Мефедрон (4-метилметкатинон) - это β-кетоамфетаминовый стимулятор, имеющий близкое структурное и механическое сходство с метамфетамином. Одним из наиболее мощных действий, связанных с мефедроном, является способность стимулировать высвобождение дофамина (ДА) и блокировать его обратный захват за счет взаимодействия с дофаминовым транспортером (ДАТ). Хотя мефедрон не вызывает токсического воздействия на нервные окончания, содержащие ДА, его способность выступать в качестве блокатора ДАТ может обеспечить защиту от нейротоксичности, вызванной метамфетамином, как и другие ингибиторы ДАТ. Для проверки этой возможности мышей обрабатывали мефедроном (10, 20 или 40 мг/кг) перед каждой инъекцией нейротоксичного метамфетамина (4 инъекции по 2,5 или 5,0 мг/кг с интервалом в 2 часа). Целостность нервных окончаний ДА в стриатуме оценивали по уровню ДА, ДАТ и тирозингидроксилазы. Умеренная или тяжелая токсичность ДА, связанная с различными дозами метамфетамина, не предотвращалась ни одной дозой мефедрона, но, более того, значительно усиливалась. Гипертермия, вызванная комбинированным лечением мефедроном и метамфетамином, была такой же, как и после приема одного из этих препаратов. Мефедрон также усиливал нейротоксическое действие амфетамина и MDMA на нервные окончания DA. Номифензин, напротив, защищал от нейротоксичности, вызванной метамфетамином. Поскольку мефедрон усиливает нейротоксичность метамфетамина, полученные результаты позволяют предположить, что он взаимодействует с ДАТ не так, как другие типичные ингибиторы ДАТ. Относительно безобидное воздействие мефедрона на нервные окончания ДА маскирует потенциально опасное взаимодействие с наркотиками, которые часто употребляются вместе с ним, что приводит к усилению нейротоксичности.
Мефедрон (4-метилметкатинон) - производное катинона и структурный аналог метамфетамина и 3,4-метилендиокси-метамфетамина (МДМА). Мефедрон является одним из психоактивных ингредиентов "солей для ванн" наряду с другими соединениями, такими как метилон, бутилон и 3,4-метилендиоксипировалерон (MDPV). Злоупотребление β-кетоамфетаминами растет во многом благодаря тому, что доступность прекурсоров, необходимых для синтеза метамфетамина и MDMA в подпольных лабораториях, сильно ограничена, а их чистота соответственно снижается (Winstock et al. 2011b, Brunt et al. 2011). По мере роста злоупотребления β-кетоамфетаминами список их побочных эффектов растет и включает в себя сердечно-сосудистые осложнения, возбуждение, бессонницу, психоз и депрессию (Schifano et al. 2011, Prosser and Nelson 2012).
Поскольку β-кетоамфетамины являются химическими сородичами метамфетамина и МДМА, неудивительно, что они оказывают на центральную нервную систему многие из тех же эффектов, что и предыдущие наркотики. Например, эти наркотики блокируют транспортеры дофамина (DA) и серотонина (5-HT) (DAT и SERT, соответственно) (Cozzi et al. 1999, Rothman et al. 2003, Fleckenstein et al. 2000, Lopez-Arnau et al. 2012) и стимулируют высвобождение моноаминов in vitro (Kalix and Glennon 1986, Gygi et al. 1997, Rothman et al. 2003) и in vivo (Gygi et al. 1997, Kehr et al. 2011). Меткатинон вызывает стойкое снижение активности триптофангидроксилазы и тирозингидроксилазы (TH) и истощение ДА и 5-HT (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). Исследования ПЭТ-изображений у лиц, воздерживающихся от употребления меткатинона, выявили уменьшение плотности ДАТ в стриатуме, что свидетельствует о потере терминалей ДА (McCann et al. 1998). Одновременная стимуляция высвобождения ДА и ингибирование его поглощения отражают критические элементы, лежащие в основе нейротоксичности, связанной с метамфетамином (Kuhn et al. 2008, Yamamoto and Bankson 2005, Cadet et al. 2007, Fleckenstein et al. 2007).
Недавно мы (Angoa-Perez et al. 2012) и другие исследователи (Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011) изучили возможность того, что мефедрон может вызывать нейротоксичность, подобно метамфетамину и МДМА. Удивительно, но мефедрон не оказался токсичным для ДА нервных окончаний стриатума (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Вопрос о том, повреждает ли мефедрон нервные окончания 5-HT, остается нерешенным, поскольку в одном исследовании был зафиксирован положительный эффект (Hadlock et al. 2011), а в другом - отрицательный (Baumann et al. 2012). Учитывая относительно благотворное влияние мефедрона на нервные окончания ДА и принимая во внимание его свойства блокатора ДАТ, мы предположили, что он может фактически защищать систему нейронов ДА от нейротоксического воздействия метамфетамина, как это происходит с другими блокаторами ДАТ, такими как амфонеловая кислота (Pu et al. 1994, Schmidt and Gibb 1985, Marek et al. 1990) и номифензин (Poth et al. 2012). В настоящее время мы сообщаем, что мефедрон значительно усиливает нейротоксичность метамфетамина. Этот эффект распространяется и на амфетамин и МДМА - наркотики, которые часто употребляют совместно с мефедроном (Feyissa and Kelly 2008, Schifano et al. 2011). Эти удивительные результаты заставляют по-новому взглянуть на злоупотребление мефедроном и придают актуальность признанию этого тонкого и опасного свойства β-кетоамфетамина.
Материалы и методы
Препараты и реактивы
Гидрохлорид мефедрона и 3,4-метилендиоксиметамфетамин (МДМА) были получены в рамках программы поставок наркотиков NIDA Research Resources. (+) Метамфетамина гидрохлорид, номифензина малеат, d-амфетамина сульфат, пентобарбитал, ДА, а также все буферы и реагенты для ВЭЖХ были приобретены у компании Sigma-Aldrich (Сент-Луис, МО, США). Наборы для анализа белков на бицинхониновую кислоту были получены от Pierce (Rockford, IL, USA). Поликлональные антитела против крысиного TH были получены, как описано ранее (Kuhn and Billingsley 1987). Моноклональные антитела против DAT крысы были щедро предоставлены доктором Роксаной А. Воган (Университет Северной Дакоты, Гранд-Форкс, штат Северный Рейн, США). HRP-конъюгированные анти-IgG вторичные антитела были предоставлены Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA, USA).
Животные
Самки мышей C57BL/6 (Harlan, Indianapolis, IN, USA) весом 20-25 г на момент проведения эксперимента содержались по 5 на клетку в больших клетках с коробками из-под обуви в светлом (12 ч свет/темнота) и контролируемом по температуре помещении. Использовали мышей-самок, поскольку известно, что они очень чувствительны к повреждению нейронов нейротоксичными амфетаминами, а также для поддержания соответствия с нашими предыдущими исследованиями нейротоксичности метамфетамина (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Мыши имели свободный доступ к пище и воде. Комитет по уходу и использованию животных Государственного университета Уэйна одобрил уход за животными и экспериментальные процедуры. Все процедуры также соответствовали Руководству NIH по уходу и использованию лабораторных животных.
Фармакологические, физиологические и поведенческие процедуры
Мыши получали мефедрон по схеме, похожей на дробное введение, состоящей из 4 инъекций по 10, 20 или 40 мг/кг с интервалом в 2 часа между каждой инъекцией. Подобная схема лечения, используемая для введения замещенных амфетаминов и производных катинона, приводит к обширному повреждению нервных окончаний ДА. Ранее было показано, что используемые дозы мефедрона нетоксичны для нервных окончаний ДА (Angoa-Perez et al. 2012). Мышей лечили метамфетамином (4X 2,5 или 5 мг/кг), амфетамином (4X 5 мг/кг) или MDMA (4X 20 мг/кг) отдельно или в комбинации с мефедроном. При лечении двумя препаратами мыши получали инъекцию мефедрона за 30 минут до каждой из 4 инъекций метамфетамина, амфетамина или МДМА. Контрольные особи получали инъекции физиологического раствора по тому же графику, что и мефедрон отдельно или в комбинации с другими амфетаминами. В качестве контроля влияния ингибитора ДАТ на токсичность метамфетамина мышей обрабатывали номифензином (4X 5 мг/кг) за 30 минут до каждой инъекции метамфетамина (4X 5 мг/кг). Все инъекции проводились внутривенно. Мышей приносили в жертву через 2 дня после последнего введения препарата, когда нейротоксичность, связанная с амфетамином, достигала максимума. Температуру тела отслеживали с помощью телеметрии, используя имплантируемые температурные транспондеры IPTT-300 от Bio Medic Data Systems, Inc. (Seaford, DE, USA). Температуру регистрировали неинвазивно каждые 20 мин, начиная за 60 мин до первой инъекции METH и в течение 9 ч после этого с помощью консольной системы DAS-5001 от Bio Medic.
Определение содержания ДА в стриатуме
После лечения ткани стриатума вырезали из мозга билатерально и хранили при -80°C. Замороженные ткани взвешивали и сонировали в 10 объемах 0,16 N перхлорной кислоты при 4°C. Нерастворимый белок удаляли центрифугированием, а ДА определяли методом ВЭЖХ с электрохимической детекцией, как описано ранее для метамфетамина (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
Определение уровней белков TH и DAT методом иммуноблотинга
Влияние лекарственных препаратов на уровень TH и DAT в стриате определяли методом иммуноблотинга как показатель токсичности для нервных окончаний ДА стриаты. Мышей приносили в жертву путем декапитации после лечения и иссекали стриатум билатерально. Ткани хранили при температуре -80°C. Замороженную ткань разрушали с помощью соникации в 1% SDS при 95°C, а нерастворимый материал осаждали центрифугированием. Белок определяли методом бицинхониновой кислоты, равные количества белка (70 мкг/полоса) растворяли в SDS-полиакриламидном гель-электрофорезе и затем наносили на нитроцеллюлозу. Блоты блокировали в Трис забуференном солевом растворе, содержащем Tween 20 (0,1% v/v) и 5% нежирного сухого молока, в течение 1 ч при комнатной температуре. Первичные антитела против TH (1:1000) или DAT (1:1000) добавляли к блотам и оставляли инкубироваться на 16 ч при 4°C. Блоты промывали 3 раза в Tris-buffered saline для удаления непрореагировавших антител и инкубировали с HRP-конъюгированным анти-IgG вторичным антителом (1:4000) в течение 1 ч при комнатной температуре. Иммунореактивные полосы визуализировали с помощью усиленной хемилюминесценции, а относительную плотность TH- и DAT-реактивных полос определяли с помощью Kodak Image Station (Carestream Molecular Systems, Rochester, NY, USA) и количественно оценивали с помощью программы ImageJ (NIH).
Анализ данных
Для анализа влияния дозы метамфетамина и мефедрона на ДА, ДАТ и ТГ проводили двусторонний ANOVA. Влияние препаратов на содержание ДА, ТГ и ДАТ в стриате проверяли на значимость с помощью одностороннего ANOVA с последующим тестом множественных сравнений Тьюки. Результаты воздействия препаратов на температуру тела с течением времени анализировали с помощью двустороннего ANOVA с последующим тестом Бонферрони для определения значимости различий в температуре в отдельные моменты времени после лечения. Различия считались значимыми, если p < 0,05. Все статистические анализы проводились с использованием программы GraphPad Prism версии 5.02 для Windows (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США, www.graphpad.com).
Перейти к:
Результаты
Влияние мефедрона на нейротоксичность, вызванную метамфетамином
Мефедрон в дозах (10, 20 или 40 мг/кг), которые, как известно, не вызывают токсичности нервных окончаний ДА (Angoa-Perez et al. 2012), вводили за 30 минут до каждой инъекции метамфетамина. Метамфетамин вводили в дозах, вызывающих умеренное (4X 2,5 мг/кг) или тяжелое (4X 5 мг/кг) повреждение ДА нервных окончаний стриатума (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). Результаты, представленные на рис. 1, показывают, что основные эффекты дозы метамфетамина (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) и дозы мефедрона (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) на уровень ДА в стриатуме были высоко значимыми по результатам двухстороннего ANOVA. Основной эффект мефедрона в сочетании с метамфетамином в дозе 2,5 мг/кг (F4,22 = 35,96, p < 0,001) или 5,0 мг/кг (F4,17 = 953,9, p < 0,0001) также был высоко значимым по результатам одностороннего ANOVA. Все обработки любой дозой метамфетамина ± мефедрона вызывали значительно большее снижение ДА по сравнению с соответствующим контролем (p < 0,0001 для всех). На рис. 1 также показано, что мефедрон в дозах 20 (p < 0,01) и 40 мг/кг (p < 0,001) значительно усиливал истощающее действие 2,5 мг/кг метамфетамина на ДА, тогда как все дозы мефедрона значительно усиливали действие 5,0 мг/кг метамфетамина на уровень ДА (p < 0,0001 для всех).
Рис.1
Влияние мефедрона на вызванное метамфетамином снижение уровня ДА в стриатуме. Мышей обрабатывали указанными дозами мефедрона (MEPH) за 30 мин до каждой инъекции 2,5 (-) или 5,0 мг/кг (■) метамфетамина (METH) и жертвовали через 2 дня для определения уровня ДА в стриате методом ВЭЖХ. Данные представляют собой средние ± SEM для 5-7 мышей в группе. Некоторые столбики ошибок слишком малы, чтобы превысить размер символов, и не видны. ***p < 0,001 по сравнению с контролем и #p < 0,01, ##p < 0,001 или ###p < 0,0001 по сравнению с соответствующей дозой метамфетамина (тест множественного сравнения Тьюки).
На рис. 2а показано, что мефедрон значительно усиливал вызванное метамфетамином снижение уровня ДАТ, как было определено с помощью иммуноблотинга. Иммуноблоты были количественно оценены, и в соответствии с результатами для ДА, основные эффекты дозы метамфетамина (F1,92 = 9,48, p < 0,001) и дозы мефедрона (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) на уровни ДАТ в стриатуме были высоко значимыми по результатам двустороннего ANOVA (рис. 2b). Основной эффект мефедрона в сочетании с метамфетамином в дозе 2,5 мг/кг (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) или 5,0 мг/кг (F4,39 = 24,84, p < 0,0001) также был высоко значимым по результатам одностороннего ANOVA. Все обработки любой дозой метамфетамина ± мефедрона вызывали значительно большее снижение DAT по сравнению с соответствующим контролем (p < 0,01 для 2,5 мг/кг метамфетамина; p < 0,0001 для всех остальных обработок). На рис. 2b также показано, что мефедрон в дозах 20 мг/кг (p < 0,01) и 40 мг/кг (p < 0,001) значительно усиливал снижение ДАТ, вызванное 2,5 мг/кг метамфетамина, тогда как только доза мефедрона 40 мг/кг значительно усиливала (p < 0,01) влияние 5,0 мг/кг метамфетамина на снижение ДАТ.
Рис.2
Влияние мефедрона на вызванное метамфетамином сокращение стриатума DAT. Мышей обрабатывали указанными дозами мефедрона (MEPH) за 30 мин до каждой инъекции 2,5 (●) или 5,0 мг/кг (■) метамфетамина (METH) и жертвовали через 2 дня для определения уровня ДАТ в стриате методом иммуноблотинга (а). Количественная оценка блотов проводилась с помощью программы ImageJ, а данные представляют собой средние ± SEM для 10-12 мышей на группу (b). *p < 0,01 или ***p < 0,0001 по сравнению с контролем (C) и #p < 0,01 или ##p < 0,001 по сравнению с соответствующей дозой метамфетамина (тест множественного сравнения Тьюки).
На рис. 3а показано, что мефедрон значительно усиливал вызванное метамфетамином снижение уровня TH, как было определено с помощью иммуноблотинга. Иммуноблоты были количественно оценены, и в соответствии с результатами, полученными выше для DA и DAT, основные эффекты дозы метамфетамина (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) и дозы мефедрона (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) были высоко значимыми по результатам двустороннего ANOVA (рис. 3b). Основной эффект мефедрона в сочетании с метамфетамином в дозе 2,5 мг/кг (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) или 5,0 мг/кг (F4,49 = 99,16, p < 0,0001) также был высоко значимым по результатам одностороннего ANOVA. Все обработки любой дозой метамфетамина ± мефедрона вызывали значительно большее снижение TH по сравнению с соответствующим контролем (p < 0,001 для 2,5 мг/кг метамфетамина + 10 мг/кг мефедрона; p < 0,0001 для всех других комбинаций), за исключением 2,5 мг/кг метамфетамина, который не привел к значительному изменению уровня TH (т.е. токсичности не было). На рис. 3b также показано, что мефедрон в дозах 20 мг/кг (p < 0,01) и 40 мг/кг (p < 0,001) значительно усиливал снижение уровня TH, вызванное 2,5 мг/кг метамфетамина, и все три дозы мефедрона значительно (p < 0,0001) усиливали влияние 5,0 мг/кг метамфетамина на снижение уровня TH.
Рис. 3
Влияние мефедрона на вызванное метамфетамином снижение стриатального TH. Мышей обрабатывали указанными дозами мефедрона (MEPH) за 30 мин до каждой инъекции 2,5 (●) или 5,0 мг/кг (■) метамфетамина (METH) и через 2 дня приносили в жертву для определения уровня TH в стриате методом иммуноблотинга (а). Количественная оценка блотов проводилась с помощью ImageJ, а данные представляют собой средние ± SEM для 10-12 мышей в каждой группе (b). Некоторые столбики ошибок слишком малы, чтобы превысить размер символов, и не видны. **p < 0,001 или ***p < 0,0001 по сравнению с контролем (C) и #p < 0,01, ##p < 0,001 или ###p < 0,0001) по сравнению с соответствующей дозой метамфетамина (тест множественного сравнения Тьюки).
Влияние мефедрона на гипертермию, вызванную метамфетамином
Мефедрон, как и метамфетамин, вызывает значительную гипертермию (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Когда мефедрон давали за 30 минут до каждой инъекции метамфетамина, на рис. 4 видно, что основные эффекты доз метамфетамина и мефедрона (F1,300 = 11,99, p < 0,0001) и времени (F4,300 = 51,73, p < 0,0001) были высоко значимыми по результатам двустороннего ANOVA. Основные эффекты мефедрона в сочетании с метамфетамином в дозе 2,5 мг/кг (F4,120 = 41,44, p < 0,0001, панель a) по времени (F30,120 = 3,84, p < 0,0001) или метамфетамином в дозе 5,0 мг/кг (F4,120 = 78,09, p < 0,0001, панель b) по времени (F30,120 = 9,98, p < 0,0001) также были высоко значимыми с помощью двустороннего ANOVA. Все виды лечения с использованием любой дозы метамфетамина ± мефедрона значительно отличались от соответствующих контролей (p < 0,0001 для всех видов лечения).
Рис. 4
Влияние мефедрона на гипертермию, вызванную метамфетамином. Мышей обрабатывали указанными дозами мефедрона (MEPH) за 30 мин до каждой инъекции 2,5 (а) или 5,0 мг/кг (б) метамфетамина (METH). Температуру тела измеряли с интервалом 20 мин с помощью телеметрии, начиная за 60 мин до первой инъекции метамфетамина. Четыре инъекции метамфетамина обозначены стрелками, покоящимися на оси x. Данные выражены как средняя температура тела 6-8 мышей в группе. SEM всегда составляли менее 10 % от среднего значения и опущены для наглядности.
Влияние мефедрона на нейротоксичность, вызванную амфетамином и МДМА
Чтобы проверить, может ли усиливающее действие мефедрона на метамфетамин распространяться на другие нейротоксичные амфетамины, мышей обрабатывали β-кетоамфетамином (20 мг/кг) плюс амфетамином (4X 5 мг/кг) или МДМА (4X 20 мг/кг), и результаты представлены на рис. 5. Напомним, что сам по себе мефедрон не снижает уровень стриатума DA, DAT или TH (Angoa-Perez et al. 2012). Основной эффект препарата (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) был высоко значимым при одностороннем ANOVA для снижения ДА (рис. 5а). На рис. 5а также видно, что все виды лечения амфетамином (p < 0,001) или MDMA (p < 0,001) отдельно или в комбинации с мефедроном (p < 0,0001 для обоих препаратов) значительно снижали уровень ДА по сравнению с контролем. Мефедрон значительно усиливал снижение уровня ДА, вызванное амфетамином (p < 0,01) или МДМА (p < 0,01). На рис. 5b показано аналогичное влияние комбинированных препаратов на уровень ДАТ в стриатуме. Основной эффект препарата (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) был высоко значимым по результатам одностороннего ANOVA для DAT. На рис. 5b также видно, что при всех обработках амфетамином или МДМА уровень ДАТ был значительно (p < 0,0001 для всех) ниже по сравнению с контролем. Мефедрон также значительно усилил снижение ДАТ, вызванное амфетамином или МДМА (p < 0,0001 в обоих случаях). Наконец, на рис. 5c показано, что основной эффект препарата (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) был высоко значимым по результатам одностороннего ANOVA для снижения TH. На рис. 5c также видно, что все виды лечения амфетамином или MDMA значительно (p < 0,0001 для всех) снижали TH по сравнению с контролем. Мефедрон также значительно усилил снижение TH, вызванное амфетамином или МДМА (p < 0,0001 в обоих случаях).
Рис. 5
Влияние мефедрона на нейротоксичность нервных окончаний DA, вызванную амфетамином или МДМА. Мышей обрабатывали 20 мг/кг мефедрона (MEPH) за 30 мин до каждой инъекции 5,0 мг/кг амфетамина (AMPH) или 20 мг/кг MDMA и жертвовали через 2 дня после обработки для определения уровня (а) ДА в стриате с помощью ВЭЖХ. (b) DAT и (c) TH определяли методом иммуноблотинга и количественно оценивали с помощью ImageJ. Репрезентативные иммуноблоты для DAT и TH включены в качестве вставок в панели (b) и (c), соответственно, а методы лечения для обеих панелей обозначены 1,5: контроль; 2,6: MEPH; 3: AMPH; 4: AMPH + MEPH; 7: MDMA; и 8: MDMA + MEPH. Данные представляют собой среднее ± SEM для 5-12 мышей в каждой группе. **p < 0,001 или ***p < 0,0001 по сравнению с контролем и #p < 0,01 или ###p < 0,0001 по сравнению с AMPH или MDMA (тест множественного сравнения Тьюки).
Влияние номифензина на нейротоксичность, вызванную метамфетамином
Номифензин, мощный блокатор ДАТ, не обладающий известным злоупотреблением или нейротоксическим потенциалом, был протестирован на способность защищать от нейротоксичности, вызванной метамфетамином, и на контраст с действием мефедрона на токсичность для нервных окончаний ДА, вызванную метамфетамином, амфетамином и МДМА. Результаты на рис. 6а показывают, что основной эффект препарата (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) на уровень ДА был высоко значимым при одностороннем ANOVA. Номифензин сам по себе не изменял уровень ДА, но снижение, вызванное метамфетамином (p < 0,0001), было слегка, но значительно отменено номифензином (p < 0,01). Основной эффект препарата (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) на уровни ДАТ был высоко значимым по результатам одностороннего ANOVA, как показано на рис. 6b. Номифензин не изменял уровень ДАТ, но обеспечивал значительную защиту (p < 0,001) от снижения уровня ДАТ в стриатуме под действием метамфетамина (p < 0,0001) по сравнению с контролем. Наконец, на рис. 6c показано, что основной эффект препарата (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) на уровни TH был высоко значимым по результатам одностороннего ANOVA. Как и в случае с DA и DAT, снижение уровня TH, вызванное метамфетамином (p < 0,0001), незначительно, но существенно предотвращалось номифензином (p < 0,01).
Рис. 6
Влияние номифензина на вызванную метамфетамином нейротоксичность нервных окончаний ДА. Мышей обрабатывали 5,0 мг/кг номифензина (NOM) за 30 мин до каждой инъекции 5,0 мг/кг метамфетамина (METH) и жертвовали через 2 дня для определения уровня (а) ДА в стриате с помощью ВЭЖХ. (b) DAT и (c) TH определяли методом иммуноблотинга и количественно оценивали с помощью ImageJ. Репрезентативные иммуноблоты для DAT и TH включены в качестве вставок в панели (b) и (c) соответственно. Данные представляют собой среднее значение плюс SEM для 5-7 мышей в группе. ***p < 0,0001 по сравнению с контролем (C) и #p < 0,01 или ##p < 0,001 по сравнению только с метамфетамином (тест множественного сравнения Тьюки).
Обсуждение
Целью настоящего исследования было определить, предотвратит ли мефедрон токсичность нервных окончаний ДА, вызванную метамфетамином. Исходя из его химического сходства с метамфетамином и МДМА, изначально предполагалось, что мефедрон будет оказывать повреждающее действие на систему ДА-нейронов. Однако в нескольких исследованиях практически одновременно было установлено, что мефедрон не токсичен для нервных окончаний ДА (Angoa-Perez et al. 2012, Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011). Вопрос о том, вызывает ли этот препарат повреждение системы 5-HT-нейронов, остается открытым. В одном исследовании сообщалось о стойком снижении функции 5-HT нервных окончаний (Hadlock et al. 2011), в то время как в другом было установлено, что мефедрон не вызывает повреждений (Baumann et al. 2012). Мефедрон взаимодействует с нервным окончанием ДА таким образом, что можно предположить, что он действительно стимулирует высвобождение и блокирует обратный захват ДА через взаимодействие с ДАТ. Ключевым аспектом нейротоксического механизма действия метамфетамина является его способность получать доступ к нервным окончаниям ДА через ДАТ и нарушать гомеостаз ДА (Sulzer 2011). Если предотвратить этот ранний этап нейротоксического каскада метамфетамина путем ингибирования ДАТ, токсичность будет предотвращена (Pu et al. 1994, Poth et al. 2012, Marek et al. 1990, Schmidt and Gibb 1985). Мы предположили, что мефедрон может обладать тем же защитным свойством, что и другие ингибиторы ДАТ, но вместо этого наблюдали значительное усиление токсичности. Это взаимодействие наблюдалось при использовании двух различных доз метамфетамина, вызывающих умеренное или сильное повреждение нервных окончаний ДА (4X 2,5 или 5,0 мг/кг, соответственно). Этот потенцирующий эффект мефедрона не ограничивался метамфетамином и распространялся на амфетамин и MDMA, два наркотика, которые часто употребляют совместно с мефедроном и другими β-кетоамфетаминами (Feyissa and Kelly 2008, Schifano et al. 2011, Kelly 2011). Таким образом, несмотря на то, что мефедрон не вызывает токсичности по крайней мере для ДА нервных окончаний стриатума, он потенцирует нейротоксическое действие других наркотиков, вызывающих злоупотребление. Эта новая находка должна представить злоупотребление мефедроном в еще более резком свете, поскольку отсутствие присущей ему нейротоксичности может создать впечатление его безобидности.
Гипертермия - часто сообщаемый острый побочный эффект приема метамфетамина (Greene et al. 2008) и β-кетоамфетамина у людей (Borek and Holstege 2012, Prosser and Nelson 2012). Как и метамфетамин, многие β-кетоамфетаминовые препараты также вызывают значительное повышение температуры тела у грызунов (Angoa-Perez et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Rockhold et al. 1997). Хотя гипертермия, вызываемая метамфетамином, может способствовать его морфологическим и повреждающим нейроны эффектам, не обязательно, что гипертермия является непосредственной причиной этих эффектов (Kiyatkin and Sharma 2009). Мы регистрировали температуру тела у мышей, обработанных мефедроном и метамфетамином, и отметили, что совместное лечение не привело к повышению температуры сверх максимального повышения, наблюдавшегося после приема одного из препаратов. Метамфетамин вызывал дозозависимое повышение температуры тела, и эта гипертермия была неизменной во всем диапазоне доз мефедрона. Более того, падение температуры тела после инъекции мефедрона (Angoa-Perez et al. 2012) сохранялось и при более высоких дозах мефедрона плюс метамфетамина. Даже если вызванная наркотиком гипертермия не усиливалась при комбинированном лечении, нейротоксические эффекты были аддитивными. Поэтому, по крайней мере в данном случае, нейротоксическое действие метамфетамина может быть усилено мефедроном независимо от гипертермии.
Мефедрон четко ингибирует функцию ДАТ и блокирует обратный захват ДА in vitro (Lopez-Arnau et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Kehr et al. 2011, Martinez-Clemente et al. 2012, Cozzi et al. 1999). Мефедрон вытесняет WIN-35,428 из места его связывания с ДАТ, что позволяет предположить, что он является конкурентным ингибитором поглощения ДА (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). В этом отношении мефедрон очень похож на метамфетамин (Cozzi et al. 1999) и МДМА (Escubedo et al. 2011). Неизвестно, переносится ли мефедрон через DAT, но меткатинон переносится (Cozzi and Foley 2003). Номифензин и амфонеловая кислота, которые связываются с ДАТ и ингибируют поглощение ДА, обеспечивают существенную защиту от нейротоксичности, вызванной метамфетамином (Pu et al. 1994, Marek et al. 1990, Schmidt and Gibb 1985, Poth et al. 2012), а мыши, лишенные ДАТ, устойчивы к нейронной токсичности метамфетамина (Fumagalli et al. 1998). Зная, что мефедрон не обладает нейротоксичностью и является блокатором ДАТ, можно предположить, что он должен предотвращать токсичность. Мы протестировали номифензин в этом отношении в качестве положительного контроля и подтвердили, что он защищает от вызванного метамфетамином истощения DA, DAT и TH. Номифензин также ингибирует транспортер норадреналина (Brogden et al. 1979), но это свойство не может объяснить настоящие результаты, поскольку большинство β-кетоамфетаминов, включая мефедрон, ингибируют транспортер норадреналина и блокируют поглощение норадреналина (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). Роль системы 5-HT-нейронов в некоторых фармакологических действиях мефедрона возможна в свете способности этого препарата, как и MDMA (Yamamoto et al. 1995), вызывать отток стриатумного ДА через взаимодействие с 5-HT2A-рецепторами (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). Гиперлокомоция, вызываемая мефедроном, зависит от эндогенного 5-HT (Lopez-Arnau et al. 2012), и этот препарат также стимулирует высвобождение 5-HT и ингибирует его поглощение in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) и in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). Однако мы можем исключить роль эндогенного 5-HT в нейротоксичности ДА, по крайней мере метамфетамина, показав, что мыши, генетически лишенные 5-HT, сохраняют чувствительность к нейротоксичности (Thomas et al. 2010).
Мефедрон может усиливать нейротоксичность метамфетамина за счет нескольких возможных механизмов. Во-первых, мефедрон может взаимодействовать с VMAT, вызывая утечку ДА в цитоплазму пресинаптического нервного окончания. Лекарства, увеличивающие цитоплазматический пул (т.е. высвобождаемый из организма) ДА, усиливают нейротоксичность метамфетамина (Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009, Schmidt et al. 1985). Этот механизм маловероятен, поскольку меткатинон слабо взаимодействует с ВМАТ (Cozzi et al. 1999). Во-вторых, комбинация мефедрона и метамфетамина могла бы оказывать синергическое действие на невезикулярное высвобождение ДА, но эта возможность также кажется маловероятной в свете результатов, показывающих, что обработка DAT- или SERT-экспрессирующих клеток CHO метилоном и метамфетамином не оказывает аддитивного эффекта на высвобождение ДА или 5-HT (Sogawa et al. 2011). В-третьих, мефедрон может взаимодействовать с DAT новым способом, который способствует аддитивной токсичности. Было показано, что метилон в сочетании с метамфетамином вызывает синергетическую цитотоксичность в клетках CHO, экспрессирующих DAT или SERT, но не в клетках CHO дикого типа, лишенных этих транспортеров (Sogawa et al. 2011). Цитотоксичность, наблюдаемая в культивируемых клетках в этих исследованиях (т.е. высвобождение ЛДГ), сильно отличается от повреждения нервных окончаний ДА, вызванного метамфетамином, но этот механизм предполагает интересную, но неопределенную роль ДАТ в повышенной цитотоксичности. Наконец, мефедрон может изменить метаболизм метамфетамина. Мефедрон в основном метаболизируется путем N-деметилирования (Meyer and Maurer 2010), как и метамфетамин и МДМА (Caldwell 1976). В пользу этого механизма говорит тот факт, что метамфетамин и МДМА взаимно ингибируют выработку своих первичных метаболитов и повышают уровень наркотика в плазме крови выше, чем после приема одного из них (Kuwayama et al. 2012). Дозы мефедрона, использованные в настоящее время и в нашем предыдущем исследовании (Angoa-Perez et al. 2012), хотя и высоки, но не являются нейротоксичными и попадают в диапазон, которым злоупотребляют люди (McErath and O'Neill 2011). Таким образом, мефедрон может действовать подобно МДМА, повышая плазменный уровень метамфетамина за счет ингибирования его метаболизма. Для подтверждения последней возможности потребуется углубленный фармакокинетический анализ.
Злоупотребление β-кетоамфетаминами растет угрожающими темпами, и мефедрон сегодня является одним из самых распространенных наркотиков после каннабиса, МДМА и кокаина (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Кроме того, мефедрон вызывает у людей более сильное чувство тяги по сравнению с МДМА (Brunt et al. 2011), а потребители, нюхающие мефедрон, оценивают его как вызывающий большую зависимость, чем кокаин (Winstock et al. 2011b). Мефедрон потребляется людьми в виде перепоя (т. е. "стакинга") и часто принимается вместе с другими наркотиками, такими как каннабис и амфетаминовые психостимуляторы (Schifano et al. 2011, Fass et al. 2012, Winstock et al. 2011a, Kelly 2011, Torrance and Cooper 2010). Мефедрон все чаще встречается в таблетках, продаваемых под видом МДМА (Brunt et al. 2011), и его потребление, вероятно, превысит потребление МДМА, поскольку чистота этого последнего наркотика продолжает снижаться (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Исходя из распространенных моделей злоупотребления мефедроном и другими компонентами "солей для ванн", важно рассмотреть вопрос о том, возникает ли дополнительный риск для здоровья человека при намеренном или ненамеренном сочетании этих наркотиков с амфетаминами. Наши результаты, показывающие, что по крайней мере мефедрон значительно усиливает нейротоксичность нервных окончаний стриатума, вызванную метамфетамином, амфетамином и MDMA, раскрывают особенно опасное и неожиданное свойство этого β-кетоамфетамина.
Используемые сокращения
5-HT серотонин
DA дофамин
DAT DA транспортер
MDMA 3,4-метилендиоксиметамфетамин
TH тирозингидроксилаза
VMAT везикулярный транспортер моноаминов
Мефедрон (4-метилметкатинон) - производное катинона и структурный аналог метамфетамина и 3,4-метилендиокси-метамфетамина (МДМА). Мефедрон является одним из психоактивных ингредиентов "солей для ванн" наряду с другими соединениями, такими как метилон, бутилон и 3,4-метилендиоксипировалерон (MDPV). Злоупотребление β-кетоамфетаминами растет во многом благодаря тому, что доступность прекурсоров, необходимых для синтеза метамфетамина и MDMA в подпольных лабораториях, сильно ограничена, а их чистота соответственно снижается (Winstock et al. 2011b, Brunt et al. 2011). По мере роста злоупотребления β-кетоамфетаминами список их побочных эффектов растет и включает в себя сердечно-сосудистые осложнения, возбуждение, бессонницу, психоз и депрессию (Schifano et al. 2011, Prosser and Nelson 2012).
Поскольку β-кетоамфетамины являются химическими сородичами метамфетамина и МДМА, неудивительно, что они оказывают на центральную нервную систему многие из тех же эффектов, что и предыдущие наркотики. Например, эти наркотики блокируют транспортеры дофамина (DA) и серотонина (5-HT) (DAT и SERT, соответственно) (Cozzi et al. 1999, Rothman et al. 2003, Fleckenstein et al. 2000, Lopez-Arnau et al. 2012) и стимулируют высвобождение моноаминов in vitro (Kalix and Glennon 1986, Gygi et al. 1997, Rothman et al. 2003) и in vivo (Gygi et al. 1997, Kehr et al. 2011). Меткатинон вызывает стойкое снижение активности триптофангидроксилазы и тирозингидроксилазы (TH) и истощение ДА и 5-HT (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). Исследования ПЭТ-изображений у лиц, воздерживающихся от употребления меткатинона, выявили уменьшение плотности ДАТ в стриатуме, что свидетельствует о потере терминалей ДА (McCann et al. 1998). Одновременная стимуляция высвобождения ДА и ингибирование его поглощения отражают критические элементы, лежащие в основе нейротоксичности, связанной с метамфетамином (Kuhn et al. 2008, Yamamoto and Bankson 2005, Cadet et al. 2007, Fleckenstein et al. 2007).
Недавно мы (Angoa-Perez et al. 2012) и другие исследователи (Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011) изучили возможность того, что мефедрон может вызывать нейротоксичность, подобно метамфетамину и МДМА. Удивительно, но мефедрон не оказался токсичным для ДА нервных окончаний стриатума (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Вопрос о том, повреждает ли мефедрон нервные окончания 5-HT, остается нерешенным, поскольку в одном исследовании был зафиксирован положительный эффект (Hadlock et al. 2011), а в другом - отрицательный (Baumann et al. 2012). Учитывая относительно благотворное влияние мефедрона на нервные окончания ДА и принимая во внимание его свойства блокатора ДАТ, мы предположили, что он может фактически защищать систему нейронов ДА от нейротоксического воздействия метамфетамина, как это происходит с другими блокаторами ДАТ, такими как амфонеловая кислота (Pu et al. 1994, Schmidt and Gibb 1985, Marek et al. 1990) и номифензин (Poth et al. 2012). В настоящее время мы сообщаем, что мефедрон значительно усиливает нейротоксичность метамфетамина. Этот эффект распространяется и на амфетамин и МДМА - наркотики, которые часто употребляют совместно с мефедроном (Feyissa and Kelly 2008, Schifano et al. 2011). Эти удивительные результаты заставляют по-новому взглянуть на злоупотребление мефедроном и придают актуальность признанию этого тонкого и опасного свойства β-кетоамфетамина.
Материалы и методы
Препараты и реактивы
Гидрохлорид мефедрона и 3,4-метилендиоксиметамфетамин (МДМА) были получены в рамках программы поставок наркотиков NIDA Research Resources. (+) Метамфетамина гидрохлорид, номифензина малеат, d-амфетамина сульфат, пентобарбитал, ДА, а также все буферы и реагенты для ВЭЖХ были приобретены у компании Sigma-Aldrich (Сент-Луис, МО, США). Наборы для анализа белков на бицинхониновую кислоту были получены от Pierce (Rockford, IL, USA). Поликлональные антитела против крысиного TH были получены, как описано ранее (Kuhn and Billingsley 1987). Моноклональные антитела против DAT крысы были щедро предоставлены доктором Роксаной А. Воган (Университет Северной Дакоты, Гранд-Форкс, штат Северный Рейн, США). HRP-конъюгированные анти-IgG вторичные антитела были предоставлены Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA, USA).
Животные
Самки мышей C57BL/6 (Harlan, Indianapolis, IN, USA) весом 20-25 г на момент проведения эксперимента содержались по 5 на клетку в больших клетках с коробками из-под обуви в светлом (12 ч свет/темнота) и контролируемом по температуре помещении. Использовали мышей-самок, поскольку известно, что они очень чувствительны к повреждению нейронов нейротоксичными амфетаминами, а также для поддержания соответствия с нашими предыдущими исследованиями нейротоксичности метамфетамина (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Мыши имели свободный доступ к пище и воде. Комитет по уходу и использованию животных Государственного университета Уэйна одобрил уход за животными и экспериментальные процедуры. Все процедуры также соответствовали Руководству NIH по уходу и использованию лабораторных животных.
Фармакологические, физиологические и поведенческие процедуры
Мыши получали мефедрон по схеме, похожей на дробное введение, состоящей из 4 инъекций по 10, 20 или 40 мг/кг с интервалом в 2 часа между каждой инъекцией. Подобная схема лечения, используемая для введения замещенных амфетаминов и производных катинона, приводит к обширному повреждению нервных окончаний ДА. Ранее было показано, что используемые дозы мефедрона нетоксичны для нервных окончаний ДА (Angoa-Perez et al. 2012). Мышей лечили метамфетамином (4X 2,5 или 5 мг/кг), амфетамином (4X 5 мг/кг) или MDMA (4X 20 мг/кг) отдельно или в комбинации с мефедроном. При лечении двумя препаратами мыши получали инъекцию мефедрона за 30 минут до каждой из 4 инъекций метамфетамина, амфетамина или МДМА. Контрольные особи получали инъекции физиологического раствора по тому же графику, что и мефедрон отдельно или в комбинации с другими амфетаминами. В качестве контроля влияния ингибитора ДАТ на токсичность метамфетамина мышей обрабатывали номифензином (4X 5 мг/кг) за 30 минут до каждой инъекции метамфетамина (4X 5 мг/кг). Все инъекции проводились внутривенно. Мышей приносили в жертву через 2 дня после последнего введения препарата, когда нейротоксичность, связанная с амфетамином, достигала максимума. Температуру тела отслеживали с помощью телеметрии, используя имплантируемые температурные транспондеры IPTT-300 от Bio Medic Data Systems, Inc. (Seaford, DE, USA). Температуру регистрировали неинвазивно каждые 20 мин, начиная за 60 мин до первой инъекции METH и в течение 9 ч после этого с помощью консольной системы DAS-5001 от Bio Medic.
Определение содержания ДА в стриатуме
После лечения ткани стриатума вырезали из мозга билатерально и хранили при -80°C. Замороженные ткани взвешивали и сонировали в 10 объемах 0,16 N перхлорной кислоты при 4°C. Нерастворимый белок удаляли центрифугированием, а ДА определяли методом ВЭЖХ с электрохимической детекцией, как описано ранее для метамфетамина (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
Определение уровней белков TH и DAT методом иммуноблотинга
Влияние лекарственных препаратов на уровень TH и DAT в стриате определяли методом иммуноблотинга как показатель токсичности для нервных окончаний ДА стриаты. Мышей приносили в жертву путем декапитации после лечения и иссекали стриатум билатерально. Ткани хранили при температуре -80°C. Замороженную ткань разрушали с помощью соникации в 1% SDS при 95°C, а нерастворимый материал осаждали центрифугированием. Белок определяли методом бицинхониновой кислоты, равные количества белка (70 мкг/полоса) растворяли в SDS-полиакриламидном гель-электрофорезе и затем наносили на нитроцеллюлозу. Блоты блокировали в Трис забуференном солевом растворе, содержащем Tween 20 (0,1% v/v) и 5% нежирного сухого молока, в течение 1 ч при комнатной температуре. Первичные антитела против TH (1:1000) или DAT (1:1000) добавляли к блотам и оставляли инкубироваться на 16 ч при 4°C. Блоты промывали 3 раза в Tris-buffered saline для удаления непрореагировавших антител и инкубировали с HRP-конъюгированным анти-IgG вторичным антителом (1:4000) в течение 1 ч при комнатной температуре. Иммунореактивные полосы визуализировали с помощью усиленной хемилюминесценции, а относительную плотность TH- и DAT-реактивных полос определяли с помощью Kodak Image Station (Carestream Molecular Systems, Rochester, NY, USA) и количественно оценивали с помощью программы ImageJ (NIH).
Анализ данных
Для анализа влияния дозы метамфетамина и мефедрона на ДА, ДАТ и ТГ проводили двусторонний ANOVA. Влияние препаратов на содержание ДА, ТГ и ДАТ в стриате проверяли на значимость с помощью одностороннего ANOVA с последующим тестом множественных сравнений Тьюки. Результаты воздействия препаратов на температуру тела с течением времени анализировали с помощью двустороннего ANOVA с последующим тестом Бонферрони для определения значимости различий в температуре в отдельные моменты времени после лечения. Различия считались значимыми, если p < 0,05. Все статистические анализы проводились с использованием программы GraphPad Prism версии 5.02 для Windows (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США, www.graphpad.com).
Перейти к:
Результаты
Влияние мефедрона на нейротоксичность, вызванную метамфетамином
Мефедрон в дозах (10, 20 или 40 мг/кг), которые, как известно, не вызывают токсичности нервных окончаний ДА (Angoa-Perez et al. 2012), вводили за 30 минут до каждой инъекции метамфетамина. Метамфетамин вводили в дозах, вызывающих умеренное (4X 2,5 мг/кг) или тяжелое (4X 5 мг/кг) повреждение ДА нервных окончаний стриатума (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). Результаты, представленные на рис. 1, показывают, что основные эффекты дозы метамфетамина (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) и дозы мефедрона (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) на уровень ДА в стриатуме были высоко значимыми по результатам двухстороннего ANOVA. Основной эффект мефедрона в сочетании с метамфетамином в дозе 2,5 мг/кг (F4,22 = 35,96, p < 0,001) или 5,0 мг/кг (F4,17 = 953,9, p < 0,0001) также был высоко значимым по результатам одностороннего ANOVA. Все обработки любой дозой метамфетамина ± мефедрона вызывали значительно большее снижение ДА по сравнению с соответствующим контролем (p < 0,0001 для всех). На рис. 1 также показано, что мефедрон в дозах 20 (p < 0,01) и 40 мг/кг (p < 0,001) значительно усиливал истощающее действие 2,5 мг/кг метамфетамина на ДА, тогда как все дозы мефедрона значительно усиливали действие 5,0 мг/кг метамфетамина на уровень ДА (p < 0,0001 для всех).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/sywobkqrnd-jpg.47/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Рис.1
Влияние мефедрона на вызванное метамфетамином снижение уровня ДА в стриатуме. Мышей обрабатывали указанными дозами мефедрона (MEPH) за 30 мин до каждой инъекции 2,5 (-) или 5,0 мг/кг (■) метамфетамина (METH) и жертвовали через 2 дня для определения уровня ДА в стриате методом ВЭЖХ. Данные представляют собой средние ± SEM для 5-7 мышей в группе. Некоторые столбики ошибок слишком малы, чтобы превысить размер символов, и не видны. ***p < 0,001 по сравнению с контролем и #p < 0,01, ##p < 0,001 или ###p < 0,0001 по сравнению с соответствующей дозой метамфетамина (тест множественного сравнения Тьюки).
На рис. 2а показано, что мефедрон значительно усиливал вызванное метамфетамином снижение уровня ДАТ, как было определено с помощью иммуноблотинга. Иммуноблоты были количественно оценены, и в соответствии с результатами для ДА, основные эффекты дозы метамфетамина (F1,92 = 9,48, p < 0,001) и дозы мефедрона (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) на уровни ДАТ в стриатуме были высоко значимыми по результатам двустороннего ANOVA (рис. 2b). Основной эффект мефедрона в сочетании с метамфетамином в дозе 2,5 мг/кг (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) или 5,0 мг/кг (F4,39 = 24,84, p < 0,0001) также был высоко значимым по результатам одностороннего ANOVA. Все обработки любой дозой метамфетамина ± мефедрона вызывали значительно большее снижение DAT по сравнению с соответствующим контролем (p < 0,01 для 2,5 мг/кг метамфетамина; p < 0,0001 для всех остальных обработок). На рис. 2b также показано, что мефедрон в дозах 20 мг/кг (p < 0,01) и 40 мг/кг (p < 0,001) значительно усиливал снижение ДАТ, вызванное 2,5 мг/кг метамфетамина, тогда как только доза мефедрона 40 мг/кг значительно усиливала (p < 0,01) влияние 5,0 мг/кг метамфетамина на снижение ДАТ.
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/bfu3sx5dnr-jpg.4797/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Рис.2
Влияние мефедрона на вызванное метамфетамином сокращение стриатума DAT. Мышей обрабатывали указанными дозами мефедрона (MEPH) за 30 мин до каждой инъекции 2,5 (●) или 5,0 мг/кг (■) метамфетамина (METH) и жертвовали через 2 дня для определения уровня ДАТ в стриате методом иммуноблотинга (а). Количественная оценка блотов проводилась с помощью программы ImageJ, а данные представляют собой средние ± SEM для 10-12 мышей на группу (b). *p < 0,01 или ***p < 0,0001 по сравнению с контролем (C) и #p < 0,01 или ##p < 0,001 по сравнению с соответствующей дозой метамфетамина (тест множественного сравнения Тьюки).
На рис. 3а показано, что мефедрон значительно усиливал вызванное метамфетамином снижение уровня TH, как было определено с помощью иммуноблотинга. Иммуноблоты были количественно оценены, и в соответствии с результатами, полученными выше для DA и DAT, основные эффекты дозы метамфетамина (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) и дозы мефедрона (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) были высоко значимыми по результатам двустороннего ANOVA (рис. 3b). Основной эффект мефедрона в сочетании с метамфетамином в дозе 2,5 мг/кг (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) или 5,0 мг/кг (F4,49 = 99,16, p < 0,0001) также был высоко значимым по результатам одностороннего ANOVA. Все обработки любой дозой метамфетамина ± мефедрона вызывали значительно большее снижение TH по сравнению с соответствующим контролем (p < 0,001 для 2,5 мг/кг метамфетамина + 10 мг/кг мефедрона; p < 0,0001 для всех других комбинаций), за исключением 2,5 мг/кг метамфетамина, который не привел к значительному изменению уровня TH (т.е. токсичности не было). На рис. 3b также показано, что мефедрон в дозах 20 мг/кг (p < 0,01) и 40 мг/кг (p < 0,001) значительно усиливал снижение уровня TH, вызванное 2,5 мг/кг метамфетамина, и все три дозы мефедрона значительно (p < 0,0001) усиливали влияние 5,0 мг/кг метамфетамина на снижение уровня TH.
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/tggfrjpqru-jpg.4798/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Рис. 3
Влияние мефедрона на вызванное метамфетамином снижение стриатального TH. Мышей обрабатывали указанными дозами мефедрона (MEPH) за 30 мин до каждой инъекции 2,5 (●) или 5,0 мг/кг (■) метамфетамина (METH) и через 2 дня приносили в жертву для определения уровня TH в стриате методом иммуноблотинга (а). Количественная оценка блотов проводилась с помощью ImageJ, а данные представляют собой средние ± SEM для 10-12 мышей в каждой группе (b). Некоторые столбики ошибок слишком малы, чтобы превысить размер символов, и не видны. **p < 0,001 или ***p < 0,0001 по сравнению с контролем (C) и #p < 0,01, ##p < 0,001 или ###p < 0,0001) по сравнению с соответствующей дозой метамфетамина (тест множественного сравнения Тьюки).
Влияние мефедрона на гипертермию, вызванную метамфетамином
Мефедрон, как и метамфетамин, вызывает значительную гипертермию (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Когда мефедрон давали за 30 минут до каждой инъекции метамфетамина, на рис. 4 видно, что основные эффекты доз метамфетамина и мефедрона (F1,300 = 11,99, p < 0,0001) и времени (F4,300 = 51,73, p < 0,0001) были высоко значимыми по результатам двустороннего ANOVA. Основные эффекты мефедрона в сочетании с метамфетамином в дозе 2,5 мг/кг (F4,120 = 41,44, p < 0,0001, панель a) по времени (F30,120 = 3,84, p < 0,0001) или метамфетамином в дозе 5,0 мг/кг (F4,120 = 78,09, p < 0,0001, панель b) по времени (F30,120 = 9,98, p < 0,0001) также были высоко значимыми с помощью двустороннего ANOVA. Все виды лечения с использованием любой дозы метамфетамина ± мефедрона значительно отличались от соответствующих контролей (p < 0,0001 для всех видов лечения).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/x0ik9hdwsw-jpg.4799/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Рис. 4
Влияние мефедрона на гипертермию, вызванную метамфетамином. Мышей обрабатывали указанными дозами мефедрона (MEPH) за 30 мин до каждой инъекции 2,5 (а) или 5,0 мг/кг (б) метамфетамина (METH). Температуру тела измеряли с интервалом 20 мин с помощью телеметрии, начиная за 60 мин до первой инъекции метамфетамина. Четыре инъекции метамфетамина обозначены стрелками, покоящимися на оси x. Данные выражены как средняя температура тела 6-8 мышей в группе. SEM всегда составляли менее 10 % от среднего значения и опущены для наглядности.
Влияние мефедрона на нейротоксичность, вызванную амфетамином и МДМА
Чтобы проверить, может ли усиливающее действие мефедрона на метамфетамин распространяться на другие нейротоксичные амфетамины, мышей обрабатывали β-кетоамфетамином (20 мг/кг) плюс амфетамином (4X 5 мг/кг) или МДМА (4X 20 мг/кг), и результаты представлены на рис. 5. Напомним, что сам по себе мефедрон не снижает уровень стриатума DA, DAT или TH (Angoa-Perez et al. 2012). Основной эффект препарата (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) был высоко значимым при одностороннем ANOVA для снижения ДА (рис. 5а). На рис. 5а также видно, что все виды лечения амфетамином (p < 0,001) или MDMA (p < 0,001) отдельно или в комбинации с мефедроном (p < 0,0001 для обоих препаратов) значительно снижали уровень ДА по сравнению с контролем. Мефедрон значительно усиливал снижение уровня ДА, вызванное амфетамином (p < 0,01) или МДМА (p < 0,01). На рис. 5b показано аналогичное влияние комбинированных препаратов на уровень ДАТ в стриатуме. Основной эффект препарата (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) был высоко значимым по результатам одностороннего ANOVA для DAT. На рис. 5b также видно, что при всех обработках амфетамином или МДМА уровень ДАТ был значительно (p < 0,0001 для всех) ниже по сравнению с контролем. Мефедрон также значительно усилил снижение ДАТ, вызванное амфетамином или МДМА (p < 0,0001 в обоих случаях). Наконец, на рис. 5c показано, что основной эффект препарата (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) был высоко значимым по результатам одностороннего ANOVA для снижения TH. На рис. 5c также видно, что все виды лечения амфетамином или MDMA значительно (p < 0,0001 для всех) снижали TH по сравнению с контролем. Мефедрон также значительно усилил снижение TH, вызванное амфетамином или МДМА (p < 0,0001 в обоих случаях).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/onvypkgxvn-jpg.4800/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Рис. 5
Влияние мефедрона на нейротоксичность нервных окончаний DA, вызванную амфетамином или МДМА. Мышей обрабатывали 20 мг/кг мефедрона (MEPH) за 30 мин до каждой инъекции 5,0 мг/кг амфетамина (AMPH) или 20 мг/кг MDMA и жертвовали через 2 дня после обработки для определения уровня (а) ДА в стриате с помощью ВЭЖХ. (b) DAT и (c) TH определяли методом иммуноблотинга и количественно оценивали с помощью ImageJ. Репрезентативные иммуноблоты для DAT и TH включены в качестве вставок в панели (b) и (c), соответственно, а методы лечения для обеих панелей обозначены 1,5: контроль; 2,6: MEPH; 3: AMPH; 4: AMPH + MEPH; 7: MDMA; и 8: MDMA + MEPH. Данные представляют собой среднее ± SEM для 5-12 мышей в каждой группе. **p < 0,001 или ***p < 0,0001 по сравнению с контролем и #p < 0,01 или ###p < 0,0001 по сравнению с AMPH или MDMA (тест множественного сравнения Тьюки).
Влияние номифензина на нейротоксичность, вызванную метамфетамином
Номифензин, мощный блокатор ДАТ, не обладающий известным злоупотреблением или нейротоксическим потенциалом, был протестирован на способность защищать от нейротоксичности, вызванной метамфетамином, и на контраст с действием мефедрона на токсичность для нервных окончаний ДА, вызванную метамфетамином, амфетамином и МДМА. Результаты на рис. 6а показывают, что основной эффект препарата (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) на уровень ДА был высоко значимым при одностороннем ANOVA. Номифензин сам по себе не изменял уровень ДА, но снижение, вызванное метамфетамином (p < 0,0001), было слегка, но значительно отменено номифензином (p < 0,01). Основной эффект препарата (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) на уровни ДАТ был высоко значимым по результатам одностороннего ANOVA, как показано на рис. 6b. Номифензин не изменял уровень ДАТ, но обеспечивал значительную защиту (p < 0,001) от снижения уровня ДАТ в стриатуме под действием метамфетамина (p < 0,0001) по сравнению с контролем. Наконец, на рис. 6c показано, что основной эффект препарата (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) на уровни TH был высоко значимым по результатам одностороннего ANOVA. Как и в случае с DA и DAT, снижение уровня TH, вызванное метамфетамином (p < 0,0001), незначительно, но существенно предотвращалось номифензином (p < 0,01).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/daczg9cwfv-jpg.4801/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Рис. 6
Влияние номифензина на вызванную метамфетамином нейротоксичность нервных окончаний ДА. Мышей обрабатывали 5,0 мг/кг номифензина (NOM) за 30 мин до каждой инъекции 5,0 мг/кг метамфетамина (METH) и жертвовали через 2 дня для определения уровня (а) ДА в стриате с помощью ВЭЖХ. (b) DAT и (c) TH определяли методом иммуноблотинга и количественно оценивали с помощью ImageJ. Репрезентативные иммуноблоты для DAT и TH включены в качестве вставок в панели (b) и (c) соответственно. Данные представляют собой среднее значение плюс SEM для 5-7 мышей в группе. ***p < 0,0001 по сравнению с контролем (C) и #p < 0,01 или ##p < 0,001 по сравнению только с метамфетамином (тест множественного сравнения Тьюки).
Обсуждение
Целью настоящего исследования было определить, предотвратит ли мефедрон токсичность нервных окончаний ДА, вызванную метамфетамином. Исходя из его химического сходства с метамфетамином и МДМА, изначально предполагалось, что мефедрон будет оказывать повреждающее действие на систему ДА-нейронов. Однако в нескольких исследованиях практически одновременно было установлено, что мефедрон не токсичен для нервных окончаний ДА (Angoa-Perez et al. 2012, Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011). Вопрос о том, вызывает ли этот препарат повреждение системы 5-HT-нейронов, остается открытым. В одном исследовании сообщалось о стойком снижении функции 5-HT нервных окончаний (Hadlock et al. 2011), в то время как в другом было установлено, что мефедрон не вызывает повреждений (Baumann et al. 2012). Мефедрон взаимодействует с нервным окончанием ДА таким образом, что можно предположить, что он действительно стимулирует высвобождение и блокирует обратный захват ДА через взаимодействие с ДАТ. Ключевым аспектом нейротоксического механизма действия метамфетамина является его способность получать доступ к нервным окончаниям ДА через ДАТ и нарушать гомеостаз ДА (Sulzer 2011). Если предотвратить этот ранний этап нейротоксического каскада метамфетамина путем ингибирования ДАТ, токсичность будет предотвращена (Pu et al. 1994, Poth et al. 2012, Marek et al. 1990, Schmidt and Gibb 1985). Мы предположили, что мефедрон может обладать тем же защитным свойством, что и другие ингибиторы ДАТ, но вместо этого наблюдали значительное усиление токсичности. Это взаимодействие наблюдалось при использовании двух различных доз метамфетамина, вызывающих умеренное или сильное повреждение нервных окончаний ДА (4X 2,5 или 5,0 мг/кг, соответственно). Этот потенцирующий эффект мефедрона не ограничивался метамфетамином и распространялся на амфетамин и MDMA, два наркотика, которые часто употребляют совместно с мефедроном и другими β-кетоамфетаминами (Feyissa and Kelly 2008, Schifano et al. 2011, Kelly 2011). Таким образом, несмотря на то, что мефедрон не вызывает токсичности по крайней мере для ДА нервных окончаний стриатума, он потенцирует нейротоксическое действие других наркотиков, вызывающих злоупотребление. Эта новая находка должна представить злоупотребление мефедроном в еще более резком свете, поскольку отсутствие присущей ему нейротоксичности может создать впечатление его безобидности.
Гипертермия - часто сообщаемый острый побочный эффект приема метамфетамина (Greene et al. 2008) и β-кетоамфетамина у людей (Borek and Holstege 2012, Prosser and Nelson 2012). Как и метамфетамин, многие β-кетоамфетаминовые препараты также вызывают значительное повышение температуры тела у грызунов (Angoa-Perez et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Rockhold et al. 1997). Хотя гипертермия, вызываемая метамфетамином, может способствовать его морфологическим и повреждающим нейроны эффектам, не обязательно, что гипертермия является непосредственной причиной этих эффектов (Kiyatkin and Sharma 2009). Мы регистрировали температуру тела у мышей, обработанных мефедроном и метамфетамином, и отметили, что совместное лечение не привело к повышению температуры сверх максимального повышения, наблюдавшегося после приема одного из препаратов. Метамфетамин вызывал дозозависимое повышение температуры тела, и эта гипертермия была неизменной во всем диапазоне доз мефедрона. Более того, падение температуры тела после инъекции мефедрона (Angoa-Perez et al. 2012) сохранялось и при более высоких дозах мефедрона плюс метамфетамина. Даже если вызванная наркотиком гипертермия не усиливалась при комбинированном лечении, нейротоксические эффекты были аддитивными. Поэтому, по крайней мере в данном случае, нейротоксическое действие метамфетамина может быть усилено мефедроном независимо от гипертермии.
Мефедрон четко ингибирует функцию ДАТ и блокирует обратный захват ДА in vitro (Lopez-Arnau et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Kehr et al. 2011, Martinez-Clemente et al. 2012, Cozzi et al. 1999). Мефедрон вытесняет WIN-35,428 из места его связывания с ДАТ, что позволяет предположить, что он является конкурентным ингибитором поглощения ДА (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). В этом отношении мефедрон очень похож на метамфетамин (Cozzi et al. 1999) и МДМА (Escubedo et al. 2011). Неизвестно, переносится ли мефедрон через DAT, но меткатинон переносится (Cozzi and Foley 2003). Номифензин и амфонеловая кислота, которые связываются с ДАТ и ингибируют поглощение ДА, обеспечивают существенную защиту от нейротоксичности, вызванной метамфетамином (Pu et al. 1994, Marek et al. 1990, Schmidt and Gibb 1985, Poth et al. 2012), а мыши, лишенные ДАТ, устойчивы к нейронной токсичности метамфетамина (Fumagalli et al. 1998). Зная, что мефедрон не обладает нейротоксичностью и является блокатором ДАТ, можно предположить, что он должен предотвращать токсичность. Мы протестировали номифензин в этом отношении в качестве положительного контроля и подтвердили, что он защищает от вызванного метамфетамином истощения DA, DAT и TH. Номифензин также ингибирует транспортер норадреналина (Brogden et al. 1979), но это свойство не может объяснить настоящие результаты, поскольку большинство β-кетоамфетаминов, включая мефедрон, ингибируют транспортер норадреналина и блокируют поглощение норадреналина (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). Роль системы 5-HT-нейронов в некоторых фармакологических действиях мефедрона возможна в свете способности этого препарата, как и MDMA (Yamamoto et al. 1995), вызывать отток стриатумного ДА через взаимодействие с 5-HT2A-рецепторами (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). Гиперлокомоция, вызываемая мефедроном, зависит от эндогенного 5-HT (Lopez-Arnau et al. 2012), и этот препарат также стимулирует высвобождение 5-HT и ингибирует его поглощение in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) и in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). Однако мы можем исключить роль эндогенного 5-HT в нейротоксичности ДА, по крайней мере метамфетамина, показав, что мыши, генетически лишенные 5-HT, сохраняют чувствительность к нейротоксичности (Thomas et al. 2010).
Мефедрон может усиливать нейротоксичность метамфетамина за счет нескольких возможных механизмов. Во-первых, мефедрон может взаимодействовать с VMAT, вызывая утечку ДА в цитоплазму пресинаптического нервного окончания. Лекарства, увеличивающие цитоплазматический пул (т.е. высвобождаемый из организма) ДА, усиливают нейротоксичность метамфетамина (Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009, Schmidt et al. 1985). Этот механизм маловероятен, поскольку меткатинон слабо взаимодействует с ВМАТ (Cozzi et al. 1999). Во-вторых, комбинация мефедрона и метамфетамина могла бы оказывать синергическое действие на невезикулярное высвобождение ДА, но эта возможность также кажется маловероятной в свете результатов, показывающих, что обработка DAT- или SERT-экспрессирующих клеток CHO метилоном и метамфетамином не оказывает аддитивного эффекта на высвобождение ДА или 5-HT (Sogawa et al. 2011). В-третьих, мефедрон может взаимодействовать с DAT новым способом, который способствует аддитивной токсичности. Было показано, что метилон в сочетании с метамфетамином вызывает синергетическую цитотоксичность в клетках CHO, экспрессирующих DAT или SERT, но не в клетках CHO дикого типа, лишенных этих транспортеров (Sogawa et al. 2011). Цитотоксичность, наблюдаемая в культивируемых клетках в этих исследованиях (т.е. высвобождение ЛДГ), сильно отличается от повреждения нервных окончаний ДА, вызванного метамфетамином, но этот механизм предполагает интересную, но неопределенную роль ДАТ в повышенной цитотоксичности. Наконец, мефедрон может изменить метаболизм метамфетамина. Мефедрон в основном метаболизируется путем N-деметилирования (Meyer and Maurer 2010), как и метамфетамин и МДМА (Caldwell 1976). В пользу этого механизма говорит тот факт, что метамфетамин и МДМА взаимно ингибируют выработку своих первичных метаболитов и повышают уровень наркотика в плазме крови выше, чем после приема одного из них (Kuwayama et al. 2012). Дозы мефедрона, использованные в настоящее время и в нашем предыдущем исследовании (Angoa-Perez et al. 2012), хотя и высоки, но не являются нейротоксичными и попадают в диапазон, которым злоупотребляют люди (McErath and O'Neill 2011). Таким образом, мефедрон может действовать подобно МДМА, повышая плазменный уровень метамфетамина за счет ингибирования его метаболизма. Для подтверждения последней возможности потребуется углубленный фармакокинетический анализ.
Злоупотребление β-кетоамфетаминами растет угрожающими темпами, и мефедрон сегодня является одним из самых распространенных наркотиков после каннабиса, МДМА и кокаина (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Кроме того, мефедрон вызывает у людей более сильное чувство тяги по сравнению с МДМА (Brunt et al. 2011), а потребители, нюхающие мефедрон, оценивают его как вызывающий большую зависимость, чем кокаин (Winstock et al. 2011b). Мефедрон потребляется людьми в виде перепоя (т. е. "стакинга") и часто принимается вместе с другими наркотиками, такими как каннабис и амфетаминовые психостимуляторы (Schifano et al. 2011, Fass et al. 2012, Winstock et al. 2011a, Kelly 2011, Torrance and Cooper 2010). Мефедрон все чаще встречается в таблетках, продаваемых под видом МДМА (Brunt et al. 2011), и его потребление, вероятно, превысит потребление МДМА, поскольку чистота этого последнего наркотика продолжает снижаться (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Исходя из распространенных моделей злоупотребления мефедроном и другими компонентами "солей для ванн", важно рассмотреть вопрос о том, возникает ли дополнительный риск для здоровья человека при намеренном или ненамеренном сочетании этих наркотиков с амфетаминами. Наши результаты, показывающие, что по крайней мере мефедрон значительно усиливает нейротоксичность нервных окончаний стриатума, вызванную метамфетамином, амфетамином и MDMA, раскрывают особенно опасное и неожиданное свойство этого β-кетоамфетамина.
Используемые сокращения
5-HT серотонин
DA дофамин
DAT DA транспортер
MDMA 3,4-метилендиоксиметамфетамин
TH тирозингидроксилаза
VMAT везикулярный транспортер моноаминов
