram retirados do experimento. Após a anestesia dos ratos, o isolamento da artéria carótida direita foi realizado em uma plataforma fixa, o músculo medial da coxa foi exposto e a veia femoral esquerda foi cateterizada. O estudo multicomponente dos parâmetros hemodinâmicos foi investigado pelo método de testes de provocação especializados envolvendo a administração de acetilcolina e nitroprussiato de sódio (NO) no cateter femoral. Os parâmetros (pressão arterial sistólica, pressão arterial diastólica, frequência cardíaca) foram registrados usando um sensor TDS. O sensor foi instalado sobre o terço médio da artéria femoral direita e os seguintes indicadores foram registrados: velocidade máxima sistólica (VS) e diastólica (VD), velocidade média (QAs) e volumétrica (QAM) do fluxo sanguíneo, índice de pulsação (PL, índice de Gosling) e índice de resistividade (RI, índice de Pourcelot). Para medir a velocidade das células sanguíneas nos vasos do leito microcirculatório, foi usado um sensor de sonda em forma de agulha, que foi colocado no terço inferior do músculo vasto medial da coxa. Agentes vasoativos (acetilcolina - 40 mcg/kg, nitroprussiato de sódio - 30 mcg/kg) foram injetados por meio de um cateter inserido na veia femoral esquerda sequencialmente em intervalos de 15 minutos. Assim, houve a possibilidade de monitoramento paralelo dos parâmetros hemodinâmicos e de microcirculação em um sistema de três níveis (circulação central - sistema vascular elástico - sistema vascular periférico). O processamento estatístico dos resultados foi realizado usando o software STATISTICA 10. Em seguida, foi calculado o coeficiente de disfunção endotelial (QED). A análise estatística foi realizada usando o teste de classificação de Spearman, o cálculo da confiabilidade entre os grupos foi realizado usando o teste t paramétrico de Student.
Os diagramas apresentados mostram que a influência da mefedrona no comportamento animal corresponde aos seus principais efeitos, associados ao seu mecanismo de ação conhecido. Assim, o diagrama 1 ilustra um aumento significativo na atividade motora horizontal em comparação com o grupo de controle. O diagrama 2 mostra que os atos de grooming são significativamente reduzidos. Esse fenômeno é causado por uma diminuição da influência motivacional em relação à necessidade atual. O Diagrama 3 visualiza claramente um aumento nos atos de defecação e micção, que é um dos efeitos frequentes da ingestão de 4-mmc. Um aumento na atividade horizontal pode indicar efeitos ansiolíticos, ansiogênicos, de agitação ou um aumento na atividade motora sem um componente emocional (excitação motora). As reações de grooming também podem ser interpretadas de forma ambígua, pois a frequência dos atos de grooming aumenta tanto em um ambiente estressante quanto em um ambiente favorável. As manifestações de atividade exploratória, bem como a frequência de micções e defecações, podem ser interpretadas de forma mais inequívoca. Usando esse algoritmo, pode-se concluir que o efeito farmacodinâmico em relação à maior atividade nervosa pode ser interpretado como excitação motora com um componente emocional.
O grupo de controle demonstrou o mesmo tipo de resposta à introdução de ACH e NO, que se manifestou como uma queda na pressão arterial sistólica, diastólica e média, uma diminuição na velocidade linear da microcirculação, bem como a velocidade diastólica do movimento do sangue na artéria femoral (doravante FA), (indicadores de dados - Vd, Vad); 2) um aumento na velocidade sistólica do movimento do sangue na FA (VS, Vas), os índices de Purcello e Gosling. Os parâmetros retornaram aos seus valores originais em 2 minutos.
Foi realizado um processamento estatístico adicional ao determinar um número de valores ao longo do tempo para cada amostra, que foram expressos como uma porcentagem. O critério de Spearman, que foi usado para análise estatística, mostrou a melhor expressão da diferença necessária em parâmetros estatisticamente importantes. O maior grau de correlação (p<0,05) foi determinado entre o índice de pressão arterial média (doravante denominado MAD), a velocidade linear da microcirculação, a velocidade sistólica e a diferença de velocidade sistólica-diastólica na artéria femoral. Outros parâmetros ultrassonográficos demonstraram uma correlação baixa e menos confiável com a dinâmica da pressão arterial e a taxa de microcirculação. O estudo da 4-mmc administrada por via oral revelou um aumento estatisticamente significativo nos indicadores de SAD, DAD e o coeficiente de disfunção endotelial (QED) em comparação com o grupo de controle. Os indicadores de velocidade sistólica máxima (VS) e velocidade diastólica máxima (VD) foram significativamente reduzidos durante os testes de provocação em ratos do Grupo 3, nos quais a mefedrona foi administrada por via oral.
A eficácia dos fatores de relaxamento dependentes do endotélio liberados e ativados pela administração de acetilcolina é quantitativa e qualitativamente reduzida. O efeito mediado pelo NO em resposta ao teste de provocação com ACH diminui, devido ao efeito negativo do 4-mmc na produção e expressão desse fator e na atividade da guanilato ciclase. O relaxamento dependente do endotélio induzido pela ACH dos vasos microcirculatórios, mediado por receptores muscarínicos, também é interrompido devido à degeneração da atividade do receptor e também devido a uma diminuição na densidade de receptores na superfície dos endoteliócitos. É provável que o mecanismo de redução da reação dependente do endotélio mediada por ACH em resposta ao uso de mefedrona seja causado por um aumento significativo na formação de radicais livres (superóxido e hidroxila) no estado hipóxico da célula, que interagem com NO2 e NO3.
Houve uma redução estatisticamente significativa na atividade metabólica dos neutrófilos em 38,4% (Me = 13,1 com um intervalo interquartil de 10,3 a 15,9 com uma diferença de 5,3 em p=0,002; z = 3,008) em comparação com os indicadores do grupo de controle. No estudo da capacidade de absorção de fagocitose com a adição de látex, os indicadores aumentaram de 13,1 Me para 16,5 Me, com um aumento percentual de 18,2% para o Grupo 3 (administração intraperitoneal), no entanto, a diferença percentual em comparação com o grupo de controle é de 18,0%, o que é uma evidência significativa e estatisticamente confiável de ação imunossupressora. Além disso, foi constatada uma diminuição estatisticamente significativa na fagocitose espontânea no Grupo 3, que foi reduzida em 25,3% (p>0,0001, z=2,84) em comparação com os animais intactos.
- Quando a mefedrona foi administrada a animais experimentais, foi registrada uma alteração estatisticamente significativa nos atos comportamentais analisados. Esse fato indica a presença de atividade psicotrópica específica desse composto associada a níveis excessivamente elevados de excitação e ansiedade, porém, com resistência reduzida ao estresse. Assim, os resultados do estudo nessa etapa ampliaram as informações sobre o perfil de ação do composto. Os efeitos psicotrópicos observados do 4-mmc aprofundam a compreensão de sua atividade farmacológica e devem ser objeto de estudos adicionais.
- Os parâmetros persistentemente elevados da pressão arterial nos estados iniciais dos ratos do Grupo 3 (mefedrona), bem como seus indicadores relativos após os testes de provocação, são causados por uma interrupção não apenas na expressão do NO (um dos principais fatores vasodilatadores que regulam o trabalho dos vasos microcirculatórios), mas também das prostaciclinas e dos fatores de hiperpolarização endotelial (EDHF). Os resultados do estudo nessa etapa confirmaram a suposição teórica sobre o efeito negativo excessivo da mefedrona no endotélio dos vasos microcirculatórios e na viabilidade do sistema cardiovascular como um todo. Os dados obtidos podem ser usados no planejamento de estudos pré-clínicos para expandir o espectro de complicações associadas ao uso de 4-mmc, bem como para criar um algoritmo de recomendações clínicas para a correção farmacológica dessas condições complicadas.
- Levando em consideração que a mefedrona provavelmente reduz a permeabilidade de perfusão da parede celular e a função de transporte de proteínas, afeta a difusão passiva e facilitada e o transporte ativo, afeta os padrões cognitivos de certa forma (incluindo fenômenos retardados) e também tem a capacidade de influenciar positivamente o componente de coagulação da hemostasia (hipercoagulação), pode-se presumir que a atividade da COX-2 é predominante como a principal enzima que desempenha um papel na indução da fase alternativa da inflamação. Assim, o uso de inibidores seletivos da COX-2 para o tratamento de doenças inflamatórias em pacientes em uso de 4-mmc é o mais preferível e justificado. Entretanto, para uma definição precisa do tratamento farmacológico destinado a aliviar os processos inflamatórios associados ao uso de 4-mmc, são necessários estudos pré-clínicos adicionais.
- Os resultados da terceira etapa do estudo comprovaram uma diminuição na atividade metabólica e de absorção de neutrófilos em ratos pertencentes ao Grupo 3 (administração intraperitoneal de 4-mmc) em comparação com os indicadores dos animais do grupo de controle. Isso define a mefedrona como uma substância que tem efeito imunossupressor. Essa conclusão é a base para estudos adicionais sobre imunoterapia patogênica corretiva.
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