Úvod
L-fenylacetylkarbinol je zlúčenina používaná pri syntéze efedrínu, ktorý sa sám používa ako prekurzor amfetamínov. Priemyselne sa syntetizuje aeróbnou fermentáciou benzaldehydu pomocou pekárskych kvasiniek (S. cerevisiae/SC). Hoci je tento proces pomerne jednoduchý, môže si vyžadovať trochu vybavenia a znalostí, najmä ak hovoríme o udržiavaní sterilných kultúr a správnych rastových podmienok. Vysvetlím preto dve rôzne sofistikované metódy výroby L-PAC prostredníctvom biotransformácie. Rastové médium by sa malo pred použitím sterilizovať autoklávovaním.
Prvá metóda:
Túto techniku možno označiť ako "nedbalú, ale jednoduchú". Vyžaduje si menej vybavenia, je jednoduchšia, ale je aj menej účinná a jej výsledkom budú nižšie výťažky.
Postup:
Do 500 ml sterilného 0,1M citrátového pufru s pH 6 pridajte 44 g kvasiniek a 55 g glukózy. Umiestnite do vodného kúpeľa zahriateho na 30 °C. Inkubujte 40/50 minút.
Pridajte benzaldehyd (25 mmol) v 5 ml etanolu a acetaldehyd (25 mmol). Inkubujte 60 minút.
Prefiltrujte cez Celit.
Extrahujte 3*100 ml etylacetátu. Emulziu rozdeľte pomocou nasýteného roztoku chloridu sodného, vysušte nad bezvodým síranom sodným, prefiltrujte, odparte rozpúšťadlo. Toto je váš L-PAC.
Vysvetlenia:
Citrátový tlmivý roztok: používa sa na udržanie stabilného pH, pretože rast bunky ho bude postupne znižovať (čo nie je dobré). Na prípravu tohto pufru postupujte podľa postupov uvedených v tejto kalkulačke: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Nezabudnite zmeniť pH na 6.
Teplota: umožňuje vyššiu metabolickú aktivitu kvasiniek.
Etanol: používa sa na rozpustenie benzaldehydu a acetaldehydu a zvyšuje ich biologickú dostupnosť.
Acetaldehyd: používa sa ako akceptor vodíka namiesto benzaldehydu, čím sa obmedzuje produkcia benzylalkoholu.
Ide o jednoduchý postup, ktorý môže dodržať takmer každý po troche čítania o štandardných sterilných technikách, ale dáva nižšie výťažky ako druhý postup (medzi 20 až 40 %). Dá sa zlepšiť buď lepším prevzdušňovaním pomocou orbitálneho trepania pri 150 otáčkach za minútu, alebo vháňaním sterilného vzduchu do média, pričom na liter média pripadá 1 l vzduchu za minútu, alebo imobilizáciou buniek v alginátových guličkách. Môžete si to vyhľadať na youtube, je to veľmi jednoduché a môže to výrazne zvýšiť výnosy.
Druhá metóda:
Tento protokol je pokročilejší, ale pri správnom postupe môže zvýšiť výťažok až o 60 alebo 70 %. Vyžaduje si však viac materiálu. Aj keď nie je dokonalý, je oveľa lepší.
Táto metóda bola navrhnutá pre kvasinky Candida utilis namiesto S. cerevisiae. Namiesto nej môžete použiť SC, ale zaznamenáte zníženie výťažkov. C. utilis si môžete kúpiť tu: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Postup
Rastové médium sa skladá z 10 g/l močoviny (prináša dusík), 10 g/l MgSO4 (prináša horčík a síru) a 50 až 70 g/l cukru pomocou melasy. Rozpustite v primeranom objeme 0,1M citrátového pufru s pH 6.
Deň predtým naočkujte počiatočnú kultúru kvasiniek a inkubujte pri 30 °C cez noc.
Odčítajte optickú hustotu (absorbanciu) pri 595 nm. Naočkujte svoj fermentačný reaktor 15 % v/v východiskovej kultúry upravenej na hodnotu 0,4 OD. Príklad: Ak chcete naočkovať nádobu s objemom 1 l, ak bola nameraná OD 0,2, pridajte 300 ml na 700 ml. Ak je OD už 0,4, pridajte 150 ml na 850 ml atď... (240x106 buniek/ml v inokuláte, pozri vysvetlenia)
Inkubujte pri teplote 30 °C s orbitálnym trepaním pri 150 otáčkach za minútu alebo s čerpaním sterilného vzduchu rýchlosťou 1 v/v/min. Ak čerpáte vzduch, možno budete chcieť pridať pomalé miešanie.
Inkubujte, kým OD nedosiahne hodnotu 0,3 až 0,4. To by malo trvať 4 až 6 hodín, môže to byť menej alebo viac. Každých 30 minút kontrolujte OD, kým nedosiahnete požadovanú hodnotu.
Pridávanie benzaldehydu sa vykonáva vo viacerých dávkach. Pre 50 ml sú objemy 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. V rovnakom čase pridajte ekvivalentný objem acetaldehydu. Medzi jednotlivými pridaniami počkajte jednu hodinu.
Extrahujte v pomere 1:2 toluén/medium v/v, odparte.
Vysvetlenie:
Optická hustota: meria sa pomocou spektrofotometra. Tu odčítame absorbanciu pri 595 nm, ktorá je úmerná počtu buniek v roztoku. Ako pravidlo si zapamätajte, že 0,1 OD=60x10^6 buniek/ml
Všeobecné poznámky:
Na prevzdušnenie je v malom meradle lepšie orbitálne trepanie pri 150 otáčkach za minútu. Vo väčšom meradle budete potrebovať bublinkový vzduch prechádzajúci cez filter.
V druhom protokole sa pridávanie benzaldehydu vykonáva vo viacerých dávkach, aby sa zvýšili výťažky. To sa dá ďalej zlepšiť kontinuálnym vstrekovaním benzaldehydu v klesajúcej rýchlosti, ale to je v amatérskom prostredí zložité.
Môžu sa použiť substituované benzaldehydy a získa sa príslušný analóg L-PAC.
Nakoniec si môžete požičať niektoré prvky metódy 2 a začleniť ich do metódy 1, aby ste si prispôsobili experimentálny dizajn podľa svojich predstáv. Uvedomte si, že je možné použiť aj iné kmene a druhy, čím sa výrazne zvýšia výťažky. Viac informácií nájdete v dokumente "Production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeasts in melasses and sugar cane juice as production medium" od Raviho a kol.
L-fenylacetylkarbinol je zlúčenina používaná pri syntéze efedrínu, ktorý sa sám používa ako prekurzor amfetamínov. Priemyselne sa syntetizuje aeróbnou fermentáciou benzaldehydu pomocou pekárskych kvasiniek (S. cerevisiae/SC). Hoci je tento proces pomerne jednoduchý, môže si vyžadovať trochu vybavenia a znalostí, najmä ak hovoríme o udržiavaní sterilných kultúr a správnych rastových podmienok. Vysvetlím preto dve rôzne sofistikované metódy výroby L-PAC prostredníctvom biotransformácie. Rastové médium by sa malo pred použitím sterilizovať autoklávovaním.
Prvá metóda:
Túto techniku možno označiť ako "nedbalú, ale jednoduchú". Vyžaduje si menej vybavenia, je jednoduchšia, ale je aj menej účinná a jej výsledkom budú nižšie výťažky.
Postup:
Do 500 ml sterilného 0,1M citrátového pufru s pH 6 pridajte 44 g kvasiniek a 55 g glukózy. Umiestnite do vodného kúpeľa zahriateho na 30 °C. Inkubujte 40/50 minút.
Pridajte benzaldehyd (25 mmol) v 5 ml etanolu a acetaldehyd (25 mmol). Inkubujte 60 minút.
Prefiltrujte cez Celit.
Extrahujte 3*100 ml etylacetátu. Emulziu rozdeľte pomocou nasýteného roztoku chloridu sodného, vysušte nad bezvodým síranom sodným, prefiltrujte, odparte rozpúšťadlo. Toto je váš L-PAC.
Vysvetlenia:
Citrátový tlmivý roztok: používa sa na udržanie stabilného pH, pretože rast bunky ho bude postupne znižovať (čo nie je dobré). Na prípravu tohto pufru postupujte podľa postupov uvedených v tejto kalkulačke: https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/citrate-buffer-ph-3-to-6-2. Nezabudnite zmeniť pH na 6.
Teplota: umožňuje vyššiu metabolickú aktivitu kvasiniek.
Etanol: používa sa na rozpustenie benzaldehydu a acetaldehydu a zvyšuje ich biologickú dostupnosť.
Acetaldehyd: používa sa ako akceptor vodíka namiesto benzaldehydu, čím sa obmedzuje produkcia benzylalkoholu.
Ide o jednoduchý postup, ktorý môže dodržať takmer každý po troche čítania o štandardných sterilných technikách, ale dáva nižšie výťažky ako druhý postup (medzi 20 až 40 %). Dá sa zlepšiť buď lepším prevzdušňovaním pomocou orbitálneho trepania pri 150 otáčkach za minútu, alebo vháňaním sterilného vzduchu do média, pričom na liter média pripadá 1 l vzduchu za minútu, alebo imobilizáciou buniek v alginátových guličkách. Môžete si to vyhľadať na youtube, je to veľmi jednoduché a môže to výrazne zvýšiť výnosy.
Druhá metóda:
Tento protokol je pokročilejší, ale pri správnom postupe môže zvýšiť výťažok až o 60 alebo 70 %. Vyžaduje si však viac materiálu. Aj keď nie je dokonalý, je oveľa lepší.
Táto metóda bola navrhnutá pre kvasinky Candida utilis namiesto S. cerevisiae. Namiesto nej môžete použiť SC, ale zaznamenáte zníženie výťažkov. C. utilis si môžete kúpiť tu: https://www.biomall.in/product/candida-utilis-atcc-9950-0779p-0779p
Postup
Rastové médium sa skladá z 10 g/l močoviny (prináša dusík), 10 g/l MgSO4 (prináša horčík a síru) a 50 až 70 g/l cukru pomocou melasy. Rozpustite v primeranom objeme 0,1M citrátového pufru s pH 6.
Deň predtým naočkujte počiatočnú kultúru kvasiniek a inkubujte pri 30 °C cez noc.
Odčítajte optickú hustotu (absorbanciu) pri 595 nm. Naočkujte svoj fermentačný reaktor 15 % v/v východiskovej kultúry upravenej na hodnotu 0,4 OD. Príklad: Ak chcete naočkovať nádobu s objemom 1 l, ak bola nameraná OD 0,2, pridajte 300 ml na 700 ml. Ak je OD už 0,4, pridajte 150 ml na 850 ml atď... (240x106 buniek/ml v inokuláte, pozri vysvetlenia)
Inkubujte pri teplote 30 °C s orbitálnym trepaním pri 150 otáčkach za minútu alebo s čerpaním sterilného vzduchu rýchlosťou 1 v/v/min. Ak čerpáte vzduch, možno budete chcieť pridať pomalé miešanie.
Inkubujte, kým OD nedosiahne hodnotu 0,3 až 0,4. To by malo trvať 4 až 6 hodín, môže to byť menej alebo viac. Každých 30 minút kontrolujte OD, kým nedosiahnete požadovanú hodnotu.
Pridávanie benzaldehydu sa vykonáva vo viacerých dávkach. Pre 50 ml sú objemy 68, 62, 56, 50, 43, 37, 31, 25. V rovnakom čase pridajte ekvivalentný objem acetaldehydu. Medzi jednotlivými pridaniami počkajte jednu hodinu.
Extrahujte v pomere 1:2 toluén/medium v/v, odparte.
Vysvetlenie:
Optická hustota: meria sa pomocou spektrofotometra. Tu odčítame absorbanciu pri 595 nm, ktorá je úmerná počtu buniek v roztoku. Ako pravidlo si zapamätajte, že 0,1 OD=60x10^6 buniek/ml
Všeobecné poznámky:
Na prevzdušnenie je v malom meradle lepšie orbitálne trepanie pri 150 otáčkach za minútu. Vo väčšom meradle budete potrebovať bublinkový vzduch prechádzajúci cez filter.
V druhom protokole sa pridávanie benzaldehydu vykonáva vo viacerých dávkach, aby sa zvýšili výťažky. To sa dá ďalej zlepšiť kontinuálnym vstrekovaním benzaldehydu v klesajúcej rýchlosti, ale to je v amatérskom prostredí zložité.
Môžu sa použiť substituované benzaldehydy a získa sa príslušný analóg L-PAC.
Nakoniec si môžete požičať niektoré prvky metódy 2 a začleniť ich do metódy 1, aby ste si prispôsobili experimentálny dizajn podľa svojich predstáv. Uvedomte si, že je možné použiť aj iné kmene a druhy, čím sa výrazne zvýšia výťažky. Viac informácií nájdete v dokumente "Production of L-phenyl Acetyl Carbinol (L-PAC) by different novel strains of yeasts in melasses and sugar cane juice as production medium" od Raviho a kol.
