Аннотация.
Проведение исследования провоспалительных эффектов мефедрона и выявление его этологических характеристик является обязательным этапом изучения 4-MMC, который считается одним из самых популярных психоактивных веществ с точки зрения рекреационного использования. Введение, транспорт и концентрация мефедрона в тканях-мишенях зависит не только от введенной дозы, но и от целого ряда других факторов - распределения вещества, степени и скорости всасывания, путей метаболизма и выведения. На протяжении всего исследования важно определить долю вещества, распределенного в тканях-мишенях или биологических жидкостях, с которыми оно транспортируется, чтобы выяснить, какая часть введенного вещества подвергается биотрансформации, а какая попадает в системное кровообращение в неизменном виде. Также на этапе доклинических испытаний, помимо изучения основных механизмов действия, необходим большой фенотипический скрининг, необходимый для глубокого понимания фармакодинамики и побочных эффектов вещества. Одним из важных аспектов такого скрининга является изучение психоактивных свойств вещества.
Цели исследования.
1. Определить когнитивно-мотивационные и поведенческие паттерны у крыс, которым вводили 4-метилметкатинон.
2. Изучить функцию эндотелия путем проведения сосудистых фармакологических тестов с использованием блокады NO-синтазы под ультразвуковым контролем скорости кровотока в бедренной артерии крыс и лазерной допплеровской флоуметрии для мониторинга общей гемодинамики и скорости микроциркуляции в медиальной мышце.
3. Выявить и оценить провоспалительную и иммунорегуляторную активность 4-метилметкатинона на модели формалин-индуцированного отека лапы и с помощью NBT-теста.
Материалы и методы.
Исследование проведено на 40 крысах-самцах Вистар массой 180-200 г. Было выделено 4 группы: 1) контрольная группа (интактные крысы); 2) крысы, которым каждые 48 часов внутрибрюшинно вводили мефедрон в дозе 5 мг/кг, растворенный в 0,9 растворе NaCl (0,5 мл). 3) Крысы, которым вводили мефедрон перорально (через зонд) каждые 48 часов в дозе 5 мг/кг, растворенной в растворе NaCl 0,9 (0,5 мл). 4) Крысы, которым вводили мефедрон внутрибрюшинно каждые 48 часов в дозе 5 мг/кг, растворенной в растворе NaCl 0,9 (0,5 мл) перед введением формалина для модели формалин-индуцированного отека лап.
Описание и обсуждение исследования.
Определение когнитивно-мотивационных и поведенческих паттернов у крыс, которым вводили 4-метилметкатинон. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: оценить влияние 4-метилметкатинона на уровень возбуждения, тревожности и устойчивости к стрессу у крыс. Для определения психоэмоционального состояния исследуемых животных использовали модернизированный протокол теста Холла, который предполагает размещение объекта в стандартизированной арене и регистрацию показателей активности с помощью программно-аппаратного комплекса PANLAB Harvard Apparatus. В качестве единиц оценки были выбраны дискретные поведенческие акты, зафиксированные с помощью программно-аппаратного комплекса.
Исследование проведено на 30 крысах (группы 1, 2 и 3 соответственно). До начала эксперимента животные содержались в лабораторном виварии по 10 особей в клетке, с неконвертируемым 12-часовым режимом, при комнатной температуре 22-24 °C и влажности 60 %, на стандартном рационе. Эксперименты проводились в летний период. Полученные результаты проверяли на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка и обрабатывали методами вариационной статистики с использованием t-теста Стьюдента и пакета компьютерных программ STATISTICA. На рисунке схематично показан дизайн эксперимента. Для оценки исследовательского поведения регистрировали горизонтальную активность, реакцию груминга, поисковую активность, локомоторную активность, мочеиспускание и дефекацию. Эксперимент проводился в затемненном помещении, изолированном от посторонних шумов и солнечного света, в период с 10 до 14 часов. Открытое поле представляло собой квадратную площадку размером 150x150 см со сторонами высотой 30 см. Температура в помещении поддерживалась на уровне 23 градусов Цельсия. После каждого животного открытое поле дезинфицировали для дезодорации. Перед началом исследования каждой группы в открытое поле выпускали нулевое животное.
На 21-й день крысы были выведены из эксперимента. После анестезии крыс на стационарной платформе проводили изоляцию правой сонной артерии, обнажали медиальную мышцу бедра и катетеризировали левую бедренную вену. Многокомпонентное изучение гемодинамических параметров исследовали методом специализированных провокационных тестов с введением в бедренный катетер ацетилхолина и нитропруссида натрия (NO). Параметры (систолическое артериальное давление, диастолическое артериальное давление, частота сердечных сокращений) регистрировались с помощью датчика TDS. Датчик устанавливали над средней третью правой бедренной артерии и регистрировали следующие показатели: максимальную систолическую (VS) и диастолическую (VD) скорости, среднюю (QAs) и объемную (QAM) скорости кровотока, индекс пульсации (PL, Gosling index) и индекс резистивности (RI, Pourcelot index). Для измерения скорости движения клеток крови в сосудах микроциркуляторного русла использовали иглообразный зонд-сенсор, который помещали в нижнюю треть медиальной широкой мышцы бедра. Вазоактивные вещества (ацетилхолин - 40 мкг/кг, нитропруссид натрия - 30 мкг/кг) вводили через катетер, введенный в левую бедренную вену, последовательно с интервалом в 15 минут. Таким образом, обеспечивалась возможность параллельного мониторинга параметров гемодинамики и микроциркуляции в трехуровневой системе (центральное кровообращение - эластическая сосудистая система - периферическая сосудистая система). Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы STATISTICA 10. Затем рассчитывали коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД). Статистический анализ проводился с помощью рангового теста Спирмена, расчет достоверности между группами осуществлялся с помощью параметрического t-теста Стьюдента.
Представленные диаграммы показывают, что влияние мефедрона на поведение животных соответствует его основным эффектам, связанным с известным механизмом действия. Так, диаграмма 1 иллюстрирует значительное увеличение горизонтальной двигательной активности по сравнению с контрольной группой. Диаграмма 2 показывает, что акты груминга значительно снижаются. Это явление обусловлено снижением мотивационного влияния в отношении текущей потребности. Диаграмма 3 наглядно демонстрирует увеличение актов дефекации и мочеиспускания, что является одним из частых эффектов приема 4-ММЦ. Увеличение горизонтальной активности может указывать на анксиолитические, анксиогенные, агитационные эффекты или на увеличение двигательной активности без эмоционального компонента (двигательное возбуждение). Реакции груминга также могут быть интерпретированы неоднозначно, поскольку частота актов груминга возрастает как в стрессовой, так и в благоприятной обстановке. Проявления исследовательской активности, а также частота мочеиспусканий и дефекаций могут быть интерпретированы наиболее однозначно. Используя этот алгоритм, можно сделать вывод, что фармакодинамический эффект в отношении повышенной нервной активности можно интерпретировать как двигательное возбуждение с эмоциональным компонентом.
В контрольной группе наблюдались однотипные реакции на введение АХЧ и NO, которые проявлялись в виде снижения систолического, диастолического и среднего артериального давления, уменьшения линейной скорости микроциркуляции, а также диастолической скорости движения крови в бедренной артерии (далее ФА), (показатели - Vd, Vad); 2) увеличения систолической скорости движения крови в ФА (VS, Vas), индексов Перселло и Гослинга. Параметры возвращались к исходным значениям в течение 2 минут.
Дальнейшая статистическая обработка проводилась при определении ряда значений во времени для каждой пробы, которые выражались в процентах. Критерий Спирмена, который использовался для статистического анализа, показал наилучшее выражение необходимой разницы статистически значимых параметров. Наибольшая степень корреляции (p<0,05) была установлена между показателем среднего артериального давления (далее - САД), линейной скоростью микроциркуляции, систолической скоростью и разницей систоло-диастолических скоростей в бедренной артерии. Другие сонографические параметры демонстрировали низкую и менее достоверную корреляцию с динамикой артериального давления и скоростью микроциркуляции. Исследование перорального приема 4-ММЦ выявило статистически значимое увеличение показателей САД, ДАД и коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) по сравнению с контрольной группой. Показатели максимальной систолической (МСС) и максимальной диастолической скорости (МДС) достоверно снижаются при проведении провокационных тестов у крыс 3-й группы, которым перорально вводили мефедрон.
Эффективность эндотелий-зависимых факторов релаксации, высвобождаемых и активируемых при введении ацетилхолина, количественно и качественно снижается. Снижается NO-опосредованный эффект в ответ на провокационный тест с АХЧ, что связано с отрицательным влиянием 4-ММЦ на продукцию и экспрессию как этого фактора, так и активности гуанилатциклазы. Эндотелий-зависимое расслабление сосудов микроциркуляторного русла, опосредованное через мускариновые рецепторы, также нарушается вследствие дегенерации рецепторной активности, а также снижения плотности рецепторов на поверхности эндотелиоцитов. Вероятно, механизм снижения ACH-опосредованной эндотелий-зависимой реакции в ответ на применение мефедрона обусловлен значительным увеличением образования свободных радикалов (как супероксидных, так и гидроксильных) в гипоксическом состоянии клетки, которые взаимодействуют с NO2 и NO3.
Отмечено статистически значимое снижение метаболической активности нейтрофилов на 38,4% (Ме = 13,1 с интерквартильным размахом от 10,3 до 15,9 с разницей 5,3 при р=0,002; z = 3,008) по сравнению с показателями контрольной группы. При исследовании поглотительной способности фагоцитоза с добавлением латекса показатели увеличились с 13,1 Ме до 16,5 Ме, при этом процентное увеличение составило 18,2% для группы 3 (внутрибрюшинное введение), однако процентная разница по сравнению с контрольной группой составила 18,0%, что является значимым и статистически достоверным доказательством иммуносупрессивного действия. Также было выявлено статистически значимое снижение спонтанного фагоцитоза в группе 3 на 25,3% (при p>0,0001, z=2,84) по сравнению с интактными животными.
Проведение исследования провоспалительных эффектов мефедрона и выявление его этологических характеристик является обязательным этапом изучения 4-MMC, который считается одним из самых популярных психоактивных веществ с точки зрения рекреационного использования. Введение, транспорт и концентрация мефедрона в тканях-мишенях зависит не только от введенной дозы, но и от целого ряда других факторов - распределения вещества, степени и скорости всасывания, путей метаболизма и выведения. На протяжении всего исследования важно определить долю вещества, распределенного в тканях-мишенях или биологических жидкостях, с которыми оно транспортируется, чтобы выяснить, какая часть введенного вещества подвергается биотрансформации, а какая попадает в системное кровообращение в неизменном виде. Также на этапе доклинических испытаний, помимо изучения основных механизмов действия, необходим большой фенотипический скрининг, необходимый для глубокого понимания фармакодинамики и побочных эффектов вещества. Одним из важных аспектов такого скрининга является изучение психоактивных свойств вещества.
Цели исследования.
1. Определить когнитивно-мотивационные и поведенческие паттерны у крыс, которым вводили 4-метилметкатинон.
2. Изучить функцию эндотелия путем проведения сосудистых фармакологических тестов с использованием блокады NO-синтазы под ультразвуковым контролем скорости кровотока в бедренной артерии крыс и лазерной допплеровской флоуметрии для мониторинга общей гемодинамики и скорости микроциркуляции в медиальной мышце.
3. Выявить и оценить провоспалительную и иммунорегуляторную активность 4-метилметкатинона на модели формалин-индуцированного отека лапы и с помощью NBT-теста.
Материалы и методы.
Исследование проведено на 40 крысах-самцах Вистар массой 180-200 г. Было выделено 4 группы: 1) контрольная группа (интактные крысы); 2) крысы, которым каждые 48 часов внутрибрюшинно вводили мефедрон в дозе 5 мг/кг, растворенный в 0,9 растворе NaCl (0,5 мл). 3) Крысы, которым вводили мефедрон перорально (через зонд) каждые 48 часов в дозе 5 мг/кг, растворенной в растворе NaCl 0,9 (0,5 мл). 4) Крысы, которым вводили мефедрон внутрибрюшинно каждые 48 часов в дозе 5 мг/кг, растворенной в растворе NaCl 0,9 (0,5 мл) перед введением формалина для модели формалин-индуцированного отека лап.
Описание и обсуждение исследования.
Определение когнитивно-мотивационных и поведенческих паттернов у крыс, которым вводили 4-метилметкатинон. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: оценить влияние 4-метилметкатинона на уровень возбуждения, тревожности и устойчивости к стрессу у крыс. Для определения психоэмоционального состояния исследуемых животных использовали модернизированный протокол теста Холла, который предполагает размещение объекта в стандартизированной арене и регистрацию показателей активности с помощью программно-аппаратного комплекса PANLAB Harvard Apparatus. В качестве единиц оценки были выбраны дискретные поведенческие акты, зафиксированные с помощью программно-аппаратного комплекса.
Исследование проведено на 30 крысах (группы 1, 2 и 3 соответственно). До начала эксперимента животные содержались в лабораторном виварии по 10 особей в клетке, с неконвертируемым 12-часовым режимом, при комнатной температуре 22-24 °C и влажности 60 %, на стандартном рационе. Эксперименты проводились в летний период. Полученные результаты проверяли на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка и обрабатывали методами вариационной статистики с использованием t-теста Стьюдента и пакета компьютерных программ STATISTICA. На рисунке схематично показан дизайн эксперимента. Для оценки исследовательского поведения регистрировали горизонтальную активность, реакцию груминга, поисковую активность, локомоторную активность, мочеиспускание и дефекацию. Эксперимент проводился в затемненном помещении, изолированном от посторонних шумов и солнечного света, в период с 10 до 14 часов. Открытое поле представляло собой квадратную площадку размером 150x150 см со сторонами высотой 30 см. Температура в помещении поддерживалась на уровне 23 градусов Цельсия. После каждого животного открытое поле дезинфицировали для дезодорации. Перед началом исследования каждой группы в открытое поле выпускали нулевое животное.
На 21-й день крысы были выведены из эксперимента. После анестезии крыс на стационарной платформе проводили изоляцию правой сонной артерии, обнажали медиальную мышцу бедра и катетеризировали левую бедренную вену. Многокомпонентное изучение гемодинамических параметров исследовали методом специализированных провокационных тестов с введением в бедренный катетер ацетилхолина и нитропруссида натрия (NO). Параметры (систолическое артериальное давление, диастолическое артериальное давление, частота сердечных сокращений) регистрировались с помощью датчика TDS. Датчик устанавливали над средней третью правой бедренной артерии и регистрировали следующие показатели: максимальную систолическую (VS) и диастолическую (VD) скорости, среднюю (QAs) и объемную (QAM) скорости кровотока, индекс пульсации (PL, Gosling index) и индекс резистивности (RI, Pourcelot index). Для измерения скорости движения клеток крови в сосудах микроциркуляторного русла использовали иглообразный зонд-сенсор, который помещали в нижнюю треть медиальной широкой мышцы бедра. Вазоактивные вещества (ацетилхолин - 40 мкг/кг, нитропруссид натрия - 30 мкг/кг) вводили через катетер, введенный в левую бедренную вену, последовательно с интервалом в 15 минут. Таким образом, обеспечивалась возможность параллельного мониторинга параметров гемодинамики и микроциркуляции в трехуровневой системе (центральное кровообращение - эластическая сосудистая система - периферическая сосудистая система). Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы STATISTICA 10. Затем рассчитывали коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД). Статистический анализ проводился с помощью рангового теста Спирмена, расчет достоверности между группами осуществлялся с помощью параметрического t-теста Стьюдента.
Представленные диаграммы показывают, что влияние мефедрона на поведение животных соответствует его основным эффектам, связанным с известным механизмом действия. Так, диаграмма 1 иллюстрирует значительное увеличение горизонтальной двигательной активности по сравнению с контрольной группой. Диаграмма 2 показывает, что акты груминга значительно снижаются. Это явление обусловлено снижением мотивационного влияния в отношении текущей потребности. Диаграмма 3 наглядно демонстрирует увеличение актов дефекации и мочеиспускания, что является одним из частых эффектов приема 4-ММЦ. Увеличение горизонтальной активности может указывать на анксиолитические, анксиогенные, агитационные эффекты или на увеличение двигательной активности без эмоционального компонента (двигательное возбуждение). Реакции груминга также могут быть интерпретированы неоднозначно, поскольку частота актов груминга возрастает как в стрессовой, так и в благоприятной обстановке. Проявления исследовательской активности, а также частота мочеиспусканий и дефекаций могут быть интерпретированы наиболее однозначно. Используя этот алгоритм, можно сделать вывод, что фармакодинамический эффект в отношении повышенной нервной активности можно интерпретировать как двигательное возбуждение с эмоциональным компонентом.
В контрольной группе наблюдались однотипные реакции на введение АХЧ и NO, которые проявлялись в виде снижения систолического, диастолического и среднего артериального давления, уменьшения линейной скорости микроциркуляции, а также диастолической скорости движения крови в бедренной артерии (далее ФА), (показатели - Vd, Vad); 2) увеличения систолической скорости движения крови в ФА (VS, Vas), индексов Перселло и Гослинга. Параметры возвращались к исходным значениям в течение 2 минут.
Дальнейшая статистическая обработка проводилась при определении ряда значений во времени для каждой пробы, которые выражались в процентах. Критерий Спирмена, который использовался для статистического анализа, показал наилучшее выражение необходимой разницы статистически значимых параметров. Наибольшая степень корреляции (p<0,05) была установлена между показателем среднего артериального давления (далее - САД), линейной скоростью микроциркуляции, систолической скоростью и разницей систоло-диастолических скоростей в бедренной артерии. Другие сонографические параметры демонстрировали низкую и менее достоверную корреляцию с динамикой артериального давления и скоростью микроциркуляции. Исследование перорального приема 4-ММЦ выявило статистически значимое увеличение показателей САД, ДАД и коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД) по сравнению с контрольной группой. Показатели максимальной систолической (МСС) и максимальной диастолической скорости (МДС) достоверно снижаются при проведении провокационных тестов у крыс 3-й группы, которым перорально вводили мефедрон.
Эффективность эндотелий-зависимых факторов релаксации, высвобождаемых и активируемых при введении ацетилхолина, количественно и качественно снижается. Снижается NO-опосредованный эффект в ответ на провокационный тест с АХЧ, что связано с отрицательным влиянием 4-ММЦ на продукцию и экспрессию как этого фактора, так и активности гуанилатциклазы. Эндотелий-зависимое расслабление сосудов микроциркуляторного русла, опосредованное через мускариновые рецепторы, также нарушается вследствие дегенерации рецепторной активности, а также снижения плотности рецепторов на поверхности эндотелиоцитов. Вероятно, механизм снижения ACH-опосредованной эндотелий-зависимой реакции в ответ на применение мефедрона обусловлен значительным увеличением образования свободных радикалов (как супероксидных, так и гидроксильных) в гипоксическом состоянии клетки, которые взаимодействуют с NO2 и NO3.
Отмечено статистически значимое снижение метаболической активности нейтрофилов на 38,4% (Ме = 13,1 с интерквартильным размахом от 10,3 до 15,9 с разницей 5,3 при р=0,002; z = 3,008) по сравнению с показателями контрольной группы. При исследовании поглотительной способности фагоцитоза с добавлением латекса показатели увеличились с 13,1 Ме до 16,5 Ме, при этом процентное увеличение составило 18,2% для группы 3 (внутрибрюшинное введение), однако процентная разница по сравнению с контрольной группой составила 18,0%, что является значимым и статистически достоверным доказательством иммуносупрессивного действия. Также было выявлено статистически значимое снижение спонтанного фагоцитоза в группе 3 на 25,3% (при p>0,0001, z=2,84) по сравнению с интактными животными.
- При введении мефедрона экспериментальным животным было зафиксировано статистически значимое изменение анализируемых поведенческих актов. Данный факт указывает на наличие специфической психотропной активности данного соединения, связанной с чрезмерно повышенным уровнем возбуждения и тревожности, однако, со снижением устойчивости к стрессу. Таким образом, результаты исследования на данном этапе расширили информацию о профиле действия соединения. Наблюдаемые психотропные эффекты 4-mmc углубляют понимание его фармакологической активности и должны стать предметом дальнейшего изучения.
- Стойкое повышение параметров артериального давления в исходном состоянии крыс 3-й группы (мефедрон), а также их относительные показатели после провокационных тестов обусловлены нарушением экспрессии не только NO (одного из основных вазодилатирующих факторов, регулирующих работу микроциркуляторных сосудов), но и простациклинов и эндотелиальных факторов гиперполяризации (EDHF). Результаты исследования на данном этапе подтвердили теоретическое предположение о чрезмерном негативном влиянии мефедрона как на эндотелий сосудов микроциркуляторного русла, так и на жизнеспособность сердечно-сосудистой системы в целом. Полученные данные могут быть использованы при планировании доклинических исследований с целью расширения спектра осложнений, связанных с употреблением 4-mmc, а также для построения алгоритма клинических рекомендаций по фармакологической коррекции этих сложных состояний.
- Учитывая, что мефедрон, вероятно, снижает перфузионную проницаемость клеточной стенки и транспортную функцию белков, влияет как на пассивную, так и на облегченную диффузию и активный транспорт, определенным образом влияет на когнитивные паттерны (включая отсроченные явления), а также обладает способностью положительно влиять на коагуляционный компонент гемостаза (гиперкоагуляция), можно предположить преобладание активности ЦОГ-2 как основного фермента, играющего роль в индукции альтернативной фазы воспаления. Таким образом, применение селективных ингибиторов ЦОГ-2 для лечения воспалительных заболеваний у пациентов, использующих 4-ММЦ, является наиболее предпочтительным и оправданным. Однако для точного определения фармакологической терапии, направленной на купирование воспалительных процессов, связанных с применением 4-ММЦ, необходимы дополнительные доклинические исследования.
- Результаты третьего этапа исследования показали снижение метаболической и поглотительной активности нейтрофилов у крыс, относящихся к группе 3 (внутрибрюшинное введение 4-mmc), по сравнению с показателями животных контрольной группы. Это определяет мефедрон как вещество, обладающее иммуносупрессивным действием. Данный вывод является основанием для проведения дальнейших исследований по патогенетической корригирующей иммунотерапии.
Last edited by a moderator: