Tehnologiile genetice, care au pătruns în viața umană la sfârșitul secolului trecut, au schimbat lumea noastră într-o asemenea măsură încât aceasta este deja de neimaginat fără ele. Aceste tehnologii au reușit să pătrundă și în criminalistică; timp de decenii, identificarea genetică a fost utilizată ca o metodă rapidă și relativ ieftină care permite găsirea infractorilor și rezolvarea faptelor lor fără a părăsi laboratorul. Ca farmacolog de formație, sunt foarte interesat de genetică și sunt dornic să studiez acest domeniu în diferitele sale aspecte. În această publicație vă voi prezenta abordările genetice clasice în domeniul criminalisticii.
Un pic de istorie sau ce legătură are cu cavalerii?
În urmă cu 150 de ani, Johannes Friedrich Miescher a descoperit acizii nucleici, un concept care, în cele din urmă, a dat lumea peste cap [1]. La mijlocul secolului al XX-lea, a devenit clar că ADN-ul și ARN-ul erau purtătorii informației ereditare; apoi a fost descrisă structura lor și, puțin mai târziu, au apărut numeroase metode care permiteau "tăierea" acestor molecule in vitro cu ajutorul enzimelor celulare - restricțiile [2]; amplificarea lor cu ajutorul PCR [3]; și chiar citirea secvenței anumitor gene și genomuri cu ajutorul mai multor metode de secvențiere [4].
Inițial, lucrările cu material genetic erau efectuate literalmente "în bucătărie" și nu puteau fi întotdeauna reproduse nici măcar în laboratorul științific vecin. Dar timpul a trecut, abordările s-au schimbat, iar metodele au fost standardizate într-o asemenea măsură încât au fost introduse treptat în cercetarea aplicată și chiar în producția biotehnologică.
În 1984, comunitatea științifică a fost agitată de vestea că oamenii de știință au reușit să izoleze și să citească un fragment de ADN al zebrei Burchell, specie dispărută care supraviețuiește doar în colecțiile muzeelor [5]. Un an mai târziu, geneticianul suedez Svante Pääbo a confirmat posibilitatea utilizării materialului muzeal și arheologic pentru cercetarea științifică fundamentală, după ce a analizat pentru prima dată materialul genetic al mumiilor egiptene. Ani mai târziu, s-a dovedit că eșantioanele analizate de el erau contaminate cu material genetic modern [6], dar dezvoltarea metodelor de secvențiere a făcut totuși posibilă lucrul chiar și cu cantități minime de ADN prost conservat.
Criminaliștii au fost, de asemenea, interesați de noile tehnici de analiză a materialului genetic. Adevărul este că metodele de dactiloscopie clasică și de analiză a grupelor sanguine, care erau obișnuite la acea vreme, aveau limitele lor și, în unele cazuri, dădeau greș.
În 1984, omul de știință britanic Sir Alec John Jeffreys (figura 3) a dezvoltat și prezentat o metodă de identificare a unei persoane folosind materialul genetic al acesteia. Ulterior, această abordare a fost denumită identificare ADN, câștigând dragostea și respectul criminologilor din întreaga lume. Jeffreys a fost făcut cavaler pentru munca sa.
Un pic de istorie sau ce legătură are cu cavalerii?
În urmă cu 150 de ani, Johannes Friedrich Miescher a descoperit acizii nucleici, un concept care, în cele din urmă, a dat lumea peste cap [1]. La mijlocul secolului al XX-lea, a devenit clar că ADN-ul și ARN-ul erau purtătorii informației ereditare; apoi a fost descrisă structura lor și, puțin mai târziu, au apărut numeroase metode care permiteau "tăierea" acestor molecule in vitro cu ajutorul enzimelor celulare - restricțiile [2]; amplificarea lor cu ajutorul PCR [3]; și chiar citirea secvenței anumitor gene și genomuri cu ajutorul mai multor metode de secvențiere [4].
Inițial, lucrările cu material genetic erau efectuate literalmente "în bucătărie" și nu puteau fi întotdeauna reproduse nici măcar în laboratorul științific vecin. Dar timpul a trecut, abordările s-au schimbat, iar metodele au fost standardizate într-o asemenea măsură încât au fost introduse treptat în cercetarea aplicată și chiar în producția biotehnologică.
În 1984, comunitatea științifică a fost agitată de vestea că oamenii de știință au reușit să izoleze și să citească un fragment de ADN al zebrei Burchell, specie dispărută care supraviețuiește doar în colecțiile muzeelor [5]. Un an mai târziu, geneticianul suedez Svante Pääbo a confirmat posibilitatea utilizării materialului muzeal și arheologic pentru cercetarea științifică fundamentală, după ce a analizat pentru prima dată materialul genetic al mumiilor egiptene. Ani mai târziu, s-a dovedit că eșantioanele analizate de el erau contaminate cu material genetic modern [6], dar dezvoltarea metodelor de secvențiere a făcut totuși posibilă lucrul chiar și cu cantități minime de ADN prost conservat.
Criminaliștii au fost, de asemenea, interesați de noile tehnici de analiză a materialului genetic. Adevărul este că metodele de dactiloscopie clasică și de analiză a grupelor sanguine, care erau obișnuite la acea vreme, aveau limitele lor și, în unele cazuri, dădeau greș.
În 1984, omul de știință britanic Sir Alec John Jeffreys (figura 3) a dezvoltat și prezentat o metodă de identificare a unei persoane folosind materialul genetic al acesteia. Ulterior, această abordare a fost denumită identificare ADN, câștigând dragostea și respectul criminologilor din întreaga lume. Jeffreys a fost făcut cavaler pentru munca sa.
Dactiloscopia ADN: avantaje și dezavantaje
Analiza genetică a probelor biologice obținute la locul faptei a simplificat considerabil munca anchetatorilor. Aceștia dispun acum de un instrument fiabil pentru identificarea autorului sau a victimei, obținerea de probe incontestabile și soluționarea infracțiunilor.
Principalele avantaje ale dactiloscopiei genetice sunt capacitatea de a lucra chiar și cu cantități mici de material biologic și acuratețea ridicată care permite identificarea unui individ - dacă sunt îndeplinite toate cerințele pentru analiză, fiabilitatea acesteia depășește 99%. Această abordare a devenit una dintre cele mai importante în investigarea infracțiunilor [7].
Este important de menționat faptul că metodele clasice de dactiloscopie ADN nu permit identificarea gemenilor identici al căror profil genetic este același, deoarece aceștia sunt formați din același ovul fecundat.
Pentru analiza ADN, în primul rând, este necesară DnA în sine, dar nu este întotdeauna posibil să se extragă material genetic de înaltă calitate din probe biologice care au fost expuse la factori chimici și termici. Odată ajunsă în mediu, această moleculă intră în reacții chimice, este distrusă (fragmentată) și modificată, deși în condiții favorabile poate persista mii de ani [8].
Se știe că cel mai vechi material genetic al strămoșilor umani a fost extras din resturile osoase ale rudelor noastre umanoide care au trăit pe teritoriul Peninsulei Iberice (Sierra de Atapuerca) în urmă cu aproximativ 430 de mii de ani [9]. Microclimatul specific al unor peșteri, cu valori scăzute de umiditate și temperatură, crește semnificativ durata de viață a materialului genetic. Cu toate acestea, ADN-ul din probele găsite la locul faptei este adesea reprezentat în cantități minime și, la fel ca în cazul probelor arheologice, este grav degradat.
În Europa și în Statele Unite, se atrage atenția asupra unui alt dezavantaj al amprentelor genetice, legat de interferența cu viața privată a unei persoane și de încălcarea vieții private.
Activiștii pentru drepturile omului se tem că informațiile genetice ale infractorilor și ale suspecților de infracțiuni ar putea ajunge în mâinile unor terțe părți și apoi să fie utilizate în mod abuziv [10]. De exemplu, există deja cazuri cunoscute de utilizare a informațiilor genetice pentru a controla minoritățile musulmane din provincia chineză Xinjiang.
De asemenea, SUA intenționează să colecteze în mod sistematic profiluri ADN ale imigranților aflați în custodie federală [11]. În mod evident, temerile activiștilor pentru drepturile omului nu sunt nefondate și au temeiuri reale.
Principalele avantaje ale dactiloscopiei genetice sunt capacitatea de a lucra chiar și cu cantități mici de material biologic și acuratețea ridicată care permite identificarea unui individ - dacă sunt îndeplinite toate cerințele pentru analiză, fiabilitatea acesteia depășește 99%. Această abordare a devenit una dintre cele mai importante în investigarea infracțiunilor [7].
Este important de menționat faptul că metodele clasice de dactiloscopie ADN nu permit identificarea gemenilor identici al căror profil genetic este același, deoarece aceștia sunt formați din același ovul fecundat.
Pentru analiza ADN, în primul rând, este necesară DnA în sine, dar nu este întotdeauna posibil să se extragă material genetic de înaltă calitate din probe biologice care au fost expuse la factori chimici și termici. Odată ajunsă în mediu, această moleculă intră în reacții chimice, este distrusă (fragmentată) și modificată, deși în condiții favorabile poate persista mii de ani [8].
Se știe că cel mai vechi material genetic al strămoșilor umani a fost extras din resturile osoase ale rudelor noastre umanoide care au trăit pe teritoriul Peninsulei Iberice (Sierra de Atapuerca) în urmă cu aproximativ 430 de mii de ani [9]. Microclimatul specific al unor peșteri, cu valori scăzute de umiditate și temperatură, crește semnificativ durata de viață a materialului genetic. Cu toate acestea, ADN-ul din probele găsite la locul faptei este adesea reprezentat în cantități minime și, la fel ca în cazul probelor arheologice, este grav degradat.
În Europa și în Statele Unite, se atrage atenția asupra unui alt dezavantaj al amprentelor genetice, legat de interferența cu viața privată a unei persoane și de încălcarea vieții private.
Activiștii pentru drepturile omului se tem că informațiile genetice ale infractorilor și ale suspecților de infracțiuni ar putea ajunge în mâinile unor terțe părți și apoi să fie utilizate în mod abuziv [10]. De exemplu, există deja cazuri cunoscute de utilizare a informațiilor genetice pentru a controla minoritățile musulmane din provincia chineză Xinjiang.
De asemenea, SUA intenționează să colecteze în mod sistematic profiluri ADN ale imigranților aflați în custodie federală [11]. În mod evident, temerile activiștilor pentru drepturile omului nu sunt nefondate și au temeiuri reale.
Cum funcționează
Metodele de dactiloscopie ADN se bazează pe variabilitatea genetică umană. Substituțiile de nucleotide din ADN (în funcție de frecvența lor în populație, se mai numesc polimorfisme ADN sau mutații) ne fac diferiți individual. Iar aceste diferențe pot fi găsite atât în genomul nuclear, cât și în cel mitocondrial, mici molecule circulare de ADN care reglează funcționarea mitocondriilor, "fabricile" de energie ale celulelor.
Trebuie remarcat faptul că polimorfismele ADN pot fi găsite în genomul fiecăruia dintre noi - ele devin codul nostru de bare ADN unic. Unele dintre ele pot provoca boli grave [12], dar în majoritatea cazurilor nu au niciun efect asupra funcțiilor noastre vitale.
Metodele moderne de dactiloscopie ADN utilizează o varietate de variante genetice în diferite regiuni ale genomului. De exemplu, analiza repetițiilor în tandem - secvențe scurte repetitive ale genomului al căror număr diferă la doi indivizi eșantionați aleatoriu [13] - permite un test de paternitate clar sau găsirea de dovezi suplimentare împotriva unui suspect penal.
Markerii ADN cromozomiali Y pot fi utilizați pentru a determina sexul unei persoane. Markerii genetici oferă informații privind etnia rudelor unei persoane, culoarea ochilor sau culoarea părului.
În plus, informațiile epigenetice (de exemplu, metilarea ADN-ului) fac posibilă estimarea vârstei biologice a celulelor individuale, a țesuturilor și a organismului ca întreg [14]. În acest articol voi vorbi mai mult despre metodele de analiză genetică de mai sus. Iar utilizarea metodelor epigenetice în domeniul farmaceutic va fi subiectul următoarei mele publicații.
Markerii ADN cromozomiali Y pot fi utilizați pentru a determina sexul unei persoane. Markerii genetici oferă informații privind etnia rudelor unei persoane, culoarea ochilor sau culoarea părului.
În plus, informațiile epigenetice (de exemplu, metilarea ADN-ului) fac posibilă estimarea vârstei biologice a celulelor individuale, a țesuturilor și a organismului ca întreg [14]. În acest articol voi vorbi mai mult despre metodele de analiză genetică de mai sus. Iar utilizarea metodelor epigenetice în domeniul farmaceutic va fi subiectul următoarei mele publicații.
Colectarea și izolarea ADN din material biologic
Extragerea și analiza ADN din probe criminalistice este, la prima vedere, comparabilă cu arta. Uneori este imposibil să ne imaginăm că câteva picături de sânge sau o bucată de piele de sub unghiile unei victime pot deveni cele mai importante dovezi într-o anchetă penală.
De fapt, acțiunile specialiștilor criminaliști de la locul faptei sunt bine puse la punct și urmează un scenariu unic, unul dintre principalele obiective fiind găsirea materialului biologic potrivit pentru extragerea ADN-ului. Orice țesut biologic și secreții umane pot fi utilizate în acest scop .
- Resturi osoase
- dinți
- Foliculii de păr
- sânge
- Celule epiteliale
- Transpirație
- Salivă
- Probe de spermă
- excremente, etc.
Materialul biologic din depozitul de probe poate dura zeci de ani. Adesea, examinatorul ia doar o parte din material pentru examinare, atât cât are nevoie pentru extragerea ADN-ului. De exemplu, dacă există urme de sânge pe cuțit, expertul nu spală tot sângele, ci face o mică clătire chiar înainte de extracția ADN. Acest lucru lasă urme pe cuțit, care pot fi folosite pentru a efectua o reexaminare câteva decenii mai târziu.
În nucleul celular, ADN-ul este în contact strâns cu numeroase molecule organice necesare funcționării sale eficiente. Cu toate acestea, pentru analiza genetică, carbohidrații, lipidele și proteinele trebuie îndepărtate din proba de testare, ceea ce poate reduce eficiența metodelor utilizate și, în consecință, poate afecta soluționabilitatea infracțiunilor.Extracția ADN necesită puțin timp datorită unei varietăți de kituri și sisteme comerciale special concepute pentru extragerea acizilor nucleici (de exemplu, AutoMate Express DNA Extraction System de la Thermo Fisher Scientific). În plus, în centrele criminalistice mari, cu mii de analize pe zi, acest proces este complet automatizat și realizat cu participarea unor roboți sub supravegherea unui operator.
De altfel, sistemele robotizate sunt utilizate pe scară largă nu numai în laboratoarele criminalistice, ci și în multe centre medicale și de biotehnologie, permițând accelerarea procesului, reducerea costului muncii și reducerea semnificativă a șanselor de eroare.
După extracție, ADN-ul este dizolvat într-un compus special, unde poate fi stocat ani de zile (la -20°C sau -80°C), dacă este necesar.
Analiza genetică
Imediat după extragerea DnA, specialistul se confruntă cu problema modalităților suplimentare de analiză a acestuia. De la introducerea identificării ADN în criminalistică, tehnicile de biologie moleculară s-au schimbat atât de mult încât există mai multe variante posibile. Povestirea noastră ulterioară va evidenția diferitele tehnici de analiză a ADN-ului pe care experții criminaliști le utilizează în practica lor.
Polimorfismul lungimii fragmentului de restricție (analiza RFLP)
Analiza RFLP este, din punct de vedere istoric, una dintre primele metode de identificare a ADN-ului. Ea se bazează pe utilizarea unor enzime celulare speciale, restrictazele. Enzimele de restricție pot recunoaște anumite situri pe o moleculă de acid nucleic și o pot tăia prin aceste situri. Câteva mii de astfel de enzime au fost descrise până în prezent. După tăierea moleculei DnA cu enzime de restricție, lungimile fragmentelor obținute sunt evaluate prin electroforeză pe gel (figura 9).
Imediat după extragerea DnA, specialistul se confruntă cu problema modalităților suplimentare de analiză a acestuia. De la introducerea identificării ADN în criminalistică, tehnicile de biologie moleculară s-au schimbat atât de mult încât există mai multe variante posibile. Povestirea noastră ulterioară va evidenția diferitele tehnici de analiză a ADN-ului pe care experții criminaliști le utilizează în practica lor.
Polimorfismul lungimii fragmentului de restricție (analiza RFLP)
Analiza RFLP este, din punct de vedere istoric, una dintre primele metode de identificare a ADN-ului. Ea se bazează pe utilizarea unor enzime celulare speciale, restrictazele. Enzimele de restricție pot recunoaște anumite situri pe o moleculă de acid nucleic și o pot tăia prin aceste situri. Câteva mii de astfel de enzime au fost descrise până în prezent. După tăierea moleculei DnA cu enzime de restricție, lungimile fragmentelor obținute sunt evaluate prin electroforeză pe gel (figura 9).
Deoarece nu există genomuri umane complet identice (cu excepția gemenilor identici), diferența sau similitudinea profilelor lungimii fragmentelor de ADN rezultate poate fi un bun marker atât pentru identificarea personală, cât și pentru determinarea rudeniei.
Cu toate acestea, această metodă implică fragmentarea ADN-ului și, prin urmare, este sensibilă la calitatea și cantitatea materialului genetic original. Acesta este motivul pentru care analiza RFLP nu este utilizată practic în prezent - spre deosebire de alte metode, care vor fi discutate mai jos.
Analiza numărului de repetări în tandem din genom
Repetările în tandem sunt copii ale aceleiași secvențe scurte DnA repetate una după alta [15]. Repetițiile care prezintă interes pentru criminaliști includ loci cu un număr variabil de repetări în tandem (VNTR) și repetări scurte în tandem (STR). Acestea sunt denumite și minisateliți și, respectiv, microsateliți.
Esența acestei metode este amplificarea prin PCR a fragmentelor de ADN care conțin aceste secvențe repetitive scurte ale căror lungimi sunt diferite la doi indivizi eșantionați aleatoriu. După amplificare, lungimea fragmentelor obținute este evaluată prin electroforeză pe gel sau prin electroforeză capilară.
Kitul Quantifiler DNA Quantification și sistemul QuantStudio de la Termo Fisher Scientific pot fi utilizate în acest scop. QuantStudio este un instrument compact de banc cu o gamă largă de caracteristici.
Ca și în cazul metodei anterioare, principalul factor de identificare al analizei STR este lungimea fragmentelor obținute, care este unică pentru fiecare individ și depinde de numărul de repetiții din situsul analizat. Analiza STR se caracterizează prin acuratețe și rapiditate ridicate, precum și prin costuri reduse. Calitatea materialului genetic este o condiție importantă pentru analiză.
Cu toate acestea, această metodă implică fragmentarea ADN-ului și, prin urmare, este sensibilă la calitatea și cantitatea materialului genetic original. Acesta este motivul pentru care analiza RFLP nu este utilizată practic în prezent - spre deosebire de alte metode, care vor fi discutate mai jos.
Analiza numărului de repetări în tandem din genom
Repetările în tandem sunt copii ale aceleiași secvențe scurte DnA repetate una după alta [15]. Repetițiile care prezintă interes pentru criminaliști includ loci cu un număr variabil de repetări în tandem (VNTR) și repetări scurte în tandem (STR). Acestea sunt denumite și minisateliți și, respectiv, microsateliți.
Esența acestei metode este amplificarea prin PCR a fragmentelor de ADN care conțin aceste secvențe repetitive scurte ale căror lungimi sunt diferite la doi indivizi eșantionați aleatoriu. După amplificare, lungimea fragmentelor obținute este evaluată prin electroforeză pe gel sau prin electroforeză capilară.
Kitul Quantifiler DNA Quantification și sistemul QuantStudio de la Termo Fisher Scientific pot fi utilizate în acest scop. QuantStudio este un instrument compact de banc cu o gamă largă de caracteristici.
Ca și în cazul metodei anterioare, principalul factor de identificare al analizei STR este lungimea fragmentelor obținute, care este unică pentru fiecare individ și depinde de numărul de repetiții din situsul analizat. Analiza STR se caracterizează prin acuratețe și rapiditate ridicate, precum și prin costuri reduse. Calitatea materialului genetic este o condiție importantă pentru analiză.
Analiza STR a apărut în criminalistica practică în urmă cu aproape douăzeci de ani, dar până în prezent rămâne principala metodă de identificare a persoanelor. Rezultatele analizelor ADN ale suspecților și infractorilor - profilurile genetice - sunt introduse de criminologi în baze de date speciale.
Prin urmare, atunci când la locul faptei se găsesc urme biologice din care poate fi izolat ADN-ul, a devenit posibilă identificarea tuturor persoanelor care au intrat deja în atenția agențiilor de aplicare a legii. Aceiași markeri sunt utilizați pentru căutarea persoanelor dispărute și pentru stabilirea paternității.
Prin urmare, atunci când la locul faptei se găsesc urme biologice din care poate fi izolat ADN-ul, a devenit posibilă identificarea tuturor persoanelor care au intrat deja în atenția agențiilor de aplicare a legii. Aceiași markeri sunt utilizați pentru căutarea persoanelor dispărute și pentru stabilirea paternității.
De regulă, sistemele destinate identificării persoanelor permit analiza mai multor loci genomici (10-24) în același timp, inclusiv gena proteinei amelogenin, prin care se determină sexul. Gena amelogeninei se găsește atât pe cromozomul X, cât și pe cromozomul Y, dar diferă ca dimensiune, ceea ce permite determinarea sexului unei persoane.
Datorită utilizării tehnologiilor de secvențiere de mare capacitate, medicina legală a obținut un instrument eficient care a deschis noi oportunități pentru analiza simultană a mai multor situsuri (loci) ale genomului nuclear și mitocondrial.
Un avantaj important al acestor metode este capacitatea de a distinge chiar și gemenii identici (prin mutații somatice), ceea ce este imposibil cu analiza RFLP sau STR.
Datorită utilizării tehnologiilor de secvențiere de mare capacitate, medicina legală a obținut un instrument eficient care a deschis noi oportunități pentru analiza simultană a mai multor situsuri (loci) ale genomului nuclear și mitocondrial.
Un avantaj important al acestor metode este capacitatea de a distinge chiar și gemenii identici (prin mutații somatice), ceea ce este imposibil cu analiza RFLP sau STR.
A doua parte a acestei publicații va descrie modul în care metodele descrise mai sus pot fi utilizate pentru a identifica laboratoarele de droguri și traficanții de droguri și modul în care puteți încurca criminaliștii prin ștergerea urmelor dumneavoastră.
Citiți PARTEA II
