As tecnologias genéticas, que irromperam na vida humana no final do século passado, mudaram o nosso mundo de tal forma que já é inimaginável sem elas. Há décadas que a identificação genética é utilizada como um método rápido e relativamente barato que permite encontrar criminosos e resolver os seus actos sem sair do laboratório. Como farmacologista de formação, interesso-me muito pela genética e estou ansioso por estudar este domínio nos seus vários aspectos. Nesta publicação, apresento-lhe as abordagens genéticas clássicas no domínio forense.
Um pouco de história ou o que é que isso tem a ver com cavaleiros?
Há 150 anos, Johannes Friedrich Miescher descobriu os ácidos nucleicos, um conceito que acabou por virar o mundo de pernas para o ar [1]. Em meados do século XX, tornou-se claro que o ADN e o ARN eram portadores de informação hereditária; em seguida, a sua estrutura foi descrita e, um pouco mais tarde, apareceram numerosos métodos que permitiam "cortar" estas moléculas in vitro utilizando enzimas celulares - restrictases [2]; amplificá-las utilizando PCR [3]; e até ler a sequência de genes e genomas específicos utilizando múltiplos métodos de sequenciação [4].
Inicialmente, o trabalho com material genético era efectuado literalmente "na cozinha" e nem sempre podia ser reproduzido, mesmo no laboratório científico vizinho. Mas o tempo passou, as abordagens mudaram e os métodos foram estandardizados a tal ponto que foram gradualmente introduzidos na investigação aplicada e mesmo na produção biotecnológica.
Em 1984, a comunidade científica foi agitada pela notícia de que cientistas conseguiram isolar e ler um fragmento de DNA da zebra de Burchell, que está extinta e sobrevive apenas em colecções de museus [5]. Um ano mais tarde, o geneticista sueco Svante Pääbo confirmou a possibilidade de utilizar material museológico e arqueológico para investigação científica fundamental, tendo analisado pela primeira vez o material genético de múmias egípcias. Anos mais tarde, verificou-se que as amostras que analisou estavam contaminadas com material genético moderno [6], mas o desenvolvimento de métodos de sequenciação permitiu ainda trabalhar com quantidades mínimas de ADN mal preservado.
Os cientistas forenses também se interessaram pelas novas técnicas de análise de material genético. O facto é que os métodos de datiloscopia clássica e de análise de grupos sanguíneos, que eram habituais na altura, tinham as suas limitações e, em alguns casos, falharam.
Em 1984, o cientista britânico Sir Alec John Jeffreys (Figura 3) desenvolveu e apresentou um método de identificação de uma pessoa utilizando o seu material genético. Mais tarde, esta abordagem foi designada por identificação por ADN, conquistando o amor e o respeito dos criminologistas de todo o mundo. Jeffreys foi nomeado cavaleiro pelo seu trabalho.
Um pouco de história ou o que é que isso tem a ver com cavaleiros?
Há 150 anos, Johannes Friedrich Miescher descobriu os ácidos nucleicos, um conceito que acabou por virar o mundo de pernas para o ar [1]. Em meados do século XX, tornou-se claro que o ADN e o ARN eram portadores de informação hereditária; em seguida, a sua estrutura foi descrita e, um pouco mais tarde, apareceram numerosos métodos que permitiam "cortar" estas moléculas in vitro utilizando enzimas celulares - restrictases [2]; amplificá-las utilizando PCR [3]; e até ler a sequência de genes e genomas específicos utilizando múltiplos métodos de sequenciação [4].
Inicialmente, o trabalho com material genético era efectuado literalmente "na cozinha" e nem sempre podia ser reproduzido, mesmo no laboratório científico vizinho. Mas o tempo passou, as abordagens mudaram e os métodos foram estandardizados a tal ponto que foram gradualmente introduzidos na investigação aplicada e mesmo na produção biotecnológica.
Em 1984, a comunidade científica foi agitada pela notícia de que cientistas conseguiram isolar e ler um fragmento de DNA da zebra de Burchell, que está extinta e sobrevive apenas em colecções de museus [5]. Um ano mais tarde, o geneticista sueco Svante Pääbo confirmou a possibilidade de utilizar material museológico e arqueológico para investigação científica fundamental, tendo analisado pela primeira vez o material genético de múmias egípcias. Anos mais tarde, verificou-se que as amostras que analisou estavam contaminadas com material genético moderno [6], mas o desenvolvimento de métodos de sequenciação permitiu ainda trabalhar com quantidades mínimas de ADN mal preservado.
Os cientistas forenses também se interessaram pelas novas técnicas de análise de material genético. O facto é que os métodos de datiloscopia clássica e de análise de grupos sanguíneos, que eram habituais na altura, tinham as suas limitações e, em alguns casos, falharam.
Em 1984, o cientista britânico Sir Alec John Jeffreys (Figura 3) desenvolveu e apresentou um método de identificação de uma pessoa utilizando o seu material genético. Mais tarde, esta abordagem foi designada por identificação por ADN, conquistando o amor e o respeito dos criminologistas de todo o mundo. Jeffreys foi nomeado cavaleiro pelo seu trabalho.
Dactiloscopia de ADN: vantagens e desvantagens
A análise genética de amostras biológicas obtidas em locais de crime simplificou consideravelmente o trabalho dos investigadores. Estes dispõem agora de um instrumento fiável para identificar o autor ou a vítima, obter provas incontestáveis e resolver crimes.
As principais vantagens da datiloscopia genética são a capacidade de trabalhar mesmo com pequenas quantidades de material biológico e a elevada precisão que permite identificar um indivíduo - se todos os requisitos para a análise forem cumpridos, a sua fiabilidade é superior a 99%. Esta abordagem tornou-se uma das mais importantes na investigação de crimes [7].
É importante notar que os métodos clássicos de datiloscopia do ADN não permitem identificar gémeos idênticos cujo perfil genético seja o mesmo, uma vez que são formados a partir do mesmo óvulo fertilizado.
Para a análise do ADN, em primeiro lugar, é necessário o próprio DnA, mas nem sempre é possível extrair material genético de alta qualidade de amostras biológicas que foram expostas a factores químicos e térmicos. Uma vez no ambiente, esta molécula entra em reacções químicas, é destruída (fragmentada) e modificada, embora em condições favoráveis possa persistir durante milhares de anos [8].
Sabe-se que o material genético mais antigo dos antepassados humanos foi extraído dos restos ósseos dos nossos parentes humanóides que viveram no território da Península Ibérica (Serra de Atapuerca) há cerca de 430 mil anos [9]. O microclima específico de algumas grutas, com baixos valores de humidade e temperatura, aumenta significativamente o tempo de vida do material genético. No entanto, o ADN nas amostras encontradas no local do crime está frequentemente representado em quantidades mínimas e, tal como nas amostras arqueológicas, está gravemente degradado.
Na Europa e nos Estados Unidos, chama-se a atenção para outra desvantagem da recolha de impressões digitais genéticas, relacionada com a interferência na privacidade de uma pessoa e a violação da privacidade.
Os activistas dos direitos humanos receiam que a informação genética de criminosos e suspeitos de crimes possa cair nas mãos de terceiros e ser depois utilizada indevidamente [10]. Por exemplo, são já conhecidos casos de utilização de informação genética para controlar minorias muçulmanas na província chinesa de Xinjiang.
Os EUA também estão a planear recolher sistematicamente perfis de ADN de imigrantes sob custódia federal [11]. Obviamente, os receios dos activistas dos direitos humanos não são infundados e têm fundamentos reais.
As principais vantagens da datiloscopia genética são a capacidade de trabalhar mesmo com pequenas quantidades de material biológico e a elevada precisão que permite identificar um indivíduo - se todos os requisitos para a análise forem cumpridos, a sua fiabilidade é superior a 99%. Esta abordagem tornou-se uma das mais importantes na investigação de crimes [7].
É importante notar que os métodos clássicos de datiloscopia do ADN não permitem identificar gémeos idênticos cujo perfil genético seja o mesmo, uma vez que são formados a partir do mesmo óvulo fertilizado.
Para a análise do ADN, em primeiro lugar, é necessário o próprio DnA, mas nem sempre é possível extrair material genético de alta qualidade de amostras biológicas que foram expostas a factores químicos e térmicos. Uma vez no ambiente, esta molécula entra em reacções químicas, é destruída (fragmentada) e modificada, embora em condições favoráveis possa persistir durante milhares de anos [8].
Sabe-se que o material genético mais antigo dos antepassados humanos foi extraído dos restos ósseos dos nossos parentes humanóides que viveram no território da Península Ibérica (Serra de Atapuerca) há cerca de 430 mil anos [9]. O microclima específico de algumas grutas, com baixos valores de humidade e temperatura, aumenta significativamente o tempo de vida do material genético. No entanto, o ADN nas amostras encontradas no local do crime está frequentemente representado em quantidades mínimas e, tal como nas amostras arqueológicas, está gravemente degradado.
Na Europa e nos Estados Unidos, chama-se a atenção para outra desvantagem da recolha de impressões digitais genéticas, relacionada com a interferência na privacidade de uma pessoa e a violação da privacidade.
Os activistas dos direitos humanos receiam que a informação genética de criminosos e suspeitos de crimes possa cair nas mãos de terceiros e ser depois utilizada indevidamente [10]. Por exemplo, são já conhecidos casos de utilização de informação genética para controlar minorias muçulmanas na província chinesa de Xinjiang.
Os EUA também estão a planear recolher sistematicamente perfis de ADN de imigrantes sob custódia federal [11]. Obviamente, os receios dos activistas dos direitos humanos não são infundados e têm fundamentos reais.
Como funciona
Os métodos de datiloscopia de ADN baseiam-se na variabilidade genética humana. As substituições de nucleótidos no ADN (dependendo da frequência na população, são também chamadas polimorfismos ou mutações do ADN) tornam-nos individualmente diferentes. E estas diferenças podem ser encontradas tanto no genoma nuclear como no genoma mitocondrial, pequenas moléculas circulares de ADN que regulam o funcionamento das mitocôndrias, as "fábricas" de energia das células.
É de salientar que os polimorfismos de ADN podem ser encontrados no genoma de cada um de nós - tornam-se o nosso código de barras de ADN único. Alguns deles podem causar doenças graves [12], mas na maioria dos casos não têm qualquer efeito nas nossas funções vitais.
Os métodos modernos de datiloscopia do ADN utilizam uma variedade de variantes genéticas em diferentes regiões do genoma. Por exemplo, a análise de repetições em tandem - sequências genómicas curtas e repetitivas cujo número difere em dois indivíduos amostrados aleatoriamente [13] - permite fazer um teste de paternidade claro ou encontrar provas adicionais contra um suspeito de crime.
Os marcadores de ADN do cromossoma Y podem ser utilizados para determinar o sexo de uma pessoa. Os marcadores genéticos fornecem informações sobre a etnia dos familiares de um indivíduo, a cor dos olhos ou do cabelo.
Além disso, a informação epigenética (por exemplo, a metilação do ADN) permite estimar a idade biológica de células individuais, tecidos e do organismo como um todo [14]. Neste artigo, falarei mais sobre os métodos de análise genética acima referidos. E a utilização de métodos epigenéticos no sector dos medicamentos será o tema da minha próxima publicação.
Os marcadores de ADN do cromossoma Y podem ser utilizados para determinar o sexo de uma pessoa. Os marcadores genéticos fornecem informações sobre a etnia dos familiares de um indivíduo, a cor dos olhos ou do cabelo.
Além disso, a informação epigenética (por exemplo, a metilação do ADN) permite estimar a idade biológica de células individuais, tecidos e do organismo como um todo [14]. Neste artigo, falarei mais sobre os métodos de análise genética acima referidos. E a utilização de métodos epigenéticos no sector dos medicamentos será o tema da minha próxima publicação.
Recolha e isolamento de ADN a partir de material biológico
A extração e análise de ADN a partir de amostras forenses é, à primeira vista, comparável à arte. Por vezes, é impossível imaginar que algumas gotas de sangue ou um pedaço de pele sob as unhas de uma vítima se possam tornar a prova mais importante numa investigação criminal.
De facto, as acções dos especialistas forenses no local do crime são afinadas e seguem um único cenário, sendo um dos principais objectivos encontrar material biológico adequado para a extração de ADN. Qualquer tecido biológico e secreções humanas podem ser utilizados para este fim .
- Restos de ossos
- Dentes
- Folículos capilares
- Sangue
- Células epiteliais
- Suor
- Saliva
- Amostras de esperma
- Excrementos, etc.
O material biológico no armazém de provas pode durar décadas. Muitas vezes, o examinador apenas retira uma parte do material para exame, a quantidade necessária para a extração de ADN. Por exemplo, se houver vestígios de sangue na faca, o perito não lava todo o sangue, mas faz um pequeno enxaguamento imediatamente antes da extração do ADN. Isto deixa vestígios na faca, que podem ser utilizados para efetuar um novo exame várias décadas mais tarde.
No núcleo da célula, o ADN está em contacto estreito com numerosas moléculas orgânicas necessárias ao seu funcionamento eficaz. No entanto, para a análise genética, os hidratos de carbono, os lípidos e as proteínas devem ser removidos da amostra de teste, o que pode reduzir a eficiência dos métodos utilizados e, consequentemente, afetar a solvabilidade dos crimes.A extração de ADN demora pouco tempo graças a uma variedade de kits e sistemas comerciais especificamente concebidos para a extração de ácidos nucleicos (por exemplo, o AutoMate Express DNA Extraction System da Thermo Fisher Scientific). Além disso, nos grandes centros forenses com milhares de análises por dia, este processo é totalmente automatizado e realizado com a participação de robôs sob a supervisão de um operador.
Aliás, os sistemas robóticos são amplamente utilizados não só nos laboratórios forenses, mas também em muitos centros médicos e biotecnológicos, permitindo acelerar o processo, reduzir o custo do trabalho e diminuir significativamente a possibilidade de erro.
Após a extração, o ADN é dissolvido num composto especial, onde pode ser armazenado durante anos (a -20°C ou -80°C), se necessário.
Análise genética
Imediatamente após a extração de DnA, um especialista é confrontado com a questão de outras formas de o analisar. Desde a introdução da identificação de ADN na investigação forense, as técnicas de biologia molecular mudaram tanto que existem diversas variantes possíveis. A nossa próxima história irá destacar as várias técnicas de análise de ADN que os peritos forenses utilizam na sua prática.
Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (análise RFLP)
A análise RFLP é, historicamente, um dos primeiros métodos de identificação do ADN. Baseia-se na utilização de enzimas celulares especiais, as restrictases. As enzimas de restrição podem reconhecer determinados locais numa molécula de ácido nucleico e cortá-la através desses locais. Até à data, foram descritos vários milhares de enzimas deste tipo. Após o corte da molécula de DnA com enzimas de restrição, os comprimentos dos fragmentos obtidos são avaliados por eletroforese em gel (Figura 9).
Imediatamente após a extração de DnA, um especialista é confrontado com a questão de outras formas de o analisar. Desde a introdução da identificação de ADN na investigação forense, as técnicas de biologia molecular mudaram tanto que existem diversas variantes possíveis. A nossa próxima história irá destacar as várias técnicas de análise de ADN que os peritos forenses utilizam na sua prática.
Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (análise RFLP)
A análise RFLP é, historicamente, um dos primeiros métodos de identificação do ADN. Baseia-se na utilização de enzimas celulares especiais, as restrictases. As enzimas de restrição podem reconhecer determinados locais numa molécula de ácido nucleico e cortá-la através desses locais. Até à data, foram descritos vários milhares de enzimas deste tipo. Após o corte da molécula de DnA com enzimas de restrição, os comprimentos dos fragmentos obtidos são avaliados por eletroforese em gel (Figura 9).
Uma vez que não existem genomas humanos completamente idênticos (exceto no caso de gémeos idênticos), a diferença ou semelhança nos perfis de comprimento dos fragmentos de ADN resultantes pode ser um bom marcador tanto para a identificação pessoal como para a determinação do parentesco.
No entanto, este método envolve a fragmentação do ADN, pelo que é sensível à qualidade e quantidade do material genético original. É por esta razão que a análise RFLP não é atualmente utilizada na prática - ao contrário de outros métodos, que serão discutidos mais adiante.
Análise do número de repetições em tandem no genoma
As repetições em tandem são cópias da mesma sequência curta de DnA repetidas uma após a outra [15]. As repetições que interessam aos cientistas forenses incluem loci com um número variável de repetições em tandem (VNTR) e repetições curtas em tandem (STR). São também designados por minissatélites e microssatélites, respetivamente.
A essência deste método consiste na amplificação por PCR de fragmentos de ADN que contêm estas sequências repetitivas curtas, cujos comprimentos são diferentes em dois indivíduos amostrados aleatoriamente. Após a amplificação, o comprimento dos fragmentos obtidos é avaliado através de eletroforese em gel ou eletroforese capilar.
O Quantifiler DNA Quantification Kit e o sistema QuantStudio da Termo Fisher Scientific podem ser utilizados para este fim. O QuantStudio é um instrumento compacto de bancada com uma vasta gama de funcionalidades.
Tal como no método anterior, o principal fator de identificação do ensaio STR é o comprimento dos fragmentos obtidos, que é único para cada indivíduo e depende do número de repetições no local analisado. A análise STR caracteriza-se por uma elevada precisão e rapidez, bem como por um baixo custo. A qualidade do material genético é uma condição importante para a análise.
No entanto, este método envolve a fragmentação do ADN, pelo que é sensível à qualidade e quantidade do material genético original. É por esta razão que a análise RFLP não é atualmente utilizada na prática - ao contrário de outros métodos, que serão discutidos mais adiante.
Análise do número de repetições em tandem no genoma
As repetições em tandem são cópias da mesma sequência curta de DnA repetidas uma após a outra [15]. As repetições que interessam aos cientistas forenses incluem loci com um número variável de repetições em tandem (VNTR) e repetições curtas em tandem (STR). São também designados por minissatélites e microssatélites, respetivamente.
A essência deste método consiste na amplificação por PCR de fragmentos de ADN que contêm estas sequências repetitivas curtas, cujos comprimentos são diferentes em dois indivíduos amostrados aleatoriamente. Após a amplificação, o comprimento dos fragmentos obtidos é avaliado através de eletroforese em gel ou eletroforese capilar.
O Quantifiler DNA Quantification Kit e o sistema QuantStudio da Termo Fisher Scientific podem ser utilizados para este fim. O QuantStudio é um instrumento compacto de bancada com uma vasta gama de funcionalidades.
Tal como no método anterior, o principal fator de identificação do ensaio STR é o comprimento dos fragmentos obtidos, que é único para cada indivíduo e depende do número de repetições no local analisado. A análise STR caracteriza-se por uma elevada precisão e rapidez, bem como por um baixo custo. A qualidade do material genético é uma condição importante para a análise.
A análise de STR surgiu na prática forense há quase vinte anos, mas até hoje continua a ser o principal método de identificação de indivíduos. Os resultados da análise do ADN de suspeitos e criminosos - perfis genéticos - são introduzidos pelos criminologistas em bases de dados especiais.
Por conseguinte, quando são encontrados vestígios biológicos em locais de crime a partir dos quais se pode isolar o ADN, tornou-se possível identificar todas as pessoas que já chegaram ao conhecimento das autoridades policiais. Os mesmos marcadores são utilizados na procura de pessoas desaparecidas e para determinar a paternidade.
Por conseguinte, quando são encontrados vestígios biológicos em locais de crime a partir dos quais se pode isolar o ADN, tornou-se possível identificar todas as pessoas que já chegaram ao conhecimento das autoridades policiais. Os mesmos marcadores são utilizados na procura de pessoas desaparecidas e para determinar a paternidade.
Regra geral, os sistemas destinados a identificar indivíduos permitem a análise de vários loci do genoma (10-24) em simultâneo, incluindo o gene da proteína amelogenina, através do qual se determina o sexo. O gene da amelogenina encontra-se tanto no cromossoma X como no Y, mas difere em tamanho, o que permite determinar o sexo de uma pessoa.
Graças à utilização de tecnologias de sequenciação de elevado rendimento, a medicina legal obteve uma ferramenta eficaz que abriu novas oportunidades para a análise simultânea de múltiplos locais (loci) dos genomas nuclear e mitocondrial.
Uma vantagem importante destes métodos é a capacidade de distinguir até gémeos idênticos (por mutações somáticas), o que é impossível com a análise RFLP ou STR.
Graças à utilização de tecnologias de sequenciação de elevado rendimento, a medicina legal obteve uma ferramenta eficaz que abriu novas oportunidades para a análise simultânea de múltiplos locais (loci) dos genomas nuclear e mitocondrial.
Uma vantagem importante destes métodos é a capacidade de distinguir até gémeos idênticos (por mutações somáticas), o que é impossível com a análise RFLP ou STR.
A segunda parte desta publicação descreverá a forma como os métodos acima descritos podem ser utilizados para identificar laboratórios de droga e traficantes de droga, e como pode confundir a investigação forense limpando os seus rastos.
Ler a PARTE II
