Генетические технологии, ворвавшиеся в жизнь человека в конце прошлого века, настолько изменили наш мир, что его уже невозможно представить без них. Эти технологии успели проникнуть и в криминалистику; уже несколько десятилетий генетическая идентификация используется как быстрый и относительно дешевый метод, позволяющий найти преступников и раскрыть их деяния, не выходя из лаборатории. Будучи фармакологом по образованию, я очень интересуюсь генетикой и стремлюсь изучить эту область в различных ее аспектах. В этой публикации я познакомлю вас с классическими генетическими подходами в области криминалистики.
Немного истории или какое отношение это имеет к рыцарям?
150 лет назад Иоганн Фридрих Мишер открыл нуклеиновые кислоты - понятие, которое в итоге перевернуло мир [1]. К середине XX века стало ясно, что ДНК и РНК являются носителями наследственной информации, затем была описана их структура, а чуть позже появились многочисленные методы, позволяющие "разрезать" эти молекулы in vitro с помощью клеточных ферментов - рестриктаз [2], амплифицировать их с помощью ПЦР [3] и даже читать последовательность конкретных генов и геномов с помощью многочисленных методов секвенирования [4].
Изначально работа с генетическим материалом проводилась буквально "на кухне" и не всегда могла быть воспроизведена даже в соседней научной лаборатории. Но время шло, подходы менялись, а методы стандартизировались настолько, что постепенно стали внедряться в прикладные исследования и даже биотехнологическое производство.
В 1984 году научное сообщество всколыхнула новость о том, что ученым удалось выделить и прочитать фрагмент ДНК зебры Бурчелла, которая вымерла и сохранилась только в музейных коллекциях [5]. Годом позже шведский генетик Сванте Пяэбо подтвердил возможность использования музейных и археологических материалов для фундаментальных научных исследований, впервые проанализировав генетический материал египетских мумий. Спустя годы выяснилось, что проанализированные им образцы были загрязнены современным генетическим материалом [6], но развитие методов секвенирования все же позволило работать даже с минимальными количествами плохо сохранившейся ДНК.
Криминалисты также заинтересовались новыми методиками анализа генетического материала. Дело в том, что привычные на тот момент методы классической дактилоскопии и анализа групп крови имели свои ограничения, а в некоторых случаях и давали осечку.
В 1984 году британский ученый сэр Алек Джон Джеффрис (рис. 3) разработал и представил метод идентификации человека по его генетическому материалу. Позже этот подход был назван ДНК-идентификацией, завоевав любовь и уважение криминологов всего мира. За свою работу Джеффрис был посвящен в рыцари.
Немного истории или какое отношение это имеет к рыцарям?
150 лет назад Иоганн Фридрих Мишер открыл нуклеиновые кислоты - понятие, которое в итоге перевернуло мир [1]. К середине XX века стало ясно, что ДНК и РНК являются носителями наследственной информации, затем была описана их структура, а чуть позже появились многочисленные методы, позволяющие "разрезать" эти молекулы in vitro с помощью клеточных ферментов - рестриктаз [2], амплифицировать их с помощью ПЦР [3] и даже читать последовательность конкретных генов и геномов с помощью многочисленных методов секвенирования [4].
Изначально работа с генетическим материалом проводилась буквально "на кухне" и не всегда могла быть воспроизведена даже в соседней научной лаборатории. Но время шло, подходы менялись, а методы стандартизировались настолько, что постепенно стали внедряться в прикладные исследования и даже биотехнологическое производство.
В 1984 году научное сообщество всколыхнула новость о том, что ученым удалось выделить и прочитать фрагмент ДНК зебры Бурчелла, которая вымерла и сохранилась только в музейных коллекциях [5]. Годом позже шведский генетик Сванте Пяэбо подтвердил возможность использования музейных и археологических материалов для фундаментальных научных исследований, впервые проанализировав генетический материал египетских мумий. Спустя годы выяснилось, что проанализированные им образцы были загрязнены современным генетическим материалом [6], но развитие методов секвенирования все же позволило работать даже с минимальными количествами плохо сохранившейся ДНК.
Криминалисты также заинтересовались новыми методиками анализа генетического материала. Дело в том, что привычные на тот момент методы классической дактилоскопии и анализа групп крови имели свои ограничения, а в некоторых случаях и давали осечку.
В 1984 году британский ученый сэр Алек Джон Джеффрис (рис. 3) разработал и представил метод идентификации человека по его генетическому материалу. Позже этот подход был назван ДНК-идентификацией, завоевав любовь и уважение криминологов всего мира. За свою работу Джеффрис был посвящен в рыцари.
Дактилоскопия ДНК: преимущества и недостатки
Генетический анализ биологических образцов, полученных на местах преступлений, значительно упростил работу следователей. Теперь у них есть надежный инструмент для идентификации преступника или жертвы, получения неопровержимых доказательств и раскрытия преступлений.
Основными преимуществами генетической дактилоскопии являются возможность работы даже с небольшими объемами биологического материала и высокая точность, позволяющая идентифицировать личность - при соблюдении всех требований к анализу его достоверность превышает 99 %. Этот подход стал одним из самых важных при расследовании преступлений [7].
Важно отметить, что классические методы дактилоскопии ДНК не позволяют идентифицировать однояйцевых близнецов, генетический профиль которых одинаков, поскольку они образуются из одной оплодотворенной яйцеклетки.
Для анализа ДНК в первую очередь необходима сама ДНК, но далеко не всегда удается извлечь качественный генетический материал из биологических образцов, подвергшихся воздействию химических и термических факторов. Попадая в окружающую среду, эта молекула вступает в химические реакции, разрушается (фрагментируется) и модифицируется, хотя в благоприятных условиях может сохраняться в течение тысяч лет [8].
Известно, что самый древний генетический материал предков человека был извлечен из костных останков наших гуманоидных родственников, живших на территории Пиренейского полуострова (Сьерра-де-Атапуэрка) около 430 тысяч лет назад [9]. Специфический микроклимат некоторых пещер с низкими показателями влажности и температуры значительно увеличивает время жизни генетического материала. Однако ДНК в образцах, найденных на месте преступления, зачастую представлена в минимальных количествах и, как и в археологических образцах, сильно деградирует.
В Европе и США обращают внимание на еще один недостаток генетической дактилоскопии, связанный с вмешательством в частную жизнь человека и нарушением неприкосновенности частной жизни.
Правозащитники опасаются, что генетическая информация преступников и подозреваемых в совершении преступлений может попасть в руки третьих лиц и затем использоваться не по назначению [10]. Например, уже известны случаи использования генетической информации для контроля мусульманских меньшинств в китайской провинции Синьцзян.
США также планируют систематически собирать профили ДНК иммигрантов, находящихся под федеральной опекой [11]. Очевидно, что опасения правозащитников не беспочвенны и имеют под собой реальные основания.
Основными преимуществами генетической дактилоскопии являются возможность работы даже с небольшими объемами биологического материала и высокая точность, позволяющая идентифицировать личность - при соблюдении всех требований к анализу его достоверность превышает 99 %. Этот подход стал одним из самых важных при расследовании преступлений [7].
Важно отметить, что классические методы дактилоскопии ДНК не позволяют идентифицировать однояйцевых близнецов, генетический профиль которых одинаков, поскольку они образуются из одной оплодотворенной яйцеклетки.
Для анализа ДНК в первую очередь необходима сама ДНК, но далеко не всегда удается извлечь качественный генетический материал из биологических образцов, подвергшихся воздействию химических и термических факторов. Попадая в окружающую среду, эта молекула вступает в химические реакции, разрушается (фрагментируется) и модифицируется, хотя в благоприятных условиях может сохраняться в течение тысяч лет [8].
Известно, что самый древний генетический материал предков человека был извлечен из костных останков наших гуманоидных родственников, живших на территории Пиренейского полуострова (Сьерра-де-Атапуэрка) около 430 тысяч лет назад [9]. Специфический микроклимат некоторых пещер с низкими показателями влажности и температуры значительно увеличивает время жизни генетического материала. Однако ДНК в образцах, найденных на месте преступления, зачастую представлена в минимальных количествах и, как и в археологических образцах, сильно деградирует.
В Европе и США обращают внимание на еще один недостаток генетической дактилоскопии, связанный с вмешательством в частную жизнь человека и нарушением неприкосновенности частной жизни.
Правозащитники опасаются, что генетическая информация преступников и подозреваемых в совершении преступлений может попасть в руки третьих лиц и затем использоваться не по назначению [10]. Например, уже известны случаи использования генетической информации для контроля мусульманских меньшинств в китайской провинции Синьцзян.
США также планируют систематически собирать профили ДНК иммигрантов, находящихся под федеральной опекой [11]. Очевидно, что опасения правозащитников не беспочвенны и имеют под собой реальные основания.
Как это работает
Методы ДНК-дактилоскопии основаны на генетической изменчивости человека. Нуклеотидные замены в ДНК (в зависимости от частоты встречаемости в популяции их еще называют полиморфизмами ДНК, или мутациями) делают нас индивидуально разными. И эти различия можно обнаружить как в ядерном, так и в митохондриальном геноме - небольших кольцевых молекулах ДНК, которые регулируют работу митохондрий, энергетических "фабрик" клеток.
Стоит отметить, что полиморфизмы ДНК можно найти в геноме каждого из нас - они становятся нашим уникальным штрих-кодом ДНК. Некоторые из них могут вызывать серьезные заболевания [12], но в большинстве случаев они никак не влияют на нашу жизнедеятельность.
Современные методы ДНК-дактилоскопии используют разнообразные генетические варианты в различных областях генома. Например, анализ тандемных повторов - коротких повторяющихся последовательностей генома, число которых различается у двух случайно отобранных индивидуумов [13], - позволяет провести четкий тест на отцовство или найти дополнительные улики против подозреваемого в преступлении.
Y-хромосомные ДНК-маркеры могут использоваться для определения пола человека. Генетические маркеры дают информацию об этнической принадлежности родственников человека, цвете глаз или волос.
Кроме того, эпигенетическая информация (например, метилирование ДНК) позволяет оценить биологический возраст отдельных клеток, тканей и организма в целом [14]. В этой статье я расскажу подробнее о перечисленных выше методах генетического анализа. А использование эпигенетических методов в лекарственном бизнесе станет темой моей следующей публикации.
Y-хромосомные ДНК-маркеры могут использоваться для определения пола человека. Генетические маркеры дают информацию об этнической принадлежности родственников человека, цвете глаз или волос.
Кроме того, эпигенетическая информация (например, метилирование ДНК) позволяет оценить биологический возраст отдельных клеток, тканей и организма в целом [14]. В этой статье я расскажу подробнее о перечисленных выше методах генетического анализа. А использование эпигенетических методов в лекарственном бизнесе станет темой моей следующей публикации.
Сбор и выделение ДНК из биологического материала
Выделение и анализ ДНК из криминалистических образцов, на первый взгляд, сравнимо с искусством. Порой невозможно представить, что несколько капель крови или кусочек кожи под ногтями жертвы могут стать важнейшей уликой в расследовании уголовного дела.
На самом деле действия криминалистов на месте преступления отлажены и проходят по единому сценарию, одна из главных целей которого - найти биологический материал, пригодный для выделения ДНК. Для этого могут быть использованы любые биологические ткани и выделения человека .
- Костные останки
- зубы
- Волосяные фолликулы
- Кровь
- Эпителиальные клетки
- Пот
- Слюна
- Образцы сперматозоидов
- Экскременты и т.д.
Биоматериал в хранилище улик может храниться десятилетиями. Часто эксперт берет на исследование только часть материала, столько, сколько ему нужно для выделения ДНК. Например, если на ноже есть следы крови, эксперт не смывает всю кровь, а делает небольшое ополаскивание непосредственно перед выделением ДНК. В результате на ноже остаются следы, которые можно использовать для повторной экспертизы спустя несколько десятилетий.
В клеточном ядре ДНК находится в тесном контакте с многочисленными органическими молекулами, необходимыми для ее эффективного функционирования. Однако для проведения генетического анализа из исследуемого образца необходимо удалить углеводы, липиды и белки, что может снизить эффективность используемых методов и, как следствие, повлиять на раскрываемость преступлений.Выделение ДНК занимает мало времени благодаря разнообразию коммерческих наборов и систем, специально разработанных для экстракции нуклеиновых кислот (например, AutoMate Express DNA Extraction System от Thermo Fisher Scientific). Кроме того, в крупных криминалистических центрах с тысячами анализов в день этот процесс полностью автоматизирован и осуществляется с помощью роботов под руководством оператора.
Кстати, роботизированные системы широко используются не только в криминалистических лабораториях, но и во многих медицинских и биотехнологических центрах, позволяя ускорить процесс, снизить стоимость работы и значительно уменьшить вероятность ошибки.
После выделения ДНК растворяется в специальном составе, где при необходимости может храниться годами (при температуре -20 или -80 °C).
Генетический анализ
Сразу после выделения ДНК перед специалистом встает вопрос о дальнейших способах ее анализа. С момента внедрения идентификации ДНК в криминалистику методы молекулярной биологии изменились настолько, что существует несколько возможных вариантов. Наш дальнейший рассказ расскажет о различных методиках анализа ДНК, которые используют в своей практике судебно-медицинские эксперты.
Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP-анализ)
RFLP-анализ - исторически один из первых методов идентификации ДНК. Он основан на использовании специальных клеточных ферментов - рестриктаз. Рестрикционные ферменты способны распознавать определенные участки на молекуле нуклеиновой кислоты и разрезать ее по этим участкам. На сегодняшний день описано несколько тысяч таких ферментов. После разрезания молекулы ДНК ферментами рестрикции длину полученных фрагментов оценивают с помощью гель-электрофореза (рис. 9).
Сразу после выделения ДНК перед специалистом встает вопрос о дальнейших способах ее анализа. С момента внедрения идентификации ДНК в криминалистику методы молекулярной биологии изменились настолько, что существует несколько возможных вариантов. Наш дальнейший рассказ расскажет о различных методиках анализа ДНК, которые используют в своей практике судебно-медицинские эксперты.
Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP-анализ)
RFLP-анализ - исторически один из первых методов идентификации ДНК. Он основан на использовании специальных клеточных ферментов - рестриктаз. Рестрикционные ферменты способны распознавать определенные участки на молекуле нуклеиновой кислоты и разрезать ее по этим участкам. На сегодняшний день описано несколько тысяч таких ферментов. После разрезания молекулы ДНК ферментами рестрикции длину полученных фрагментов оценивают с помощью гель-электрофореза (рис. 9).
Поскольку полностью идентичных геномов человека не существует (за исключением однояйцевых близнецов), разница или сходство в полученных профилях длины фрагментов ДНК может быть хорошим маркером как для идентификации личности, так и для определения родства.
Однако этот метод предполагает фрагментацию ДНК, а значит, чувствителен к качеству и количеству исходного генетического материала. Именно поэтому RFLP-анализ в настоящее время практически не используется - в отличие от других методов, которые будут рассмотрены ниже.
Анализ количества тандемных повторов в геноме
Тандемные повторы - это копии одной и той же короткой последовательности ДНК, повторяющиеся друг за другом [15]. Повторы, представляющие интерес для криминалистов, включают локусы с различным числом тандемных повторов (VNTR) и короткие тандемные повторы (STR). Их также называют минисателлитами и микросателлитами соответственно.
Суть этого метода заключается в ПЦР-амплификации фрагментов ДНК, содержащих короткие повторяющиеся последовательности, длина которых отличается у двух случайно отобранных индивидов. После амплификации длина полученных фрагментов оценивается с помощью гель-электрофореза или капиллярного электрофореза.
Для этого можно использовать набор Quantifiler DNA Quantification Kit и систему QuantStudio от Termo Fisher Scientific. QuantStudio - это компактный настольный прибор с широким набором функций.
Как и в предыдущем методе, основным идентифицирующим фактором STR-анализа является длина полученных фрагментов, которая уникальна для каждого человека и зависит от количества повторов в анализируемом участке. STR-анализ характеризуется высокой точностью и скоростью, а также низкой стоимостью. Важным условием анализа является качество генетического материала.
Однако этот метод предполагает фрагментацию ДНК, а значит, чувствителен к качеству и количеству исходного генетического материала. Именно поэтому RFLP-анализ в настоящее время практически не используется - в отличие от других методов, которые будут рассмотрены ниже.
Анализ количества тандемных повторов в геноме
Тандемные повторы - это копии одной и той же короткой последовательности ДНК, повторяющиеся друг за другом [15]. Повторы, представляющие интерес для криминалистов, включают локусы с различным числом тандемных повторов (VNTR) и короткие тандемные повторы (STR). Их также называют минисателлитами и микросателлитами соответственно.
Суть этого метода заключается в ПЦР-амплификации фрагментов ДНК, содержащих короткие повторяющиеся последовательности, длина которых отличается у двух случайно отобранных индивидов. После амплификации длина полученных фрагментов оценивается с помощью гель-электрофореза или капиллярного электрофореза.
Для этого можно использовать набор Quantifiler DNA Quantification Kit и систему QuantStudio от Termo Fisher Scientific. QuantStudio - это компактный настольный прибор с широким набором функций.
Как и в предыдущем методе, основным идентифицирующим фактором STR-анализа является длина полученных фрагментов, которая уникальна для каждого человека и зависит от количества повторов в анализируемом участке. STR-анализ характеризуется высокой точностью и скоростью, а также низкой стоимостью. Важным условием анализа является качество генетического материала.
STR-анализ появился в практической криминалистике почти двадцать лет назад, но и по сей день остается основным методом идентификации личности. Результаты анализа ДНК подозреваемых и преступников - генетические профили - вносятся криминологами в специальные базы данных.
Таким образом, при обнаружении на местах преступлений биологических следов, из которых можно выделить ДНК, стало возможным идентифицировать всех людей, которые уже попали в поле зрения правоохранительных органов. Эти же маркеры используются для поиска пропавших людей и установления отцовства.
Таким образом, при обнаружении на местах преступлений биологических следов, из которых можно выделить ДНК, стало возможным идентифицировать всех людей, которые уже попали в поле зрения правоохранительных органов. Эти же маркеры используются для поиска пропавших людей и установления отцовства.
Как правило, системы, предназначенные для идентификации личности, позволяют анализировать сразу несколько геномных локусов (10-24), в том числе ген белка амелогенина, по которому определяется пол. Ген амелогенина находится как на X, так и на Y-хромосоме, но отличается по размеру, что позволяет определить пол человека.
Благодаря использованию технологий высокопроизводительного секвенирования криминалистика получила эффективный инструмент, открывающий новые возможности для одновременного анализа множества участков (локусов) ядерного и митохондриального геномов.
Важным преимуществом этих методов является возможность различать даже однояйцевых близнецов (по соматическим мутациям), что невозможно при RFLP- или STR-анализе.
Благодаря использованию технологий высокопроизводительного секвенирования криминалистика получила эффективный инструмент, открывающий новые возможности для одновременного анализа множества участков (локусов) ядерного и митохондриального геномов.
Важным преимуществом этих методов является возможность различать даже однояйцевых близнецов (по соматическим мутациям), что невозможно при RFLP- или STR-анализе.
Во второй части этой публикации мы расскажем о том, как описанные выше методы могут быть использованы для выявления нарколабораторий и наркодилеров, а также о том, как можно запутать криминалистов, подчистив за собой следы.
Читать ЧАСТЬ II
