A mefedrona (4-metilmetcatinona) é uma droga de abuso estimulante β-cetoanfetamina com semelhanças estruturais e mecanicistas com a metanfetamina. Uma das ações mais poderosas associadas à mefedrona é a capacidade de estimular a liberação de dopamina (DA) e bloquear sua recaptação por meio de sua interação com o transportador de dopamina (DAT). Embora a mefedrona não cause toxicidade nas terminações nervosas de DA, sua capacidade de atuar como bloqueador de DAT poderia fornecer proteção contra a neurotoxicidade induzida pela metanfetamina, como outros inibidores de DAT. Para testar essa possibilidade, os camundongos foram tratados com mefedrona (10, 20 ou 40 mg/kg) antes de cada injeção de um regime neurotóxico de metanfetamina (4 injeções de 2,5 ou 5,0 mg/kg em intervalos de 2 horas). A integridade das terminações nervosas DA do estriado foi avaliada por meio de medidas dos níveis de DA, DAT e tirosina hidroxilase. A toxicidade DA moderada a grave associada às diferentes doses de metanfetamina não foi evitada por nenhuma dose de mefedrona, mas foi, de fato, significativamente aumentada. A hipertermia causada pelo tratamento combinado com mefedrona e metanfetamina foi a mesma observada com qualquer uma das drogas isoladamente. A mefedrona também aumentou os efeitos neurotóxicos da anfetamina e do MDMA nas terminações nervosas DA. Em contrapartida, a nomifensina protegeu contra a neurotoxicidade induzida pela metanfetamina. Como a mefedrona aumenta a neurotoxicidade da metanfetamina, os resultados atuais sugerem que ela interage com o DAT de uma maneira diferente da de outros inibidores típicos do DAT. Os efeitos relativamente inócuos da mefedrona isolada nas terminações nervosas DA mascaram uma interação potencialmente perigosa com drogas que são frequentemente usadas em conjunto com ela, levando a uma maior neurotoxicidade.
A mefedrona (4-metilmetcatinona) é um derivado da catinona e análogo estrutural da metanfetamina e da 3,4-metilenodioxi-metanfetamina (MDMA). A mefedrona é um ingrediente psicoativo dos "sais de banho", juntamente com outros compostos, como metilona, butilona e 3,4-metilenodioxipirovalerona (MDPV). As β-cetoanfetaminas estão sendo abusadas em taxas crescentes devido, em grande parte, à disponibilidade altamente restrita dos precursores necessários para a síntese de metanfetamina e MDMA em laboratórios clandestinos e a uma redução correspondente em sua pureza (Winstock et al. 2011b, Brunt et al. 2011). Como o abuso de β-cetoanfetaminas continua a aumentar, a lista de seus efeitos adversos cresceu e inclui complicações cardiovasculares, agitação, insônia, psicose e depressão (Schifano et al. 2011, Prosser e Nelson 2012).
Como congêneres químicos da metanfetamina e do MDMA, não é surpreendente que as β-cetoanfetaminas tenham muitos dos mesmos efeitos que essas drogas anteriores no sistema nervoso central. Por exemplo, essas drogas bloqueiam os transportadores de dopamina (DA) e serotonina (5-HT) (DAT e SERT, respectivamente) (Cozzi et al. 1999, Rothman et al. 2003, Fleckenstein et al. 2000, Lopez-Arnau et al. 2012) e estimulam a liberação de monoamina in vitro (Kalix e Glennon 1986, Gygi et al. 1997, Rothman et al. 2003) e in vivo (Gygi et al. 1997, Kehr et al. 2011). A metcatinona causa reduções persistentes da atividade da triptofano hidroxilase e da tirosina hidroxilase (TH) e depleção de DA e 5-HT (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). Estudos de imagem PET em usuários abstinentes de metcatinona revelaram uma densidade reduzida de DAT no estriado, sugerindo uma perda de terminais de DA (McCann et al. 1998). A estimulação simultânea da liberação de DA e a inibição de sua captação espelham os elementos críticos subjacentes à neurotoxicidade associada à metanfetamina (Kuhn et al. 2008, Yamamoto e Bankson 2005, Cadet et al. 2007, Fleckenstein et al. 2007).
Nós (Angoa-Perez et al. 2012) e outros (Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011) investigamos recentemente a possibilidade de a mefedrona causar neurotoxicidade como a metanfetamina e o MDMA. Surpreendentemente, a mefedrona não foi tóxica para as terminações nervosas DA do estriado (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). A questão de saber se a mefedrona danifica as terminações nervosas 5-HT permanece incerta, pois um estudo documentou efeitos positivos (Hadlock et al. 2011), enquanto outro foi negativo (Baumann et al. 2012). À luz do efeito relativamente benigno da mefedrona sobre as terminações nervosas DA e considerando suas propriedades como bloqueador DAT, levantamos a hipótese de que ela poderia realmente proteger o sistema neuronal DA dos efeitos neurotóxicos da metanfetamina, como ocorre com outros bloqueadores DAT, como o ácido anfonélico (Pu et al. 1994, Schmidt e Gibb 1985, Marek et al. 1990) e a nomifensina (Poth et al. 2012). Atualmente, relatamos que a mefedrona aumenta significativamente a neurotoxicidade da metanfetamina. Esse efeito se estende à anfetamina e ao MDMA, drogas que são frequentemente usadas em conjunto com a mefedrona (Feyissa e Kelly 2008, Schifano et al. 2011). Esses resultados surpreendentes lançam uma nova luz sobre o abuso de mefedrona e aumentam a urgência do reconhecimento dessa propriedade sutil e perigosa dessa β-cetoanfetamina.
Materiais e métodos
Drogas e reagentes
O cloridrato de mefedrona e a 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA) foram obtidos do NIDA Research Resources Drug Supply Program. (+) Cloridrato de metanfetamina, maleato de nomifensina, sulfato de d-anfetamina, pentobarbital, DA e todos os tampões e reagentes de HPLC foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Os kits de ensaio de proteína de ácido bicinchonínico foram obtidos da Pierce (Rockford, IL, EUA). Os anticorpos policlonais contra TH de rato foram produzidos conforme descrito anteriormente (Kuhn e Billingsley, 1987). Os anticorpos monoclonais contra DAT de rato foram generosamente fornecidos pela Dra. Roxanne A. Vaughan (Universidade de Dakota do Norte, Grand Forks, ND, EUA). Os anticorpos secundários anti-IgG conjugados com HRP foram fornecidos pela Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA, EUA).
Animais
Camundongos C57BL/6 fêmeas (Harlan, Indianapolis, IN, EUA) pesando de 20 a 25 g no momento do experimento foram alojados em 5 gaiolas grandes de caixa de sapato em uma sala com luz (12 h claro/escuro) e temperatura controlada. Foram usadas fêmeas de camundongos porque elas são conhecidas por serem muito sensíveis ao dano neuronal causado pelas anfetaminas neurotóxicas e para manter a consistência com nossos estudos anteriores sobre a neurotoxicidade da metanfetamina (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Os camundongos tiveram livre acesso a alimentos e água. O Comitê Institucional de Cuidados e Uso da Wayne State University aprovou os cuidados com os animais e os procedimentos experimentais. Todos os procedimentos também estavam em conformidade com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
Procedimentos farmacológicos, fisiológicos e comportamentais
Os camundongos foram tratados com mefedrona usando um regime semelhante a uma farra, composto de 4 injeções de 10, 20 ou 40 mg/kg com um intervalo de 2 horas entre cada injeção. Esse regime de tratamento em regime de compulsão, quando usado para injetar anfetaminas substituídas e derivados de catinona, resulta em danos extensos nas terminações nervosas DA. As doses de mefedrona usadas atualmente demonstraram anteriormente não serem tóxicas para as terminações nervosas DA (Angoa-Perez et al. 2012). Os camundongos foram tratados com metanfetamina (4X 2,5 ou 5 mg/kg), anfetamina (4X 5 mg/kg) ou MDMA (4X 20 mg/kg) isoladamente ou em combinação com mefedrona. Quando tratados com duas drogas, os camundongos receberam uma injeção de mefedrona 30 minutos antes de cada uma das quatro injeções de metanfetamina, anfetamina ou MDMA. Os controles receberam injeções de solução salina fisiológica na mesma programação usada para a mefedrona sozinha ou em combinação com outras anfetaminas. Como controle dos efeitos de um inibidor de DAT na toxicidade da metanfetamina, os camundongos foram tratados com nomifensina (4X 5 mg/kg) 30 minutos antes de cada injeção de metanfetamina (4X 5 mg/kg). Todas as injeções foram administradas por via i.p.. Os camundongos foram sacrificados dois dias após o último tratamento com a droga, quando a neurotoxicidade associada à anfetamina atingiu o máximo. A temperatura corporal foi monitorada por telemetria usando transponders de temperatura implantáveis IPTT-300 da Bio Medic Data Systems, Inc. (Seaford, DE, EUA). As temperaturas foram registradas de forma não invasiva a cada 20 minutos, começando 60 minutos antes da primeira injeção de METH e continuando por 9 horas depois, usando o sistema de console DAS-5001 da Bio Medic.
Determinação do conteúdo de DA no estriado
O tecido estriado foi dissecado bilateralmente do cérebro após o tratamento e armazenado a -80°C. Os tecidos congelados foram pesados e sonicados em 10 volumes de ácido perclórico 0,16 N a 4°C. A proteína insolúvel foi removida por centrifugação e a DA foi determinada por HPLC com detecção eletroquímica, conforme descrito anteriormente para a metanfetamina (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
Determinação dos níveis de proteína TH e DAT por immunoblotting
Os efeitos dos tratamentos com drogas sobre os níveis de TH e DAT no estriado foram determinados por immunoblotting como um índice de toxicidade para as terminações nervosas DA no estriado. Os camundongos foram sacrificados por decapitação após o tratamento e o estriado foi dissecado bilateralmente. O tecido foi armazenado a -80°C. O tecido congelado foi rompido por sonicação em SDS 1% a 95°C e o material insolúvel foi sedimentado por centrifugação. A proteína foi determinada pelo método do ácido bicinconínico e quantidades iguais de proteína (70 μg/lano) foram resolvidas por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida e, em seguida, eletroblotadas em nitrocelulose. Os blots foram bloqueados em solução salina tamponada com Tris contendo Tween 20 (0,1% v/v) e 5% de leite seco sem gordura por 1 hora em temperatura ambiente. Anticorpos primários contra TH (1:1000) ou DAT (1:1000) foram adicionados aos blots e deixados incubar por 16 horas a 4°C. Os blots foram lavados 3 vezes em solução salina tamponada com Tris para remover os anticorpos que não reagiram e, em seguida, incubados com anticorpo secundário anti-IgG conjugado com HRP (1:4000) por 1 hora em temperatura ambiente. As bandas imunorreativas foram visualizadas por quimioluminescência aprimorada e as densidades relativas das bandas reativas a TH e DAT foram determinadas por imagem com uma Kodak Image Station (Carestream Molecular Systems, Rochester, NY, EUA) e quantificadas com o software ImageJ (NIH).
Análise de dados
Foram realizadas ANOVAs de duas vias para analisar os efeitos da dose de metanfetamina versus mefedrona sobre DA, DAT e TH. Os efeitos dos tratamentos com drogas no conteúdo estriatal de DA, TH e DAT foram testados quanto à significância por meio de ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. Os resultados dos tratamentos com medicamentos sobre a temperatura corporal central ao longo do tempo foram analisados por meio de uma ANOVA de duas vias seguida pelo teste de Bonferroni para determinar a significância das diferenças de temperatura em momentos individuais após o tratamento. As diferenças foram consideradas significativas se p < 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o GraphPad Prism versão 5.02 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA, www.graphpad.com).
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Resultados
Efeitos da mefedrona na neurotoxicidade induzida pela metanfetamina
A mefedrona, em doses (10, 20 ou 40 mg/kg) conhecidas por não causar toxicidade na terminação nervosa DA (Angoa-Perez et al. 2012), foi administrada 30 minutos antes de cada injeção de metanfetamina. A metanfetamina foi administrada em doses que causam danos moderados (4X 2,5 mg/kg) ou graves (4X 5 mg/kg) às terminações nervosas DA do estriado (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). Os resultados apresentados na Fig. 1 mostram que os principais efeitos da dose de metanfetamina (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) e da dose de mefedrona (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) sobre os níveis de DA no estriado foram altamente significativos pela ANOVA de duas vias. O efeito principal da mefedrona administrada em combinação com 2,5 mg/kg (F4,22 = 35,96, p < 0,001) ou 5,0 mg/kg de metanfetamina (F4,17 = 953,9, p < 0,0001) também foi altamente significativo pela ANOVA de uma via. Todos os tratamentos com qualquer dose de metanfetamina ± mefedrona causaram reduções significativamente maiores na DA em comparação com o respectivo controle (p < 0,0001 para todos). A Fig. 1 também mostra que as doses de mefedrona de 20 (p < 0,01) e 40 mg/kg (p < 0,001) aumentaram significativamente os efeitos depletores de 2,5 mg/kg de metanfetamina sobre a DA, enquanto todas as doses de mefedrona aumentaram significativamente os efeitos de 5,0 mg/kg de metanfetamina sobre os níveis de DA (p < 0,0001 para todos).
Fig.1
Efeitos da mefedrona sobre as reduções induzidas pela metanfetamina na DA estriatal. Os camundongos foram tratados com as doses indicadas de mefedrona (MEPH) 30 minutos antes de cada injeção de 2,5 (-) ou 5,0 mg/kg (■) de metanfetamina (METH) e sacrificados 2 dias depois para a determinação dos níveis estriatais de DA por HPLC. Os dados são a média ± SEM de 5-7 camundongos por grupo. Algumas barras de erro eram muito pequenas para exceder o tamanho dos símbolos e não aparecem visíveis. ***p < 0,001 vs. controles e #p < 0,01, ##p < 0,001 ou ###p < 0,0001 vs. a respectiva dose de metanfetamina (teste de comparação múltipla de Tukey).
A Fig. 2a mostra que a mefedrona aumentou significativamente as reduções induzidas pela metanfetamina nos níveis de DAT, conforme determinado por imunotransferência. Os imunoblots foram quantificados e, de acordo com os resultados para DA, os principais efeitos da dose de metanfetamina (F1,92 = 9,48, p < 0,001) e da dose de mefedrona (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) sobre os níveis de DAT no estriado foram altamente significativos pela ANOVA de duas vias (Fig. 2b). O efeito principal da mefedrona administrada em combinação com 2,5 mg/kg (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) ou 5,0 mg/kg de metanfetamina (F4,39 = 24,84, p < 0,0001) também foi altamente significativo pela ANOVA de uma via. Todos os tratamentos com qualquer uma das doses de metanfetamina ± mefedrona causaram reduções significativamente maiores no DAT em comparação com o respectivo controle (p < 0,01 para 2,5 mg/kg de metanfetamina isolada; p < 0,0001 para todos os outros tratamentos). A Fig. 2b também mostra que as doses de mefedrona de 20 mg/kg (p < 0,01) e 40 mg/kg (p < 0,001) aumentaram significativamente as reduções no DAT causadas por 2,5 mg/kg de metanfetamina, enquanto apenas a dose de 40 mg/kg de mefedrona aumentou significativamente (p < 0,01) os efeitos de 5,0 mg/kg de metanfetamina nas reduções do DAT.
Fig.2
Efeitos da mefedrona sobre as reduções induzidas pela metanfetamina no DAT estriado. Os camundongos foram tratados com as doses indicadas de mefedrona (MEPH) 30 minutos antes de cada injeção de 2,5 (●) ou 5,0 mg/kg (■) de metanfetamina (METH) e sacrificados 2 dias depois para a determinação dos níveis estriatais de DAT por immunoblotting (a). Os blots foram quantificados usando o ImageJ e os dados são a média ± SEM para 10-12 camundongos por grupo (b). *p < 0,01 ou ***p < 0,0001 vs. controle (C) e #p < 0,01 ou ##p < 0,001 vs. a respectiva dose de metanfetamina (teste de comparação múltipla de Tukey).
A Fig. 3a mostra que a mefedrona aumentou significativamente as reduções induzidas pela metanfetamina nos níveis de TH, conforme determinado por immunoblotting. Os immunoblots foram quantificados e, de acordo com os resultados acima para DA e DAT, os principais efeitos da dose de metanfetamina (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) e da dose de mefedrona (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) foram altamente significativos pela ANOVA de duas vias (Fig. 3b). O efeito principal da mefedrona administrada em combinação com 2,5 mg/kg (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) ou 5,0 mg/kg de metanfetamina (F4,49 = 99,16, p < 0,0001) também foi altamente significativo na ANOVA de uma via. Todos os tratamentos com qualquer uma das doses de metanfetamina ± mefedrona causaram reduções significativamente maiores no TH em comparação com o respectivo controle (p < 0,001 para 2,5 mg/kg de metanfetamina + 10 mg/kg de mefedrona; p < 0,0001 para todas as outras combinações), com exceção de 2,5 mg/kg de metanfetamina isolada, que não alterou significativamente os níveis de TH (ou seja, nenhuma toxicidade). A Fig. 3b também mostra que as doses de mefedrona de 20 mg/kg (p < 0,01) e 40 mg/kg (p < 0,001) aumentaram significativamente as reduções de TH causadas por 2,5 mg/kg de metanfetamina e todas as três doses de mefedrona aumentaram significativamente (p < 0,0001) os efeitos de 5,0 mg/kg de metanfetamina nas reduções de TH.
Fig. 3
Efeitos da mefedrona nas reduções induzidas pela metanfetamina no TH estriatal. Os camundongos foram tratados com as doses indicadas de mefedrona (MEPH) 30 minutos antes de cada injeção de 2,5 (●) ou 5,0 mg/kg (■) de metanfetamina (METH) e sacrificados 2 dias depois para a determinação dos níveis estriatais de TH por immunoblotting (a). Os blots foram quantificados usando o ImageJ e os dados são a média ± SEM para 10-12 camundongos por grupo (b). Algumas barras de erro eram muito pequenas para exceder o tamanho dos símbolos e não aparecem visíveis. **p < 0,001 ou ***p < 0,0001 vs. controle (C) e #p < 0,01, ##p < 0,001 ou ###p < 0,0001) vs. a respectiva dose de metanfetamina (teste de comparação múltipla de Tukey).
Efeitos da mefedrona na hipertermia induzida por metanfetamina
A mefedrona, assim como a metanfetamina, causa hipertermia significativa (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Quando a mefedrona foi administrada 30 minutos antes de cada injeção de metanfetamina, pode-se observar na Fig. 4 que os principais efeitos das doses de metanfetamina e mefedrona (F1,300 = 11,99, p < 0,0001) ao longo do tempo (F4,300 = 51,73, p < 0,0001) foram altamente significativos pela ANOVA de duas vias. Os principais efeitos da mefedrona administrada em combinação com 2,5 mg/kg de metanfetamina (F4,120 = 41,44, p < 0,0001, painel a) ao longo do tempo (F30,120 = 3,84, p < 0,0001) ou 5,0 mg/kg de metanfetamina (F4,120 = 78,09, p < 0,0001, painel b) ao longo do tempo (F30,120 = 9,98, p < 0,0001) também foram altamente significativos pela ANOVA de duas vias. Todos os tratamentos com qualquer dose de metanfetamina ± mefedrona foram significativamente diferentes dos respectivos controles (p < 0,0001 para todos os tratamentos).
Fig. 4
Efeitos da mefedrona na hipertermia induzida por metanfetamina. Os camundongos foram tratados com as doses indicadas de mefedrona (MEPH) 30 minutos antes de cada injeção de 2,5 (a) ou 5,0 mg/kg (b) de metanfetamina (METH). As temperaturas centrais foram medidas em intervalos de 20 minutos por telemetria, começando 60 minutos antes da primeira injeção de metanfetamina. As 4 injeções de metanfetamina são indicadas pelas setas que repousam no eixo x. Os dados são expressos como temperatura corporal média de 6 a 8 camundongos por grupo. Os SEMs foram sempre < 10% da média e são omitidos para fins de clareza.
Efeitos da mefedrona na neurotoxicidade induzida por anfetamina e MDMA
Para testar se os efeitos de aumento da mefedrona sobre a metanfetamina poderiam ser estendidos a outras anfetaminas neurotóxicas, os camundongos foram tratados com essa β-cetoanfetamina (20 mg/kg) mais anfetamina (4X 5 mg/kg) ou MDMA (4X 20 mg/kg) e os resultados são apresentados na Figura 5. Lembre-se de que a mefedrona em si não reduz a DA, DAT ou TH estriatal (Angoa-Perez et al. 2012). O efeito principal da droga (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) foi altamente significativo pela ANOVA unidirecional para reduções de DA (Fig. 5a). Também é possível observar na Fig. 5a que todos os tratamentos com anfetamina (p < 0,001) ou MDMA (p < 0,001) isoladamente ou em combinação com mefedrona (p < 0,0001 para ambas as drogas) reduziram significativamente os níveis de DA em relação ao controle. A mefedrona aumentou significativamente as reduções de DA causadas por anfetamina (p < 0,01) ou MDMA (p < 0,01). A Fig. 5b mostra efeitos semelhantes da combinação de tratamentos com drogas nos níveis de DAT no estriado. O efeito principal da droga (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) foi altamente significativo pela ANOVA unidirecional para DAT. Também pode ser visto na Fig. 5b que todos os tratamentos com anfetamina ou MDMA foram significativamente (p < 0,0001 para todos) menores em comparação com o controle. A mefedrona também aumentou significativamente as reduções de DAT causadas por anfetamina ou MDMA (p < 0,0001 em ambos os casos). Por fim, a Fig. 5c mostra que o efeito principal da droga (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) foi altamente significativo pela ANOVA unidirecional para reduções no TH. Também é possível observar na Fig. 5c que todos os tratamentos com anfetamina ou MDMA foram significativamente (p < 0,0001 para todos) menores em comparação com o controle. A mefedrona também aumentou significativamente as reduções de TH causadas por anfetamina ou MDMA (p < 0,0001 em ambos os casos)
Fig. 5
Efeitos da mefedrona na neurotoxicidade da terminação nervosa DA induzida por anfetamina ou MDMA. Os camundongos foram tratados com 20 mg/kg de mefedrona (MEPH) 30 minutos antes de cada injeção de 5,0 mg/kg de anfetamina (AMPH) ou 20 mg/kg de MDMA e sacrificados 2d após o tratamento para determinação dos níveis estriatais de (a) DA por HPLC. (b) DAT e (c) TH foram determinados por immunoblotting e os blots foram quantificados usando o ImageJ. Os immunoblots representativos para DAT e TH estão incluídos como inserções nos painéis (b) e (c), respectivamente, e os tratamentos para ambos os painéis são indicados por 1,5: controle; 2,6: MEPH; 3: AMPH; 4: AMPH + MEPH; 7: MDMA; e 8: MDMA + MEPH. Os dados são a média ± SEM para 5-12 camundongos em cada grupo. **p < 0,001 ou ***p < 0,0001 vs. controle e #p < 0,01 ou ###p < 0,0001 vs. AMPH ou MDMA (teste de comparação múltipla de Tukey).
Efeitos da nomifensina na neurotoxicidade induzida pela metanfetamina
A nomifensina, um potente bloqueador de DAT sem abuso conhecido ou potencial neurotóxico, foi testada quanto à sua capacidade de proteção contra a neurotoxicidade induzida pela metanfetamina e quanto ao contraste com as ações da mefedrona sobre a toxicidade das terminações nervosas DA causadas pela metanfetamina, anfetamina e MDMA. Os resultados na Fig. 6a mostram que o efeito principal da droga (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) sobre os níveis de DA foi altamente significativo pela ANOVA unidirecional. A nomifensina isolada não alterou os níveis de DA, mas a redução causada pela metanfetamina (p < 0,0001) foi ligeiramente, mas significativamente, revertida pela nomifensina (p < 0,01). O efeito principal da droga (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) nos níveis de DAT foi altamente significativo pela ANOVA unidirecional, conforme mostrado na Fig. 6b. A nomifensina não alterou os níveis de DAT, mas forneceu proteção significativa (p < 0,001) contra a redução do DAT estriatal causada pela metanfetamina (p < 0,0001) em comparação com o controle. Por fim, a Fig. 6c mostra que o efeito principal da droga (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) nos níveis de TH foi altamente significativo pela ANOVA unidirecional. Como observado para DA e DAT, a redução do TH causada pela metanfetamina (p < 0,0001) foi ligeiramente, mas significativamente, evitada pela nomifensina (p < 0,01).
Fig. 6
Efeitos da nomifensina na neurotoxicidade da terminação nervosa DA induzida pela metanfetamina. Os camundongos foram tratados com 5,0 mg/kg de nomifensina (NOM) 30 minutos antes de cada injeção de 5,0 mg/kg de metanfetamina (METH) e sacrificados 2 dias depois para a determinação dos níveis estriatais de (a) DA por HPLC. (b) DAT e (c) TH foram determinados por immunoblotting e os blots foram quantificados usando o ImageJ. Os immunoblots representativos para DAT e TH estão incluídos como inserções nos painéis (b) e (c), respectivamente. Os dados são a média mais SEM para 5-7 camundongos por grupo. ***p < 0,0001 vs. controle (C) e #p < 0,01 ou ##p < 0,001 vs. metanfetamina isolada (teste de comparação múltipla de Tukey).
Discussão
O objetivo do presente estudo foi determinar se a mefedrona evitaria a toxicidade da terminação nervosa DA causada pela metanfetamina. Com base em sua semelhança química com a metanfetamina e o MDMA, esperava-se inicialmente que a mefedrona exercesse efeitos prejudiciais sobre o sistema neuronal DA. Entretanto, vários estudos estabeleceram quase simultaneamente que a mefedrona não era tóxica para as terminações nervosas DA (Angoa-Perez et al. 2012, Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011). A questão de saber se essa droga causa danos ao sistema neuronal de 5-HT permanece em aberto. Um estudo relatou reduções persistentes na função da terminação nervosa 5-HT (Hadlock et al. 2011), enquanto outro concluiu que a mefedrona não causou danos (Baumann et al. 2012). A mefedrona interage com a terminação nervosa DA de uma maneira que sugere que ela realmente estimula a liberação e bloqueia a recaptação de DA por meio de suas interações com o DAT. Uma faceta importante do mecanismo de ação neurotóxico da metanfetamina é sua capacidade de obter acesso às terminações nervosas DA por meio do DAT e interromper a homeostase da DA (Sulzer 2011). Se essa etapa inicial da cascata neurotóxica da metanfetamina for evitada pela inibição do DAT, a toxicidade será evitada (Pu et al. 1994, Poth et al. 2012, Marek et al. 1990, Schmidt e Gibb 1985). Pensamos que a mefedrona poderia ter essa mesma propriedade protetora que outros inibidores da DAT, mas, em vez disso, observamos um aumento significativo da toxicidade. Essa interação foi observada usando duas doses diferentes de metanfetamina que causam danos moderados ou graves às terminações nervosas DA (4X 2,5 ou 5,0 mg/kg, respectivamente). Esse efeito potencializador da mefedrona não se restringiu à metanfetamina e se estendeu à anfetamina e ao MDMA, duas drogas que são frequentemente usadas em conjunto com a mefedrona e outras β-cetoanfetaminas (Feyissa e Kelly 2008, Schifano et al. 2011, Kelly 2011). Portanto, apesar do fato de a mefedrona não causar toxicidade pelo menos nas terminações nervosas DA do estriado, ela potencializa os efeitos neurotóxicos de outras drogas de abuso. Esse novo achado deve colocar o abuso de mefedrona em termos ainda mais severos, pois sua falta de neurotoxicidade intrínseca pode fazer com que ela pareça inócua.
A hipertermia é um efeito adverso agudo comumente relatado da ingestão de metanfetamina (Greene et al. 2008) e β-cetoanfetamina em humanos (Borek e Holstege 2012, Prosser e Nelson 2012). Assim como a metanfetamina, muitas das drogas β-cetoanfetaminas também causam elevações significativas na temperatura central em roedores (Angoa-Perez et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Rockhold et al. 1997). Embora a hipertermia causada pela metanfetamina possa contribuir para seus efeitos prejudiciais morfológicos e neuronais, não é necessariamente o caso de a hipertermia ser a causa direta desses efeitos (Kiyatkin e Sharma 2009). Registramos as temperaturas corporais centrais em camundongos tratados com mefedrona e metanfetamina e observamos que o tratamento combinado não aumentou as temperaturas além dos aumentos máximos observados após o uso isolado de qualquer uma das drogas. A metanfetamina causou um aumento na temperatura corporal relacionado à dose e essa hipertermia foi invariável em toda a faixa de dose de mefedrona testada. De fato, a queda pós-injeção na temperatura corporal observada após o tratamento com mefedrona (Angoa-Perez et al. 2012) foi mantida em doses mais altas de mefedrona mais metanfetamina. Embora a hipertermia induzida pela droga não tenha sido aumentada pelo tratamento com drogas combinadas, os efeitos neurotóxicos foram aditivos. Portanto, pelo menos no presente caso, parece que os efeitos neurotóxicos da metanfetamina podem ser aumentados pela mefedrona de uma maneira que independe da hipertermia.
A mefedrona inibe claramente a função DAT e bloqueia a recaptação de DA in vitro (Lopez-Arnau et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Kehr et al. 2011, Martinez-Clemente et al. 2012, Cozzi et al. 1999). A mefedrona desloca o WIN-35,428 de seu local de ligação no DAT, sugerindo que é um inibidor competitivo da captação de DA (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). A potência da mefedrona nesse aspecto é muito semelhante à da metanfetamina (Cozzi et al. 1999) e da MDMA (Escubedo et al. 2011). Não se sabe se a mefedrona é transportada pelo DAT, mas a metcatinona é (Cozzi e Foley 2003). A nomifensina e o ácido anfonélico, que se ligam ao DAT e inibem a captação de DA, proporcionam proteção substancial contra a neurotoxicidade induzida pela metanfetamina (Pu et al. 1994, Marek et al. 1990, Schmidt e Gibb 1985, Poth et al. 2012) e os camundongos sem o DAT são resistentes à toxicidade neuronal da metanfetamina (Fumagalli et al. 1998). O fato de a mefedrona não ser neurotóxica e ser um bloqueador da DAT leva à previsão de que ela deve evitar a toxicidade. Testamos a nomifensina nesse sentido como um controle positivo e confirmamos que ela protege contra a depleção de DA, DAT e TH induzida pela metanfetamina. A nomifensina também inibe o transportador de norepinefrina (Brogden et al. 1979), mas essa propriedade não pode explicar os resultados atuais porque a maioria das β-cetoanfetaminas, incluindo a mefedrona, inibe o transportador de norepinefrina e bloqueia a captação de norepinefrina (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). Uma função para o sistema neuronal 5-HT em algumas das ações farmacológicas da mefedrona é possível à luz da capacidade dessa droga, como o MDMA (Yamamoto et al. 1995), de causar efluxo de DA estriatal por meio de suas interações com os receptores 5-HT2A (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). A hiperlocomoção causada pela mefedrona depende da 5-HT endógena (Lopez-Arnau et al. 2012) e essa droga também estimula a liberação de 5-HT e inibe sua captação in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) e in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). No entanto, podemos descartar uma função para a 5-HT endógena na neurotoxicidade da DA, pelo menos da metanfetamina, demonstrando que os camundongos geneticamente depletados de 5-HT mantêm sua sensibilidade à neurotoxicidade (Thomas et al. 2010).
A mefedrona poderia aumentar a neurotoxicidade da metanfetamina por vários mecanismos possíveis. Primeiro, a mefedrona poderia interagir com o VMAT para causar vazamento de DA no citoplasma da terminação nervosa pré-sináptica. Os tratamentos que aumentam o pool citoplasmático (ou seja, liberável pela droga) de DA aumentam a neurotoxicidade da metanfetamina (Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009, Schmidt et al. 1985). Esse mecanismo não é provável porque a metcatinona interage apenas fracamente com o VMAT (Cozzi et al. 1999). Em segundo lugar, a combinação de mefedrona e metanfetamina poderia ter um efeito sinérgico na liberação não vesicular de DA, mas essa possibilidade também parece improvável à luz dos resultados que mostram que o tratamento de células CHO que expressam DAT ou SERT com metilona e metanfetamina não tem um efeito aditivo na liberação de DA ou 5-HT (Sogawa et al. 2011). Em terceiro lugar, a mefedrona poderia interagir com o DAT de uma nova maneira que contribui para a toxicidade aditiva. Foi demonstrado que a metilona em combinação com a metanfetamina causa citotoxicidade sinérgica em células CHO que expressam o DAT ou SERT, mas não em células CHO do tipo selvagem que não possuem os transportadores (Sogawa et al. 2011). A citotoxicidade observada em células cultivadas nesses estudos (ou seja, liberação de LDH) é muito diferente do dano às terminações nervosas DA causado pela metanfetamina, mas esse mecanismo sugere uma função interessante, porém indefinida, para o DAT na citotoxicidade aumentada. Por fim, a mefedrona pode alterar o metabolismo da metanfetamina. A mefedrona é metabolizada principalmente por N-desmetilação (Meyer e Maurer 2010), assim como a metanfetamina e o MDMA (Caldwell 1976). O suporte para esse mecanismo vem da demonstração de que a metanfetamina e o MDMA inibem mutuamente a produção de seus respectivos metabólitos primários e elevam os níveis plasmáticos da droga acima daqueles observados após a administração de qualquer uma das drogas isoladamente (Kuwayama et al. 2012). As doses de mefedrona usadas no presente estudo e em nosso estudo anterior (Angoa-Perez et al. 2012), embora altas, não são neurotóxicas e se enquadram na faixa de uso abusivo por seres humanos (McErath e O'Neill 2011). Portanto, a mefedrona poderia estar agindo como o MDMA para aumentar os níveis plasmáticos de metanfetamina inibindo seu metabolismo. Será necessária uma análise farmacocinética detalhada para confirmar essa última possibilidade.
O abuso das β-cetoanfetaminas está aumentando em um ritmo alarmante e a mefedrona é agora uma das drogas mais comumente usadas, depois da maconha, MDMA e cocaína (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Além disso, a mefedrona induz sentimentos mais fortes de desejo em humanos em comparação com o MDMA (Brunt et al. 2011) e os usuários que cheiram a mefedrona a classificam como mais viciante do que a cocaína (Winstock et al. 2011b). A mefedrona é consumida por seres humanos de forma semelhante a uma farra (ou seja, "empilhamento") e é frequentemente consumida com outras drogas, como a maconha e os psicoestimulantes anfetamínicos (Schifano et al. 2011, Fass et al. 2012, Winstock et al. 2011a, Kelly 2011, Torrance e Cooper 2010). A mefedrona é cada vez mais encontrada em comprimidos vendidos como MDMA (Brunt et al. 2011) e seu uso provavelmente ultrapassará o do MDMA, já que a pureza dessa última droga continua a cair (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Com base nos padrões comuns de abuso da mefedrona e de outros ingredientes dos "sais de banho", é importante considerar se há riscos adicionais à saúde dos seres humanos quando essas drogas são combinadas com as anfetaminas de forma intencional ou não. Nossos resultados, que mostram que pelo menos a mefedrona aumenta significativamente a neurotoxicidade das terminações nervosas DA do estriado causada pela metanfetamina, anfetamina e MDMA, revelam uma propriedade particularmente perigosa e inesperada dessa β-cetoanfetamina.
Abreviações usadas
5-HT serotonina
DA dopamina
DAT transportador de DA
MDMA 3,4-metilenodioximetanfetamina
TH tirosina hidroxilase
VMAT transportador de monoamina vesicular
A mefedrona (4-metilmetcatinona) é um derivado da catinona e análogo estrutural da metanfetamina e da 3,4-metilenodioxi-metanfetamina (MDMA). A mefedrona é um ingrediente psicoativo dos "sais de banho", juntamente com outros compostos, como metilona, butilona e 3,4-metilenodioxipirovalerona (MDPV). As β-cetoanfetaminas estão sendo abusadas em taxas crescentes devido, em grande parte, à disponibilidade altamente restrita dos precursores necessários para a síntese de metanfetamina e MDMA em laboratórios clandestinos e a uma redução correspondente em sua pureza (Winstock et al. 2011b, Brunt et al. 2011). Como o abuso de β-cetoanfetaminas continua a aumentar, a lista de seus efeitos adversos cresceu e inclui complicações cardiovasculares, agitação, insônia, psicose e depressão (Schifano et al. 2011, Prosser e Nelson 2012).
Como congêneres químicos da metanfetamina e do MDMA, não é surpreendente que as β-cetoanfetaminas tenham muitos dos mesmos efeitos que essas drogas anteriores no sistema nervoso central. Por exemplo, essas drogas bloqueiam os transportadores de dopamina (DA) e serotonina (5-HT) (DAT e SERT, respectivamente) (Cozzi et al. 1999, Rothman et al. 2003, Fleckenstein et al. 2000, Lopez-Arnau et al. 2012) e estimulam a liberação de monoamina in vitro (Kalix e Glennon 1986, Gygi et al. 1997, Rothman et al. 2003) e in vivo (Gygi et al. 1997, Kehr et al. 2011). A metcatinona causa reduções persistentes da atividade da triptofano hidroxilase e da tirosina hidroxilase (TH) e depleção de DA e 5-HT (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). Estudos de imagem PET em usuários abstinentes de metcatinona revelaram uma densidade reduzida de DAT no estriado, sugerindo uma perda de terminais de DA (McCann et al. 1998). A estimulação simultânea da liberação de DA e a inibição de sua captação espelham os elementos críticos subjacentes à neurotoxicidade associada à metanfetamina (Kuhn et al. 2008, Yamamoto e Bankson 2005, Cadet et al. 2007, Fleckenstein et al. 2007).
Nós (Angoa-Perez et al. 2012) e outros (Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011) investigamos recentemente a possibilidade de a mefedrona causar neurotoxicidade como a metanfetamina e o MDMA. Surpreendentemente, a mefedrona não foi tóxica para as terminações nervosas DA do estriado (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). A questão de saber se a mefedrona danifica as terminações nervosas 5-HT permanece incerta, pois um estudo documentou efeitos positivos (Hadlock et al. 2011), enquanto outro foi negativo (Baumann et al. 2012). À luz do efeito relativamente benigno da mefedrona sobre as terminações nervosas DA e considerando suas propriedades como bloqueador DAT, levantamos a hipótese de que ela poderia realmente proteger o sistema neuronal DA dos efeitos neurotóxicos da metanfetamina, como ocorre com outros bloqueadores DAT, como o ácido anfonélico (Pu et al. 1994, Schmidt e Gibb 1985, Marek et al. 1990) e a nomifensina (Poth et al. 2012). Atualmente, relatamos que a mefedrona aumenta significativamente a neurotoxicidade da metanfetamina. Esse efeito se estende à anfetamina e ao MDMA, drogas que são frequentemente usadas em conjunto com a mefedrona (Feyissa e Kelly 2008, Schifano et al. 2011). Esses resultados surpreendentes lançam uma nova luz sobre o abuso de mefedrona e aumentam a urgência do reconhecimento dessa propriedade sutil e perigosa dessa β-cetoanfetamina.
Materiais e métodos
Drogas e reagentes
O cloridrato de mefedrona e a 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA) foram obtidos do NIDA Research Resources Drug Supply Program. (+) Cloridrato de metanfetamina, maleato de nomifensina, sulfato de d-anfetamina, pentobarbital, DA e todos os tampões e reagentes de HPLC foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Os kits de ensaio de proteína de ácido bicinchonínico foram obtidos da Pierce (Rockford, IL, EUA). Os anticorpos policlonais contra TH de rato foram produzidos conforme descrito anteriormente (Kuhn e Billingsley, 1987). Os anticorpos monoclonais contra DAT de rato foram generosamente fornecidos pela Dra. Roxanne A. Vaughan (Universidade de Dakota do Norte, Grand Forks, ND, EUA). Os anticorpos secundários anti-IgG conjugados com HRP foram fornecidos pela Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA, EUA).
Animais
Camundongos C57BL/6 fêmeas (Harlan, Indianapolis, IN, EUA) pesando de 20 a 25 g no momento do experimento foram alojados em 5 gaiolas grandes de caixa de sapato em uma sala com luz (12 h claro/escuro) e temperatura controlada. Foram usadas fêmeas de camundongos porque elas são conhecidas por serem muito sensíveis ao dano neuronal causado pelas anfetaminas neurotóxicas e para manter a consistência com nossos estudos anteriores sobre a neurotoxicidade da metanfetamina (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Os camundongos tiveram livre acesso a alimentos e água. O Comitê Institucional de Cuidados e Uso da Wayne State University aprovou os cuidados com os animais e os procedimentos experimentais. Todos os procedimentos também estavam em conformidade com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
Procedimentos farmacológicos, fisiológicos e comportamentais
Os camundongos foram tratados com mefedrona usando um regime semelhante a uma farra, composto de 4 injeções de 10, 20 ou 40 mg/kg com um intervalo de 2 horas entre cada injeção. Esse regime de tratamento em regime de compulsão, quando usado para injetar anfetaminas substituídas e derivados de catinona, resulta em danos extensos nas terminações nervosas DA. As doses de mefedrona usadas atualmente demonstraram anteriormente não serem tóxicas para as terminações nervosas DA (Angoa-Perez et al. 2012). Os camundongos foram tratados com metanfetamina (4X 2,5 ou 5 mg/kg), anfetamina (4X 5 mg/kg) ou MDMA (4X 20 mg/kg) isoladamente ou em combinação com mefedrona. Quando tratados com duas drogas, os camundongos receberam uma injeção de mefedrona 30 minutos antes de cada uma das quatro injeções de metanfetamina, anfetamina ou MDMA. Os controles receberam injeções de solução salina fisiológica na mesma programação usada para a mefedrona sozinha ou em combinação com outras anfetaminas. Como controle dos efeitos de um inibidor de DAT na toxicidade da metanfetamina, os camundongos foram tratados com nomifensina (4X 5 mg/kg) 30 minutos antes de cada injeção de metanfetamina (4X 5 mg/kg). Todas as injeções foram administradas por via i.p.. Os camundongos foram sacrificados dois dias após o último tratamento com a droga, quando a neurotoxicidade associada à anfetamina atingiu o máximo. A temperatura corporal foi monitorada por telemetria usando transponders de temperatura implantáveis IPTT-300 da Bio Medic Data Systems, Inc. (Seaford, DE, EUA). As temperaturas foram registradas de forma não invasiva a cada 20 minutos, começando 60 minutos antes da primeira injeção de METH e continuando por 9 horas depois, usando o sistema de console DAS-5001 da Bio Medic.
Determinação do conteúdo de DA no estriado
O tecido estriado foi dissecado bilateralmente do cérebro após o tratamento e armazenado a -80°C. Os tecidos congelados foram pesados e sonicados em 10 volumes de ácido perclórico 0,16 N a 4°C. A proteína insolúvel foi removida por centrifugação e a DA foi determinada por HPLC com detecção eletroquímica, conforme descrito anteriormente para a metanfetamina (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
Determinação dos níveis de proteína TH e DAT por immunoblotting
Os efeitos dos tratamentos com drogas sobre os níveis de TH e DAT no estriado foram determinados por immunoblotting como um índice de toxicidade para as terminações nervosas DA no estriado. Os camundongos foram sacrificados por decapitação após o tratamento e o estriado foi dissecado bilateralmente. O tecido foi armazenado a -80°C. O tecido congelado foi rompido por sonicação em SDS 1% a 95°C e o material insolúvel foi sedimentado por centrifugação. A proteína foi determinada pelo método do ácido bicinconínico e quantidades iguais de proteína (70 μg/lano) foram resolvidas por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida e, em seguida, eletroblotadas em nitrocelulose. Os blots foram bloqueados em solução salina tamponada com Tris contendo Tween 20 (0,1% v/v) e 5% de leite seco sem gordura por 1 hora em temperatura ambiente. Anticorpos primários contra TH (1:1000) ou DAT (1:1000) foram adicionados aos blots e deixados incubar por 16 horas a 4°C. Os blots foram lavados 3 vezes em solução salina tamponada com Tris para remover os anticorpos que não reagiram e, em seguida, incubados com anticorpo secundário anti-IgG conjugado com HRP (1:4000) por 1 hora em temperatura ambiente. As bandas imunorreativas foram visualizadas por quimioluminescência aprimorada e as densidades relativas das bandas reativas a TH e DAT foram determinadas por imagem com uma Kodak Image Station (Carestream Molecular Systems, Rochester, NY, EUA) e quantificadas com o software ImageJ (NIH).
Análise de dados
Foram realizadas ANOVAs de duas vias para analisar os efeitos da dose de metanfetamina versus mefedrona sobre DA, DAT e TH. Os efeitos dos tratamentos com drogas no conteúdo estriatal de DA, TH e DAT foram testados quanto à significância por meio de ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. Os resultados dos tratamentos com medicamentos sobre a temperatura corporal central ao longo do tempo foram analisados por meio de uma ANOVA de duas vias seguida pelo teste de Bonferroni para determinar a significância das diferenças de temperatura em momentos individuais após o tratamento. As diferenças foram consideradas significativas se p < 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o GraphPad Prism versão 5.02 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA, www.graphpad.com).
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Resultados
Efeitos da mefedrona na neurotoxicidade induzida pela metanfetamina
A mefedrona, em doses (10, 20 ou 40 mg/kg) conhecidas por não causar toxicidade na terminação nervosa DA (Angoa-Perez et al. 2012), foi administrada 30 minutos antes de cada injeção de metanfetamina. A metanfetamina foi administrada em doses que causam danos moderados (4X 2,5 mg/kg) ou graves (4X 5 mg/kg) às terminações nervosas DA do estriado (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). Os resultados apresentados na Fig. 1 mostram que os principais efeitos da dose de metanfetamina (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) e da dose de mefedrona (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) sobre os níveis de DA no estriado foram altamente significativos pela ANOVA de duas vias. O efeito principal da mefedrona administrada em combinação com 2,5 mg/kg (F4,22 = 35,96, p < 0,001) ou 5,0 mg/kg de metanfetamina (F4,17 = 953,9, p < 0,0001) também foi altamente significativo pela ANOVA de uma via. Todos os tratamentos com qualquer dose de metanfetamina ± mefedrona causaram reduções significativamente maiores na DA em comparação com o respectivo controle (p < 0,0001 para todos). A Fig. 1 também mostra que as doses de mefedrona de 20 (p < 0,01) e 40 mg/kg (p < 0,001) aumentaram significativamente os efeitos depletores de 2,5 mg/kg de metanfetamina sobre a DA, enquanto todas as doses de mefedrona aumentaram significativamente os efeitos de 5,0 mg/kg de metanfetamina sobre os níveis de DA (p < 0,0001 para todos).
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Fig.1
Efeitos da mefedrona sobre as reduções induzidas pela metanfetamina na DA estriatal. Os camundongos foram tratados com as doses indicadas de mefedrona (MEPH) 30 minutos antes de cada injeção de 2,5 (-) ou 5,0 mg/kg (■) de metanfetamina (METH) e sacrificados 2 dias depois para a determinação dos níveis estriatais de DA por HPLC. Os dados são a média ± SEM de 5-7 camundongos por grupo. Algumas barras de erro eram muito pequenas para exceder o tamanho dos símbolos e não aparecem visíveis. ***p < 0,001 vs. controles e #p < 0,01, ##p < 0,001 ou ###p < 0,0001 vs. a respectiva dose de metanfetamina (teste de comparação múltipla de Tukey).
A Fig. 2a mostra que a mefedrona aumentou significativamente as reduções induzidas pela metanfetamina nos níveis de DAT, conforme determinado por imunotransferência. Os imunoblots foram quantificados e, de acordo com os resultados para DA, os principais efeitos da dose de metanfetamina (F1,92 = 9,48, p < 0,001) e da dose de mefedrona (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) sobre os níveis de DAT no estriado foram altamente significativos pela ANOVA de duas vias (Fig. 2b). O efeito principal da mefedrona administrada em combinação com 2,5 mg/kg (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) ou 5,0 mg/kg de metanfetamina (F4,39 = 24,84, p < 0,0001) também foi altamente significativo pela ANOVA de uma via. Todos os tratamentos com qualquer uma das doses de metanfetamina ± mefedrona causaram reduções significativamente maiores no DAT em comparação com o respectivo controle (p < 0,01 para 2,5 mg/kg de metanfetamina isolada; p < 0,0001 para todos os outros tratamentos). A Fig. 2b também mostra que as doses de mefedrona de 20 mg/kg (p < 0,01) e 40 mg/kg (p < 0,001) aumentaram significativamente as reduções no DAT causadas por 2,5 mg/kg de metanfetamina, enquanto apenas a dose de 40 mg/kg de mefedrona aumentou significativamente (p < 0,01) os efeitos de 5,0 mg/kg de metanfetamina nas reduções do DAT.
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Fig.2
Efeitos da mefedrona sobre as reduções induzidas pela metanfetamina no DAT estriado. Os camundongos foram tratados com as doses indicadas de mefedrona (MEPH) 30 minutos antes de cada injeção de 2,5 (●) ou 5,0 mg/kg (■) de metanfetamina (METH) e sacrificados 2 dias depois para a determinação dos níveis estriatais de DAT por immunoblotting (a). Os blots foram quantificados usando o ImageJ e os dados são a média ± SEM para 10-12 camundongos por grupo (b). *p < 0,01 ou ***p < 0,0001 vs. controle (C) e #p < 0,01 ou ##p < 0,001 vs. a respectiva dose de metanfetamina (teste de comparação múltipla de Tukey).
A Fig. 3a mostra que a mefedrona aumentou significativamente as reduções induzidas pela metanfetamina nos níveis de TH, conforme determinado por immunoblotting. Os immunoblots foram quantificados e, de acordo com os resultados acima para DA e DAT, os principais efeitos da dose de metanfetamina (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) e da dose de mefedrona (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) foram altamente significativos pela ANOVA de duas vias (Fig. 3b). O efeito principal da mefedrona administrada em combinação com 2,5 mg/kg (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) ou 5,0 mg/kg de metanfetamina (F4,49 = 99,16, p < 0,0001) também foi altamente significativo na ANOVA de uma via. Todos os tratamentos com qualquer uma das doses de metanfetamina ± mefedrona causaram reduções significativamente maiores no TH em comparação com o respectivo controle (p < 0,001 para 2,5 mg/kg de metanfetamina + 10 mg/kg de mefedrona; p < 0,0001 para todas as outras combinações), com exceção de 2,5 mg/kg de metanfetamina isolada, que não alterou significativamente os níveis de TH (ou seja, nenhuma toxicidade). A Fig. 3b também mostra que as doses de mefedrona de 20 mg/kg (p < 0,01) e 40 mg/kg (p < 0,001) aumentaram significativamente as reduções de TH causadas por 2,5 mg/kg de metanfetamina e todas as três doses de mefedrona aumentaram significativamente (p < 0,0001) os efeitos de 5,0 mg/kg de metanfetamina nas reduções de TH.
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Fig. 3
Efeitos da mefedrona nas reduções induzidas pela metanfetamina no TH estriatal. Os camundongos foram tratados com as doses indicadas de mefedrona (MEPH) 30 minutos antes de cada injeção de 2,5 (●) ou 5,0 mg/kg (■) de metanfetamina (METH) e sacrificados 2 dias depois para a determinação dos níveis estriatais de TH por immunoblotting (a). Os blots foram quantificados usando o ImageJ e os dados são a média ± SEM para 10-12 camundongos por grupo (b). Algumas barras de erro eram muito pequenas para exceder o tamanho dos símbolos e não aparecem visíveis. **p < 0,001 ou ***p < 0,0001 vs. controle (C) e #p < 0,01, ##p < 0,001 ou ###p < 0,0001) vs. a respectiva dose de metanfetamina (teste de comparação múltipla de Tukey).
Efeitos da mefedrona na hipertermia induzida por metanfetamina
A mefedrona, assim como a metanfetamina, causa hipertermia significativa (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Quando a mefedrona foi administrada 30 minutos antes de cada injeção de metanfetamina, pode-se observar na Fig. 4 que os principais efeitos das doses de metanfetamina e mefedrona (F1,300 = 11,99, p < 0,0001) ao longo do tempo (F4,300 = 51,73, p < 0,0001) foram altamente significativos pela ANOVA de duas vias. Os principais efeitos da mefedrona administrada em combinação com 2,5 mg/kg de metanfetamina (F4,120 = 41,44, p < 0,0001, painel a) ao longo do tempo (F30,120 = 3,84, p < 0,0001) ou 5,0 mg/kg de metanfetamina (F4,120 = 78,09, p < 0,0001, painel b) ao longo do tempo (F30,120 = 9,98, p < 0,0001) também foram altamente significativos pela ANOVA de duas vias. Todos os tratamentos com qualquer dose de metanfetamina ± mefedrona foram significativamente diferentes dos respectivos controles (p < 0,0001 para todos os tratamentos).
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Fig. 4
Efeitos da mefedrona na hipertermia induzida por metanfetamina. Os camundongos foram tratados com as doses indicadas de mefedrona (MEPH) 30 minutos antes de cada injeção de 2,5 (a) ou 5,0 mg/kg (b) de metanfetamina (METH). As temperaturas centrais foram medidas em intervalos de 20 minutos por telemetria, começando 60 minutos antes da primeira injeção de metanfetamina. As 4 injeções de metanfetamina são indicadas pelas setas que repousam no eixo x. Os dados são expressos como temperatura corporal média de 6 a 8 camundongos por grupo. Os SEMs foram sempre < 10% da média e são omitidos para fins de clareza.
Efeitos da mefedrona na neurotoxicidade induzida por anfetamina e MDMA
Para testar se os efeitos de aumento da mefedrona sobre a metanfetamina poderiam ser estendidos a outras anfetaminas neurotóxicas, os camundongos foram tratados com essa β-cetoanfetamina (20 mg/kg) mais anfetamina (4X 5 mg/kg) ou MDMA (4X 20 mg/kg) e os resultados são apresentados na Figura 5. Lembre-se de que a mefedrona em si não reduz a DA, DAT ou TH estriatal (Angoa-Perez et al. 2012). O efeito principal da droga (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) foi altamente significativo pela ANOVA unidirecional para reduções de DA (Fig. 5a). Também é possível observar na Fig. 5a que todos os tratamentos com anfetamina (p < 0,001) ou MDMA (p < 0,001) isoladamente ou em combinação com mefedrona (p < 0,0001 para ambas as drogas) reduziram significativamente os níveis de DA em relação ao controle. A mefedrona aumentou significativamente as reduções de DA causadas por anfetamina (p < 0,01) ou MDMA (p < 0,01). A Fig. 5b mostra efeitos semelhantes da combinação de tratamentos com drogas nos níveis de DAT no estriado. O efeito principal da droga (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) foi altamente significativo pela ANOVA unidirecional para DAT. Também pode ser visto na Fig. 5b que todos os tratamentos com anfetamina ou MDMA foram significativamente (p < 0,0001 para todos) menores em comparação com o controle. A mefedrona também aumentou significativamente as reduções de DAT causadas por anfetamina ou MDMA (p < 0,0001 em ambos os casos). Por fim, a Fig. 5c mostra que o efeito principal da droga (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) foi altamente significativo pela ANOVA unidirecional para reduções no TH. Também é possível observar na Fig. 5c que todos os tratamentos com anfetamina ou MDMA foram significativamente (p < 0,0001 para todos) menores em comparação com o controle. A mefedrona também aumentou significativamente as reduções de TH causadas por anfetamina ou MDMA (p < 0,0001 em ambos os casos)
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Fig. 5
Efeitos da mefedrona na neurotoxicidade da terminação nervosa DA induzida por anfetamina ou MDMA. Os camundongos foram tratados com 20 mg/kg de mefedrona (MEPH) 30 minutos antes de cada injeção de 5,0 mg/kg de anfetamina (AMPH) ou 20 mg/kg de MDMA e sacrificados 2d após o tratamento para determinação dos níveis estriatais de (a) DA por HPLC. (b) DAT e (c) TH foram determinados por immunoblotting e os blots foram quantificados usando o ImageJ. Os immunoblots representativos para DAT e TH estão incluídos como inserções nos painéis (b) e (c), respectivamente, e os tratamentos para ambos os painéis são indicados por 1,5: controle; 2,6: MEPH; 3: AMPH; 4: AMPH + MEPH; 7: MDMA; e 8: MDMA + MEPH. Os dados são a média ± SEM para 5-12 camundongos em cada grupo. **p < 0,001 ou ***p < 0,0001 vs. controle e #p < 0,01 ou ###p < 0,0001 vs. AMPH ou MDMA (teste de comparação múltipla de Tukey).
Efeitos da nomifensina na neurotoxicidade induzida pela metanfetamina
A nomifensina, um potente bloqueador de DAT sem abuso conhecido ou potencial neurotóxico, foi testada quanto à sua capacidade de proteção contra a neurotoxicidade induzida pela metanfetamina e quanto ao contraste com as ações da mefedrona sobre a toxicidade das terminações nervosas DA causadas pela metanfetamina, anfetamina e MDMA. Os resultados na Fig. 6a mostram que o efeito principal da droga (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) sobre os níveis de DA foi altamente significativo pela ANOVA unidirecional. A nomifensina isolada não alterou os níveis de DA, mas a redução causada pela metanfetamina (p < 0,0001) foi ligeiramente, mas significativamente, revertida pela nomifensina (p < 0,01). O efeito principal da droga (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) nos níveis de DAT foi altamente significativo pela ANOVA unidirecional, conforme mostrado na Fig. 6b. A nomifensina não alterou os níveis de DAT, mas forneceu proteção significativa (p < 0,001) contra a redução do DAT estriatal causada pela metanfetamina (p < 0,0001) em comparação com o controle. Por fim, a Fig. 6c mostra que o efeito principal da droga (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) nos níveis de TH foi altamente significativo pela ANOVA unidirecional. Como observado para DA e DAT, a redução do TH causada pela metanfetamina (p < 0,0001) foi ligeiramente, mas significativamente, evitada pela nomifensina (p < 0,01).
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Fig. 6
Efeitos da nomifensina na neurotoxicidade da terminação nervosa DA induzida pela metanfetamina. Os camundongos foram tratados com 5,0 mg/kg de nomifensina (NOM) 30 minutos antes de cada injeção de 5,0 mg/kg de metanfetamina (METH) e sacrificados 2 dias depois para a determinação dos níveis estriatais de (a) DA por HPLC. (b) DAT e (c) TH foram determinados por immunoblotting e os blots foram quantificados usando o ImageJ. Os immunoblots representativos para DAT e TH estão incluídos como inserções nos painéis (b) e (c), respectivamente. Os dados são a média mais SEM para 5-7 camundongos por grupo. ***p < 0,0001 vs. controle (C) e #p < 0,01 ou ##p < 0,001 vs. metanfetamina isolada (teste de comparação múltipla de Tukey).
Discussão
O objetivo do presente estudo foi determinar se a mefedrona evitaria a toxicidade da terminação nervosa DA causada pela metanfetamina. Com base em sua semelhança química com a metanfetamina e o MDMA, esperava-se inicialmente que a mefedrona exercesse efeitos prejudiciais sobre o sistema neuronal DA. Entretanto, vários estudos estabeleceram quase simultaneamente que a mefedrona não era tóxica para as terminações nervosas DA (Angoa-Perez et al. 2012, Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011). A questão de saber se essa droga causa danos ao sistema neuronal de 5-HT permanece em aberto. Um estudo relatou reduções persistentes na função da terminação nervosa 5-HT (Hadlock et al. 2011), enquanto outro concluiu que a mefedrona não causou danos (Baumann et al. 2012). A mefedrona interage com a terminação nervosa DA de uma maneira que sugere que ela realmente estimula a liberação e bloqueia a recaptação de DA por meio de suas interações com o DAT. Uma faceta importante do mecanismo de ação neurotóxico da metanfetamina é sua capacidade de obter acesso às terminações nervosas DA por meio do DAT e interromper a homeostase da DA (Sulzer 2011). Se essa etapa inicial da cascata neurotóxica da metanfetamina for evitada pela inibição do DAT, a toxicidade será evitada (Pu et al. 1994, Poth et al. 2012, Marek et al. 1990, Schmidt e Gibb 1985). Pensamos que a mefedrona poderia ter essa mesma propriedade protetora que outros inibidores da DAT, mas, em vez disso, observamos um aumento significativo da toxicidade. Essa interação foi observada usando duas doses diferentes de metanfetamina que causam danos moderados ou graves às terminações nervosas DA (4X 2,5 ou 5,0 mg/kg, respectivamente). Esse efeito potencializador da mefedrona não se restringiu à metanfetamina e se estendeu à anfetamina e ao MDMA, duas drogas que são frequentemente usadas em conjunto com a mefedrona e outras β-cetoanfetaminas (Feyissa e Kelly 2008, Schifano et al. 2011, Kelly 2011). Portanto, apesar do fato de a mefedrona não causar toxicidade pelo menos nas terminações nervosas DA do estriado, ela potencializa os efeitos neurotóxicos de outras drogas de abuso. Esse novo achado deve colocar o abuso de mefedrona em termos ainda mais severos, pois sua falta de neurotoxicidade intrínseca pode fazer com que ela pareça inócua.
A hipertermia é um efeito adverso agudo comumente relatado da ingestão de metanfetamina (Greene et al. 2008) e β-cetoanfetamina em humanos (Borek e Holstege 2012, Prosser e Nelson 2012). Assim como a metanfetamina, muitas das drogas β-cetoanfetaminas também causam elevações significativas na temperatura central em roedores (Angoa-Perez et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Rockhold et al. 1997). Embora a hipertermia causada pela metanfetamina possa contribuir para seus efeitos prejudiciais morfológicos e neuronais, não é necessariamente o caso de a hipertermia ser a causa direta desses efeitos (Kiyatkin e Sharma 2009). Registramos as temperaturas corporais centrais em camundongos tratados com mefedrona e metanfetamina e observamos que o tratamento combinado não aumentou as temperaturas além dos aumentos máximos observados após o uso isolado de qualquer uma das drogas. A metanfetamina causou um aumento na temperatura corporal relacionado à dose e essa hipertermia foi invariável em toda a faixa de dose de mefedrona testada. De fato, a queda pós-injeção na temperatura corporal observada após o tratamento com mefedrona (Angoa-Perez et al. 2012) foi mantida em doses mais altas de mefedrona mais metanfetamina. Embora a hipertermia induzida pela droga não tenha sido aumentada pelo tratamento com drogas combinadas, os efeitos neurotóxicos foram aditivos. Portanto, pelo menos no presente caso, parece que os efeitos neurotóxicos da metanfetamina podem ser aumentados pela mefedrona de uma maneira que independe da hipertermia.
A mefedrona inibe claramente a função DAT e bloqueia a recaptação de DA in vitro (Lopez-Arnau et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Kehr et al. 2011, Martinez-Clemente et al. 2012, Cozzi et al. 1999). A mefedrona desloca o WIN-35,428 de seu local de ligação no DAT, sugerindo que é um inibidor competitivo da captação de DA (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). A potência da mefedrona nesse aspecto é muito semelhante à da metanfetamina (Cozzi et al. 1999) e da MDMA (Escubedo et al. 2011). Não se sabe se a mefedrona é transportada pelo DAT, mas a metcatinona é (Cozzi e Foley 2003). A nomifensina e o ácido anfonélico, que se ligam ao DAT e inibem a captação de DA, proporcionam proteção substancial contra a neurotoxicidade induzida pela metanfetamina (Pu et al. 1994, Marek et al. 1990, Schmidt e Gibb 1985, Poth et al. 2012) e os camundongos sem o DAT são resistentes à toxicidade neuronal da metanfetamina (Fumagalli et al. 1998). O fato de a mefedrona não ser neurotóxica e ser um bloqueador da DAT leva à previsão de que ela deve evitar a toxicidade. Testamos a nomifensina nesse sentido como um controle positivo e confirmamos que ela protege contra a depleção de DA, DAT e TH induzida pela metanfetamina. A nomifensina também inibe o transportador de norepinefrina (Brogden et al. 1979), mas essa propriedade não pode explicar os resultados atuais porque a maioria das β-cetoanfetaminas, incluindo a mefedrona, inibe o transportador de norepinefrina e bloqueia a captação de norepinefrina (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). Uma função para o sistema neuronal 5-HT em algumas das ações farmacológicas da mefedrona é possível à luz da capacidade dessa droga, como o MDMA (Yamamoto et al. 1995), de causar efluxo de DA estriatal por meio de suas interações com os receptores 5-HT2A (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). A hiperlocomoção causada pela mefedrona depende da 5-HT endógena (Lopez-Arnau et al. 2012) e essa droga também estimula a liberação de 5-HT e inibe sua captação in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) e in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). No entanto, podemos descartar uma função para a 5-HT endógena na neurotoxicidade da DA, pelo menos da metanfetamina, demonstrando que os camundongos geneticamente depletados de 5-HT mantêm sua sensibilidade à neurotoxicidade (Thomas et al. 2010).
A mefedrona poderia aumentar a neurotoxicidade da metanfetamina por vários mecanismos possíveis. Primeiro, a mefedrona poderia interagir com o VMAT para causar vazamento de DA no citoplasma da terminação nervosa pré-sináptica. Os tratamentos que aumentam o pool citoplasmático (ou seja, liberável pela droga) de DA aumentam a neurotoxicidade da metanfetamina (Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009, Schmidt et al. 1985). Esse mecanismo não é provável porque a metcatinona interage apenas fracamente com o VMAT (Cozzi et al. 1999). Em segundo lugar, a combinação de mefedrona e metanfetamina poderia ter um efeito sinérgico na liberação não vesicular de DA, mas essa possibilidade também parece improvável à luz dos resultados que mostram que o tratamento de células CHO que expressam DAT ou SERT com metilona e metanfetamina não tem um efeito aditivo na liberação de DA ou 5-HT (Sogawa et al. 2011). Em terceiro lugar, a mefedrona poderia interagir com o DAT de uma nova maneira que contribui para a toxicidade aditiva. Foi demonstrado que a metilona em combinação com a metanfetamina causa citotoxicidade sinérgica em células CHO que expressam o DAT ou SERT, mas não em células CHO do tipo selvagem que não possuem os transportadores (Sogawa et al. 2011). A citotoxicidade observada em células cultivadas nesses estudos (ou seja, liberação de LDH) é muito diferente do dano às terminações nervosas DA causado pela metanfetamina, mas esse mecanismo sugere uma função interessante, porém indefinida, para o DAT na citotoxicidade aumentada. Por fim, a mefedrona pode alterar o metabolismo da metanfetamina. A mefedrona é metabolizada principalmente por N-desmetilação (Meyer e Maurer 2010), assim como a metanfetamina e o MDMA (Caldwell 1976). O suporte para esse mecanismo vem da demonstração de que a metanfetamina e o MDMA inibem mutuamente a produção de seus respectivos metabólitos primários e elevam os níveis plasmáticos da droga acima daqueles observados após a administração de qualquer uma das drogas isoladamente (Kuwayama et al. 2012). As doses de mefedrona usadas no presente estudo e em nosso estudo anterior (Angoa-Perez et al. 2012), embora altas, não são neurotóxicas e se enquadram na faixa de uso abusivo por seres humanos (McErath e O'Neill 2011). Portanto, a mefedrona poderia estar agindo como o MDMA para aumentar os níveis plasmáticos de metanfetamina inibindo seu metabolismo. Será necessária uma análise farmacocinética detalhada para confirmar essa última possibilidade.
O abuso das β-cetoanfetaminas está aumentando em um ritmo alarmante e a mefedrona é agora uma das drogas mais comumente usadas, depois da maconha, MDMA e cocaína (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Além disso, a mefedrona induz sentimentos mais fortes de desejo em humanos em comparação com o MDMA (Brunt et al. 2011) e os usuários que cheiram a mefedrona a classificam como mais viciante do que a cocaína (Winstock et al. 2011b). A mefedrona é consumida por seres humanos de forma semelhante a uma farra (ou seja, "empilhamento") e é frequentemente consumida com outras drogas, como a maconha e os psicoestimulantes anfetamínicos (Schifano et al. 2011, Fass et al. 2012, Winstock et al. 2011a, Kelly 2011, Torrance e Cooper 2010). A mefedrona é cada vez mais encontrada em comprimidos vendidos como MDMA (Brunt et al. 2011) e seu uso provavelmente ultrapassará o do MDMA, já que a pureza dessa última droga continua a cair (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Com base nos padrões comuns de abuso da mefedrona e de outros ingredientes dos "sais de banho", é importante considerar se há riscos adicionais à saúde dos seres humanos quando essas drogas são combinadas com as anfetaminas de forma intencional ou não. Nossos resultados, que mostram que pelo menos a mefedrona aumenta significativamente a neurotoxicidade das terminações nervosas DA do estriado causada pela metanfetamina, anfetamina e MDMA, revelam uma propriedade particularmente perigosa e inesperada dessa β-cetoanfetamina.
Abreviações usadas
5-HT serotonina
DA dopamina
DAT transportador de DA
MDMA 3,4-metilenodioximetanfetamina
TH tirosina hidroxilase
VMAT transportador de monoamina vesicular
