Resumo.
A realização de um estudo dos efeitos pró-inflamatórios da mefedrona e a identificação das suas características etológicas são uma etapa obrigatória na investigação do 4-MMC, que é considerado uma das substâncias psicoactivas mais populares em termos de utilização recreativa. A administração, o transporte e a concentração da mefedrona nos seus tecidos-alvo dependem não só da dose administrada, mas também de uma série de outros factores - a distribuição da substância, o grau e a velocidade de absorção, a via do metabolismo e a excreção. Ao longo do estudo, é importante determinar a proporção da substância distribuída nos tecidos-alvo ou nos fluidos biológicos com os quais é transportada, para que se possa descobrir qual a parte da substância administrada que sofre biotransformação e qual a parte que entra inalterada na circulação sanguínea sistémica. Além disso, na fase dos ensaios pré-clínicos, para além do estudo dos principais mecanismos de ação, é necessário um vasto rastreio fenotípico, necessário para uma compreensão aprofundada da farmacodinâmica e dos efeitos secundários da substância. Um dos aspectos importantes desse rastreio é o estudo das propriedades psicoactivas da substância.
Objectivos do estudo.
1. Determinar os padrões cognitivos, motivacionais e comportamentais em ratos aos quais foi administrada 4-metilmetacatinona.
2. Estudar a função endotelial através da realização de testes farmacológicos vasculares utilizando o bloqueio da síntese de NO sob o controlo por ultra-sons da velocidade do fluxo sanguíneo na artéria femoral do rato e a monitorização por fluxometria laser Doppler da hemodinâmica geral e da velocidade da microcirculação no músculo medial.
3. Identificar e avaliar as actividades pró-inflamatórias e imunorreguladoras da 4-metilmetacinona utilizando o modelo de edema da pata induzido pela formalina e o teste NBT.
Materiais e métodos.
O estudo foi efectuado em 40 ratos Wistar machos com um peso de 180-200 g. Foram identificados 4 grupos: 1) Grupo de controlo (ratos intactos); 2) Ratos aos quais foi administrada mefedrona por via intraperitoneal de 48 em 48 horas, na dose de 5 mg/kg dissolvida numa solução de NaCl 0,9 (0,5 ml). 3) Administração de mefedrona por via oral (através de um tubo) a ratos, de 48 em 48 horas, numa dose de 5 mg/kg dissolvida numa solução de NaCl 0,9 (0,5 ml). 4) Ratos aos quais foi administrada mefedrona por via intraperitoneal, de 48 em 48 horas, numa dose de 5 mg/kg dissolvida em solução de NaCl 0,9 (0,5 ml) antes da administração de formalina para o modelo de edema da pata induzido por formalina.
Descrição e discussão do estudo.
Determinação dos padrões cognitivos, motivacionais e comportamentais em ratos aos quais foi administrada 4-metilmetcatinona. Para atingir este objetivo, foram formulados os seguintes objectivos: avaliar a influência da 4-metilmetcatinona no nível de excitação, ansiedade e resistência ao stress em ratos. Para determinar o estado psicoemocional dos animais estudados, utilizámos um protocolo de teste de Hall atualizado, que consiste em colocar um objeto numa arena padronizada e registar indicadores de atividade utilizando o complexo de software e hardware PANLAB Harvard Apparatus. Os actos comportamentais discretos registados com o complexo de software e hardware foram seleccionados como unidades de avaliação.
O estudo foi efectuado em 30 ratos (Grupos 1, 2 e 3, respetivamente). Antes da experiência, os animais foram mantidos num viveiro de laboratório com 10 indivíduos numa gaiola, com um regime de 12 horas não convertido, a uma temperatura ambiente de 22-24 °C e humidade de 60%, com uma dieta padrão. As experiências foram efectuadas no verão. Os resultados obtidos foram verificados quanto à normalidade da distribuição utilizando o critério de Shapiro-Wilk e processados por métodos de estatística variacional utilizando o teste t de Student e o pacote de software STATISTICA. A figura mostra esquematicamente o desenho da experiência. A atividade horizontal, a reação de grooming, a atividade de procura, a atividade locomotora, a micção e a defecação foram registadas para avaliar o comportamento exploratório. A experiência foi realizada numa sala escura, isolada do ruído externo e da luz solar, no período de 10 a 14 horas. O campo aberto era uma área quadrada de 150x150 cm de tamanho com lados de 30 cm de altura. A temperatura da sala foi mantida a 23 graus Celsius. Após cada animal, o campo aberto era higienizado para desodorização. Antes do estudo de cada grupo, um animal zero foi solto no campo aberto.
No 21º dia, os ratos foram retirados da experiência. Após a anestesia dos ratos, foi feito o isolamento da artéria carótida direita numa plataforma fixa, o músculo medial da coxa foi exposto e a veia femoral esquerda foi cateterizada. O estudo multicomponente dos parâmetros hemodinâmicos foi investigado pelo método de testes de provocação especializados envolvendo a administração de acetilcolina e nitroprussiato de sódio (NO) no cateter femoral. Os parâmetros (pressão arterial sistólica, pressão arterial diastólica, frequência cardíaca) foram registados utilizando um sensor TDS. O sensor foi instalado no terço médio da artéria femoral direita e foram registados os seguintes indicadores: velocidade máxima sistólica (VS) e diastólica (VD), velocidade média (QAs) e volumétrica (QAM) do fluxo sanguíneo, índice de pulsação (PL, índice de Gosling) e índice de resistividade (RI, índice de Pourcelot). Para medir a velocidade das células sanguíneas nos vasos do leito microcirculatório, foi utilizado um sensor-sonda em forma de agulha, que foi colocado no terço inferior do músculo vasto medial da coxa. Foram injectados agentes vasoactivos (acetilcolina - 40 mcg/kg, nitroprussiato de sódio - 30 mcg/ kg) através de um cateter inserido na veia femoral esquerda, sequencialmente em intervalos de 15 minutos. Desta forma, houve a possibilidade de monitorização paralela dos parâmetros hemodinâmicos e da microcirculação num sistema de três níveis (circulação central - sistema vascular elástico - sistema vascular periférico). O tratamento estatístico dos resultados foi efectuado com recurso ao software STATISTICA 10. De seguida, foi calculado o coeficiente de disfunção endotelial (QED). A análise estatística foi efectuada através do teste de Spearman, o cálculo da fiabilidade entre os grupos foi efectuado através do teste paramétrico t de Student.
Os diagramas apresentados mostram que a influência da mefedrona no comportamento animal corresponde aos seus principais efeitos, associados ao seu mecanismo de ação conhecido. Assim, o diagrama 1 ilustra um aumento significativo da atividade motora horizontal em comparação com o grupo de controlo. O diagrama 2 mostra que os actos de grooming são significativamente reduzidos. Este fenómeno é causado por uma diminuição da influência motivacional em relação à necessidade atual. O diagrama 3 mostra claramente um aumento dos actos de defecação e de micção, que é um dos efeitos frequentes da ingestão de 4-mmc. Um aumento da atividade horizontal pode indicar efeitos ansiolíticos, ansiogénicos, de agitação ou um aumento da atividade motora sem componente emocional (excitação motora). As reacções de grooming podem também ser interpretadas de forma ambígua, uma vez que a frequência dos actos de grooming aumenta tanto num ambiente stressante como num ambiente favorável. As manifestações da atividade exploratória, bem como a frequência das micções e defecações, podem ser interpretadas de forma mais inequívoca. Utilizando este algoritmo, pode concluir-se que o efeito farmacodinâmico relativo a uma maior atividade nervosa pode ser interpretado como uma excitação motora com uma componente emocional.
O grupo de controlo demonstrou o mesmo tipo de respostas à introdução de ACH e NO, que se manifestaram por uma diminuição da pressão arterial sistólica, diastólica e média, uma diminuição da velocidade linear da microcirculação, bem como da velocidade diastólica do movimento sanguíneo na artéria femoral (doravante FA), (indicadores de dados - Vd, Vad); 2) um aumento da velocidade sistólica do movimento sanguíneo na FA (VS, Vas), os índices de Purcello e Gosling. Os parâmetros voltaram aos seus valores originais no espaço de 2 minutos.
O tratamento estatístico posterior foi efectuado através da determinação de um número de valores ao longo do tempo para cada amostra, que foram expressos em percentagem. O critério de Spearman, que foi utilizado para a análise estatística, mostrou a melhor expressão da diferença necessária nos parâmetros estatisticamente importantes. O maior grau de correlação (p<0,05) foi determinado entre o índice de pressão arterial média (doravante designado por MAD), a velocidade linear da microcirculação, a velocidade sistólica e a diferença de velocidade sistólica-diastólica da artéria femoral. Outros parâmetros ecográficos demonstraram uma correlação baixa e menos fiável com a dinâmica da pressão arterial e a velocidade da microcirculação. O estudo do 4-mmc administrado por via oral revelou um aumento estatisticamente significativo dos indicadores de SAD, DAD e do coeficiente de disfunção endotelial (QED) em comparação com o grupo de controlo. Os indicadores da velocidade sistólica máxima (VS) e da velocidade diastólica máxima (VD) são significativamente reduzidos durante os testes de provocação nos ratos do Grupo 3, nos quais a mefedrona foi administrada por via oral.
A eficácia dos factores de relaxamento dependentes do endotélio libertados e activados pela administração de acetilcolina é quantitativa e qualitativamente reduzida. O efeito mediado pelo NO em resposta ao teste de provocação com ACH diminui, devido ao efeito negativo do 4-mmc na produção e expressão deste fator e na atividade da guanilato ciclase. O relaxamento dos vasos microcirculatórios dependente do endotélio induzido pela ACH, mediado por receptores muscarínicos, também é perturbado devido à degeneração da atividade dos receptores e também devido a uma diminuição da densidade de receptores na superfície dos endoteliócitos. É provável que o mecanismo de redução da reação dependente do endotélio mediada pela ACH em resposta à utilização de mefedrona seja causado por um aumento significativo da formação de radicais livres (tanto superóxido como hidroxilo) no estado hipóxico da célula, que interagem com o NO2 e o NO3.
Verificou-se uma diminuição estatisticamente significativa da atividade metabólica dos neutrófilos em 38,4% (Me = 13,1 com um intervalo interquartil de 10,3 a 15,9 com uma diferença de 5,3 a p=0,002; z = 3,008) em comparação com os indicadores do grupo de controlo. No estudo da capacidade de absorção da fagocitose com a adição de látex, os indicadores aumentaram de 13,1 Me para 16,5 Me, com um aumento percentual de 18,2% para o Grupo 3 (administração intraperitoneal), no entanto, a diferença percentual em relação ao grupo de controlo é de 18,0%, o que é uma evidência significativa e estatisticamente fiável da ação imunossupressora. Além disso, verificou-se uma diminuição estatisticamente significativa da fagocitose espontânea no Grupo 3, que diminuiu 25,3% (a p>0,0001, z=2,84) em comparação com os animais intactos.
A realização de um estudo dos efeitos pró-inflamatórios da mefedrona e a identificação das suas características etológicas são uma etapa obrigatória na investigação do 4-MMC, que é considerado uma das substâncias psicoactivas mais populares em termos de utilização recreativa. A administração, o transporte e a concentração da mefedrona nos seus tecidos-alvo dependem não só da dose administrada, mas também de uma série de outros factores - a distribuição da substância, o grau e a velocidade de absorção, a via do metabolismo e a excreção. Ao longo do estudo, é importante determinar a proporção da substância distribuída nos tecidos-alvo ou nos fluidos biológicos com os quais é transportada, para que se possa descobrir qual a parte da substância administrada que sofre biotransformação e qual a parte que entra inalterada na circulação sanguínea sistémica. Além disso, na fase dos ensaios pré-clínicos, para além do estudo dos principais mecanismos de ação, é necessário um vasto rastreio fenotípico, necessário para uma compreensão aprofundada da farmacodinâmica e dos efeitos secundários da substância. Um dos aspectos importantes desse rastreio é o estudo das propriedades psicoactivas da substância.
Objectivos do estudo.
1. Determinar os padrões cognitivos, motivacionais e comportamentais em ratos aos quais foi administrada 4-metilmetacatinona.
2. Estudar a função endotelial através da realização de testes farmacológicos vasculares utilizando o bloqueio da síntese de NO sob o controlo por ultra-sons da velocidade do fluxo sanguíneo na artéria femoral do rato e a monitorização por fluxometria laser Doppler da hemodinâmica geral e da velocidade da microcirculação no músculo medial.
3. Identificar e avaliar as actividades pró-inflamatórias e imunorreguladoras da 4-metilmetacinona utilizando o modelo de edema da pata induzido pela formalina e o teste NBT.
Materiais e métodos.
O estudo foi efectuado em 40 ratos Wistar machos com um peso de 180-200 g. Foram identificados 4 grupos: 1) Grupo de controlo (ratos intactos); 2) Ratos aos quais foi administrada mefedrona por via intraperitoneal de 48 em 48 horas, na dose de 5 mg/kg dissolvida numa solução de NaCl 0,9 (0,5 ml). 3) Administração de mefedrona por via oral (através de um tubo) a ratos, de 48 em 48 horas, numa dose de 5 mg/kg dissolvida numa solução de NaCl 0,9 (0,5 ml). 4) Ratos aos quais foi administrada mefedrona por via intraperitoneal, de 48 em 48 horas, numa dose de 5 mg/kg dissolvida em solução de NaCl 0,9 (0,5 ml) antes da administração de formalina para o modelo de edema da pata induzido por formalina.
Descrição e discussão do estudo.
Determinação dos padrões cognitivos, motivacionais e comportamentais em ratos aos quais foi administrada 4-metilmetcatinona. Para atingir este objetivo, foram formulados os seguintes objectivos: avaliar a influência da 4-metilmetcatinona no nível de excitação, ansiedade e resistência ao stress em ratos. Para determinar o estado psicoemocional dos animais estudados, utilizámos um protocolo de teste de Hall atualizado, que consiste em colocar um objeto numa arena padronizada e registar indicadores de atividade utilizando o complexo de software e hardware PANLAB Harvard Apparatus. Os actos comportamentais discretos registados com o complexo de software e hardware foram seleccionados como unidades de avaliação.
O estudo foi efectuado em 30 ratos (Grupos 1, 2 e 3, respetivamente). Antes da experiência, os animais foram mantidos num viveiro de laboratório com 10 indivíduos numa gaiola, com um regime de 12 horas não convertido, a uma temperatura ambiente de 22-24 °C e humidade de 60%, com uma dieta padrão. As experiências foram efectuadas no verão. Os resultados obtidos foram verificados quanto à normalidade da distribuição utilizando o critério de Shapiro-Wilk e processados por métodos de estatística variacional utilizando o teste t de Student e o pacote de software STATISTICA. A figura mostra esquematicamente o desenho da experiência. A atividade horizontal, a reação de grooming, a atividade de procura, a atividade locomotora, a micção e a defecação foram registadas para avaliar o comportamento exploratório. A experiência foi realizada numa sala escura, isolada do ruído externo e da luz solar, no período de 10 a 14 horas. O campo aberto era uma área quadrada de 150x150 cm de tamanho com lados de 30 cm de altura. A temperatura da sala foi mantida a 23 graus Celsius. Após cada animal, o campo aberto era higienizado para desodorização. Antes do estudo de cada grupo, um animal zero foi solto no campo aberto.
No 21º dia, os ratos foram retirados da experiência. Após a anestesia dos ratos, foi feito o isolamento da artéria carótida direita numa plataforma fixa, o músculo medial da coxa foi exposto e a veia femoral esquerda foi cateterizada. O estudo multicomponente dos parâmetros hemodinâmicos foi investigado pelo método de testes de provocação especializados envolvendo a administração de acetilcolina e nitroprussiato de sódio (NO) no cateter femoral. Os parâmetros (pressão arterial sistólica, pressão arterial diastólica, frequência cardíaca) foram registados utilizando um sensor TDS. O sensor foi instalado no terço médio da artéria femoral direita e foram registados os seguintes indicadores: velocidade máxima sistólica (VS) e diastólica (VD), velocidade média (QAs) e volumétrica (QAM) do fluxo sanguíneo, índice de pulsação (PL, índice de Gosling) e índice de resistividade (RI, índice de Pourcelot). Para medir a velocidade das células sanguíneas nos vasos do leito microcirculatório, foi utilizado um sensor-sonda em forma de agulha, que foi colocado no terço inferior do músculo vasto medial da coxa. Foram injectados agentes vasoactivos (acetilcolina - 40 mcg/kg, nitroprussiato de sódio - 30 mcg/ kg) através de um cateter inserido na veia femoral esquerda, sequencialmente em intervalos de 15 minutos. Desta forma, houve a possibilidade de monitorização paralela dos parâmetros hemodinâmicos e da microcirculação num sistema de três níveis (circulação central - sistema vascular elástico - sistema vascular periférico). O tratamento estatístico dos resultados foi efectuado com recurso ao software STATISTICA 10. De seguida, foi calculado o coeficiente de disfunção endotelial (QED). A análise estatística foi efectuada através do teste de Spearman, o cálculo da fiabilidade entre os grupos foi efectuado através do teste paramétrico t de Student.
Os diagramas apresentados mostram que a influência da mefedrona no comportamento animal corresponde aos seus principais efeitos, associados ao seu mecanismo de ação conhecido. Assim, o diagrama 1 ilustra um aumento significativo da atividade motora horizontal em comparação com o grupo de controlo. O diagrama 2 mostra que os actos de grooming são significativamente reduzidos. Este fenómeno é causado por uma diminuição da influência motivacional em relação à necessidade atual. O diagrama 3 mostra claramente um aumento dos actos de defecação e de micção, que é um dos efeitos frequentes da ingestão de 4-mmc. Um aumento da atividade horizontal pode indicar efeitos ansiolíticos, ansiogénicos, de agitação ou um aumento da atividade motora sem componente emocional (excitação motora). As reacções de grooming podem também ser interpretadas de forma ambígua, uma vez que a frequência dos actos de grooming aumenta tanto num ambiente stressante como num ambiente favorável. As manifestações da atividade exploratória, bem como a frequência das micções e defecações, podem ser interpretadas de forma mais inequívoca. Utilizando este algoritmo, pode concluir-se que o efeito farmacodinâmico relativo a uma maior atividade nervosa pode ser interpretado como uma excitação motora com uma componente emocional.
O grupo de controlo demonstrou o mesmo tipo de respostas à introdução de ACH e NO, que se manifestaram por uma diminuição da pressão arterial sistólica, diastólica e média, uma diminuição da velocidade linear da microcirculação, bem como da velocidade diastólica do movimento sanguíneo na artéria femoral (doravante FA), (indicadores de dados - Vd, Vad); 2) um aumento da velocidade sistólica do movimento sanguíneo na FA (VS, Vas), os índices de Purcello e Gosling. Os parâmetros voltaram aos seus valores originais no espaço de 2 minutos.
O tratamento estatístico posterior foi efectuado através da determinação de um número de valores ao longo do tempo para cada amostra, que foram expressos em percentagem. O critério de Spearman, que foi utilizado para a análise estatística, mostrou a melhor expressão da diferença necessária nos parâmetros estatisticamente importantes. O maior grau de correlação (p<0,05) foi determinado entre o índice de pressão arterial média (doravante designado por MAD), a velocidade linear da microcirculação, a velocidade sistólica e a diferença de velocidade sistólica-diastólica da artéria femoral. Outros parâmetros ecográficos demonstraram uma correlação baixa e menos fiável com a dinâmica da pressão arterial e a velocidade da microcirculação. O estudo do 4-mmc administrado por via oral revelou um aumento estatisticamente significativo dos indicadores de SAD, DAD e do coeficiente de disfunção endotelial (QED) em comparação com o grupo de controlo. Os indicadores da velocidade sistólica máxima (VS) e da velocidade diastólica máxima (VD) são significativamente reduzidos durante os testes de provocação nos ratos do Grupo 3, nos quais a mefedrona foi administrada por via oral.
A eficácia dos factores de relaxamento dependentes do endotélio libertados e activados pela administração de acetilcolina é quantitativa e qualitativamente reduzida. O efeito mediado pelo NO em resposta ao teste de provocação com ACH diminui, devido ao efeito negativo do 4-mmc na produção e expressão deste fator e na atividade da guanilato ciclase. O relaxamento dos vasos microcirculatórios dependente do endotélio induzido pela ACH, mediado por receptores muscarínicos, também é perturbado devido à degeneração da atividade dos receptores e também devido a uma diminuição da densidade de receptores na superfície dos endoteliócitos. É provável que o mecanismo de redução da reação dependente do endotélio mediada pela ACH em resposta à utilização de mefedrona seja causado por um aumento significativo da formação de radicais livres (tanto superóxido como hidroxilo) no estado hipóxico da célula, que interagem com o NO2 e o NO3.
Verificou-se uma diminuição estatisticamente significativa da atividade metabólica dos neutrófilos em 38,4% (Me = 13,1 com um intervalo interquartil de 10,3 a 15,9 com uma diferença de 5,3 a p=0,002; z = 3,008) em comparação com os indicadores do grupo de controlo. No estudo da capacidade de absorção da fagocitose com a adição de látex, os indicadores aumentaram de 13,1 Me para 16,5 Me, com um aumento percentual de 18,2% para o Grupo 3 (administração intraperitoneal), no entanto, a diferença percentual em relação ao grupo de controlo é de 18,0%, o que é uma evidência significativa e estatisticamente fiável da ação imunossupressora. Além disso, verificou-se uma diminuição estatisticamente significativa da fagocitose espontânea no Grupo 3, que diminuiu 25,3% (a p>0,0001, z=2,84) em comparação com os animais intactos.
- Quando a mefedrona foi administrada a animais experimentais, foi registada uma alteração estatisticamente significativa nos actos comportamentais analisados. Este facto indica a presença de uma atividade psicotrópica específica deste composto associada a níveis excessivamente elevados de excitação e ansiedade, no entanto, com uma resistência reduzida ao stress. Assim, os resultados do estudo nesta fase alargaram a informação sobre o perfil de ação do composto. Os efeitos psicotrópicos observados do 4-mmc aprofundam a compreensão de sua atividade farmacológica e devem ser objeto de estudos futuros.
- A persistência de parâmetros elevados de pressão arterial nos estados iniciais dos ratos do grupo 3 (mefedrona), bem como os seus indicadores relativos após os testes de provocação, são causados por uma perturbação não só da expressão do NO (um dos principais factores vasodilatadores que regulam o funcionamento dos vasos da microcirculação), mas também das prostaciclinas e dos factores de hiperpolarização endotelial (EDHF). Os resultados do estudo nesta fase confirmaram a hipótese teórica sobre o efeito negativo excessivo da mefedrona tanto no endotélio dos vasos da microcirculação como na viabilidade do sistema cardiovascular no seu conjunto. Os dados obtidos podem ser utilizados no planeamento de estudos pré-clínicos para expandir o espetro de complicações associadas ao uso de 4-mmc, bem como para construir um algoritmo de recomendações clínicas para a correção farmacológica destas condições complicadas.
- Tendo em conta que a mefedrona reduz provavelmente a permeabilidade à perfusão da parede celular e a função de transporte das proteínas, afecta a difusão passiva e facilitada e o transporte ativo, afecta os padrões cognitivos de uma certa forma (incluindo fenómenos retardados) e tem também a capacidade de influenciar positivamente o componente de coagulação da hemostase (hipercoagulação), pode presumir-se que a atividade da COX-2 é predominante como a principal enzima que desempenha um papel na indução da fase alternativa da inflamação. Assim, a utilização de inibidores selectivos da COX-2 para o tratamento de doenças inflamatórias em doentes em uso de 4-mmc é a mais preferível e justificada. No entanto, para uma definição precisa do tratamento farmacológico com o objetivo de aliviar os processos inflamatórios associados ao uso de 4-mmc, são necessários estudos pré-clínicos adicionais.
- Os resultados da terceira fase do estudo provaram uma diminuição da atividade metabólica e de absorção dos neutrófilos nos ratos pertencentes ao Grupo 3 (administração intraperitoneal de 4-mmc) em comparação com os indicadores dos animais do grupo de controlo. Este facto define a mefedrona como uma substância que tem um efeito imunossupressor. Esta conclusão constitui a base para novos estudos sobre a imunoterapia patogénica correctiva.
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