Genetické technológie, ktoré vtrhli do ľudského života koncom minulého storočia, zmenili náš svet do takej miery, že si ho už bez nich nevieme predstaviť. Týmto technológiám sa podarilo preniknúť aj do kriminalistiky; už desaťročia sa genetická identifikácia používa ako rýchla a relatívne lacná metóda, ktorá umožňuje nájsť zločincov a vyriešiť ich činy bez toho, aby opustili laboratórium. Ako vyštudovaný farmakológ sa o genetiku veľmi zaujímam a túžim študovať túto oblasť v jej rôznych aspektoch. V tejto publikácii vás oboznámim s klasickými genetickými prístupmi v oblasti kriminalistiky.
Trochu histórie alebo čo to má spoločné s rytiermi?
Pred 150 rokmi Johannes Friedrich Miescher objavil nukleové kyseliny, čo bol koncept, ktorý nakoniec obrátil svet naruby [1]. V polovici 20. storočia už bolo jasné, že DNA a RNA sú nositeľmi dedičnej informácie; potom bola opísaná ich štruktúra a o niečo neskôr sa objavili početné metódy, ktoré umožnili tieto molekuly "rezať" in vitro pomocou bunkových enzýmov - restriktáz [2]; amplifikovať ich pomocou PCR [3] a dokonca čítať sekvenciu konkrétnych génov a genómov pomocou viacerých metód sekvenovania [4].
Spočiatku sa práca s genetickým materiálom vykonávala doslova "v kuchyni" a nedala sa vždy reprodukovať ani v susednom vedeckom laboratóriu. Čas však plynul, prístupy sa menili a metódy sa štandardizovali do takej miery, že sa postupne zaviedli do aplikovaného výskumu a dokonca aj do biotechnologickej výroby.
V roku 1984 vedeckú komunitu rozvírila správa, že sa vedcom podarilo izolovať a prečítať fragment DNA zebry Burchellovej, ktorá vyhynula a zachovala sa len v múzejných zbierkach [5]. O rok neskôr švédsky genetik Svante Pääbo potvrdil možnosť využitia muzeálneho a archeologického materiálu na základný vedecký výskum, keď ako prvý analyzoval genetický materiál egyptských múmií. Po rokoch sa ukázalo, že ním analyzované vzorky boli kontaminované moderným genetickým materiálom [6], ale rozvoj sekvenačných metód aj tak umožnil pracovať aj s minimálnym množstvom zle zachovanej DNA.
O nové techniky analýzy genetického materiálu sa zaujímali aj kriminalisti. Faktom je, že metódy klasickej daktyloskopie a analýzy krvných skupín, ktoré boli v tom čase obvyklé, mali svoje obmedzenia a v niektorých prípadoch sa mýlili.
V roku 1984 britský vedec sir Alec John Jeffreys (obr. 3) vyvinul a predstavil metódu identifikácie osoby pomocou jej genetického materiálu. Neskôr sa tento prístup nazval identifikácia DNA a získal si lásku a rešpekt kriminalistov na celom svete. Jeffreys bol za svoju prácu povýšený do rytierskeho stavu.
Trochu histórie alebo čo to má spoločné s rytiermi?
Pred 150 rokmi Johannes Friedrich Miescher objavil nukleové kyseliny, čo bol koncept, ktorý nakoniec obrátil svet naruby [1]. V polovici 20. storočia už bolo jasné, že DNA a RNA sú nositeľmi dedičnej informácie; potom bola opísaná ich štruktúra a o niečo neskôr sa objavili početné metódy, ktoré umožnili tieto molekuly "rezať" in vitro pomocou bunkových enzýmov - restriktáz [2]; amplifikovať ich pomocou PCR [3] a dokonca čítať sekvenciu konkrétnych génov a genómov pomocou viacerých metód sekvenovania [4].
Spočiatku sa práca s genetickým materiálom vykonávala doslova "v kuchyni" a nedala sa vždy reprodukovať ani v susednom vedeckom laboratóriu. Čas však plynul, prístupy sa menili a metódy sa štandardizovali do takej miery, že sa postupne zaviedli do aplikovaného výskumu a dokonca aj do biotechnologickej výroby.
V roku 1984 vedeckú komunitu rozvírila správa, že sa vedcom podarilo izolovať a prečítať fragment DNA zebry Burchellovej, ktorá vyhynula a zachovala sa len v múzejných zbierkach [5]. O rok neskôr švédsky genetik Svante Pääbo potvrdil možnosť využitia muzeálneho a archeologického materiálu na základný vedecký výskum, keď ako prvý analyzoval genetický materiál egyptských múmií. Po rokoch sa ukázalo, že ním analyzované vzorky boli kontaminované moderným genetickým materiálom [6], ale rozvoj sekvenačných metód aj tak umožnil pracovať aj s minimálnym množstvom zle zachovanej DNA.
O nové techniky analýzy genetického materiálu sa zaujímali aj kriminalisti. Faktom je, že metódy klasickej daktyloskopie a analýzy krvných skupín, ktoré boli v tom čase obvyklé, mali svoje obmedzenia a v niektorých prípadoch sa mýlili.
V roku 1984 britský vedec sir Alec John Jeffreys (obr. 3) vyvinul a predstavil metódu identifikácie osoby pomocou jej genetického materiálu. Neskôr sa tento prístup nazval identifikácia DNA a získal si lásku a rešpekt kriminalistov na celom svete. Jeffreys bol za svoju prácu povýšený do rytierskeho stavu.
Daktyloskopia DNA: výhody a nevýhody
Genetická analýza biologických vzoriek získaných na miestach činu výrazne zjednodušila prácu vyšetrovateľov. Tí majú teraz k dispozícii spoľahlivý nástroj na identifikáciu páchateľa alebo obete, získanie nespochybniteľných dôkazov a objasnenie trestných činov.
Hlavnými výhodami genetickej daktyloskopie sú schopnosť pracovať aj s malým množstvom biologického materiálu a vysoká presnosť, ktorá umožňuje identifikáciu jednotlivca - ak sú splnené všetky požiadavky na analýzu, jej spoľahlivosť presahuje 99 %. Tento prístup sa stal jedným z najdôležitejších pri vyšetrovaní trestných činov [7].
Je dôležité poznamenať, že klasické metódy daktyloskopie DNA neumožňujú identifikovať jednovaječné dvojčatá, ktorých genetický profil je rovnaký, pretože vznikli z toho istého oplodneného vajíčka.
Na analýzu DNA je potrebný predovšetkým samotný DnA, ale zďaleka nie vždy je možné získať kvalitný genetický materiál z biologických vzoriek, ktoré boli vystavené chemickým a tepelným faktorom. Po vstupe do prostredia táto molekula vstupuje do chemických reakcií, ničí sa (fragmentuje) a modifikuje, hoci v priaznivých podmienkach môže pretrvať tisíce rokov [8].
Je známe, že najstarší genetický materiál ľudských predkov bol získaný z kostných pozostatkov našich humanoidných príbuzných, ktorí žili na území Pyrenejského polostrova (Sierra de Atapuerca) približne pred 430 tisíc rokmi [9]. Špecifická mikroklíma niektorých jaskýň s nízkymi hodnotami vlhkosti a teploty výrazne zvyšuje životnosť genetického materiálu. DNA vo vzorkách nájdených na mieste činu je však často zastúpená v minimálnom množstve a podobne ako v archeologických vzorkách je značne znehodnotená.
V Európe a Spojených štátoch sa upozorňuje na ďalšiu nevýhodu genetického daktyloskopovania, ktorá súvisí so zásahom do súkromia osoby a porušením ochrany osobných údajov.
Aktivisti za ľudské práva sa obávajú, že genetické informácie zločincov a osôb podozrivých z trestnej činnosti by sa mohli dostať do rúk tretích osôb a následne by mohli byť zneužité [10]. Známe sú už napríklad prípady využívania genetických informácií na kontrolu moslimských menšín v čínskej provincii Sin-ťiang.
USA tiež plánujú systematicky zhromažďovať profily DNA imigrantov vo federálnej väzbe [11]. Je zrejmé, že obavy aktivistov za ľudské práva nie sú neopodstatnené a majú reálny základ.
Hlavnými výhodami genetickej daktyloskopie sú schopnosť pracovať aj s malým množstvom biologického materiálu a vysoká presnosť, ktorá umožňuje identifikáciu jednotlivca - ak sú splnené všetky požiadavky na analýzu, jej spoľahlivosť presahuje 99 %. Tento prístup sa stal jedným z najdôležitejších pri vyšetrovaní trestných činov [7].
Je dôležité poznamenať, že klasické metódy daktyloskopie DNA neumožňujú identifikovať jednovaječné dvojčatá, ktorých genetický profil je rovnaký, pretože vznikli z toho istého oplodneného vajíčka.
Na analýzu DNA je potrebný predovšetkým samotný DnA, ale zďaleka nie vždy je možné získať kvalitný genetický materiál z biologických vzoriek, ktoré boli vystavené chemickým a tepelným faktorom. Po vstupe do prostredia táto molekula vstupuje do chemických reakcií, ničí sa (fragmentuje) a modifikuje, hoci v priaznivých podmienkach môže pretrvať tisíce rokov [8].
Je známe, že najstarší genetický materiál ľudských predkov bol získaný z kostných pozostatkov našich humanoidných príbuzných, ktorí žili na území Pyrenejského polostrova (Sierra de Atapuerca) približne pred 430 tisíc rokmi [9]. Špecifická mikroklíma niektorých jaskýň s nízkymi hodnotami vlhkosti a teploty výrazne zvyšuje životnosť genetického materiálu. DNA vo vzorkách nájdených na mieste činu je však často zastúpená v minimálnom množstve a podobne ako v archeologických vzorkách je značne znehodnotená.
V Európe a Spojených štátoch sa upozorňuje na ďalšiu nevýhodu genetického daktyloskopovania, ktorá súvisí so zásahom do súkromia osoby a porušením ochrany osobných údajov.
Aktivisti za ľudské práva sa obávajú, že genetické informácie zločincov a osôb podozrivých z trestnej činnosti by sa mohli dostať do rúk tretích osôb a následne by mohli byť zneužité [10]. Známe sú už napríklad prípady využívania genetických informácií na kontrolu moslimských menšín v čínskej provincii Sin-ťiang.
USA tiež plánujú systematicky zhromažďovať profily DNA imigrantov vo federálnej väzbe [11]. Je zrejmé, že obavy aktivistov za ľudské práva nie sú neopodstatnené a majú reálny základ.
Ako to funguje
Metódy daktyloskopie DNA sú založené na ľudskej genetickej variabilite. Nukleotidové zámeny v DNA (v závislosti od frekvencie v populácii sa nazývajú aj polymorfizmy DNA alebo mutácie) nás individuálne odlišujú. A tieto rozdiely možno nájsť v jadrovom aj mitochondriálnom genóme, malých kruhových molekulách DNA, ktoré regulujú fungovanie mitochondrií, energetických "tovární" buniek.
Treba poznamenať, že polymorfizmy DNA sa nachádzajú v genóme každého z nás - stávajú sa naším jedinečným čiarovým kódom DNA. Niektoré z nich môžu spôsobovať vážne ochorenia [12], ale vo väčšine prípadov nemajú žiadny vplyv na naše životné funkcie.
Moderné metódy DNA daktyloskopie využívajú rôzne genetické varianty v rôznych oblastiach genómu. Napríklad analýza tandemových opakovaní - krátkych opakujúcich sa sekvencií genómu, ktorých počet sa líši u dvoch náhodne vybraných jedincov [13]- umožňuje jednoznačný test otcovstva alebo nájdenie ďalších dôkazov proti podozrivému z trestného činu.
Na určenie pohlavia osoby sa môžu použiť Y-chromozomálne markery DNA. Genetické markery poskytujú informácie o etnickom pôvode príbuzných jednotlivca, farbe očí alebo farbe vlasov.
Okrem toho epigenetické informácie (napr. metylácia DNA) umožňujú odhadnúť biologický vek jednotlivých buniek, tkanív a organizmu ako celku [14]. V tomto článku sa budem bližšie venovať uvedeným metódam genetickej analýzy. A využitie epigenetických metód v obchode s liekmi bude predmetom mojej ďalšej publikácie.
Na určenie pohlavia osoby sa môžu použiť Y-chromozomálne markery DNA. Genetické markery poskytujú informácie o etnickom pôvode príbuzných jednotlivca, farbe očí alebo farbe vlasov.
Okrem toho epigenetické informácie (napr. metylácia DNA) umožňujú odhadnúť biologický vek jednotlivých buniek, tkanív a organizmu ako celku [14]. V tomto článku sa budem bližšie venovať uvedeným metódam genetickej analýzy. A využitie epigenetických metód v obchode s liekmi bude predmetom mojej ďalšej publikácie.
Odber a izolácia DNA z biologického materiálu
Získavanie a analýza DNA z forenzných vzoriek je na prvý pohľad porovnateľná s umením. Niekedy si ani nevieme predstaviť, že niekoľko kvapiek krvi alebo kúsok kože pod nechtami obete sa môže stať najdôležitejším dôkazom pri vyšetrovaní trestného činu.
V skutočnosti sú činnosti kriminalistických špecialistov na mieste činu vyladené a riadia sa jediným scenárom, ktorého jedným z hlavných cieľov je nájsť biologický materiál vhodný na extrakciu DNA. Na tento účel možno použiť akékoľvek biologické tkanivo a ľudské výlučkové látky .
- Kostné pozostatky
- Zuby
- vlasové folikuly
- Krv
- Epitelové bunky
- Pot
- Sliny
- Vzorky spermií
- exkrementy atď.
Biomateriál v sklade dôkazov môže vydržať desiatky rokov. Vyšetrovateľ často odoberie na skúmanie len časť materiálu, toľko, koľko potrebuje na extrakciu DNA. Ak sú napríklad na noži stopy krvi, znalec nezmyje všetku krv, ale urobí malý oplach tesne pred extrakciou DNA. Na noži tak zostanú stopy, ktoré sa dajú použiť na opätovné skúmanie po niekoľkých desaťročiach.
V bunkovom jadre je DNA v úzkom kontakte s mnohými organickými molekulami potrebnými na jej efektívne fungovanie. Pri genetickej analýze je však potrebné zo skúmanej vzorky odstrániť sacharidy, lipidy a proteíny, čo môže znížiť účinnosť použitých metód a následne ovplyvniť rozpustnosť zločinov.Extrakcia DNA netrvá dlho vďaka rôznym komerčným súpravám a systémom špeciálne navrhnutým na extrakciu nukleových kyselín (napr. AutoMate Express DNA Extraction System od spoločnosti Thermo Fisher Scientific). Okrem toho vo veľkých forenzných centrách s tisíckami analýz denne je tento proces plne automatizovaný a vykonáva sa za účasti robotov pod dohľadom operátora.
Mimochodom, robotické systémy sa široko využívajú nielen vo forenzných laboratóriách, ale aj v mnohých lekárskych a biotechnologických centrách, čo umožňuje urýchliť proces, znížiť náklady na prácu a výrazne znížiť možnosť chyby.
Po extrakcii sa DNA rozpustí v špeciálnej zmesi, kde sa v prípade potreby môže skladovať roky (pri -20 °C alebo -80 °C).
Genetická analýza
Bezprostredne po extrakcii DnA stojí odborník pred otázkou ďalších spôsobov jej analýzy. Od zavedenia identifikácie DNA v kriminalistike sa techniky molekulárnej biológie natoľko zmenili, že existuje niekoľko možných variantov. V našom ďalšom príbehu poukážeme na rôzne techniky analýzy DNA, ktoré kriminalistickí experti používajú vo svojej praxi.
Polymorfizmus dĺžky reštrikčných fragmentov (analýza RFLP)
Analýza RFLP je historicky jednou z prvých metód identifikácie DNA. Je založená na použití špeciálnych bunkových enzýmov, reštrikcií. Reštrikčné enzýmy dokážu rozpoznať určité miesta na molekule nukleovej kyseliny a cez tieto miesta ju prerezať. Doteraz bolo opísaných niekoľko tisíc takýchto enzýmov. Po rozrezaní molekuly DnA pomocou restrikčných enzýmov sa dĺžka získaných fragmentov vyhodnocuje pomocou gélovej elektroforézy (obrázok 9).
Bezprostredne po extrakcii DnA stojí odborník pred otázkou ďalších spôsobov jej analýzy. Od zavedenia identifikácie DNA v kriminalistike sa techniky molekulárnej biológie natoľko zmenili, že existuje niekoľko možných variantov. V našom ďalšom príbehu poukážeme na rôzne techniky analýzy DNA, ktoré kriminalistickí experti používajú vo svojej praxi.
Polymorfizmus dĺžky reštrikčných fragmentov (analýza RFLP)
Analýza RFLP je historicky jednou z prvých metód identifikácie DNA. Je založená na použití špeciálnych bunkových enzýmov, reštrikcií. Reštrikčné enzýmy dokážu rozpoznať určité miesta na molekule nukleovej kyseliny a cez tieto miesta ju prerezať. Doteraz bolo opísaných niekoľko tisíc takýchto enzýmov. Po rozrezaní molekuly DnA pomocou restrikčných enzýmov sa dĺžka získaných fragmentov vyhodnocuje pomocou gélovej elektroforézy (obrázok 9).
Keďže neexistujú úplne identické ľudské genómy (s výnimkou identických dvojčiat), rozdiel alebo podobnosť vo výsledných profiloch dĺžok fragmentov DNA môže byť dobrým markerom na identifikáciu osoby aj určenie príbuzenstva.
Táto metóda však zahŕňa fragmentáciu DNA, a preto je citlivá na kvalitu a množstvo pôvodného genetického materiálu. Preto sa analýza RFLP v súčasnosti prakticky nepoužíva - na rozdiel od iných metód, o ktorých bude reč ďalej.
Analýza počtu tandemových opakovaní v genóme
Tandemové opakovania sú kópie tej istej krátkej sekvencie DnA opakujúce sa jedna za druhou [15]. Medzi opakovania, ktoré sú zaujímavé pre forenzných vedcov, patria lokusy s rôznym počtom tandemových opakovaní (VNTR) a krátke tandemové opakovania (STR). Nazývajú sa aj minisatelity, resp. mikrosatelity.
. Podstatou tejto metódy je PCR amplifikácia fragmentov DNA obsahujúcich tieto krátke repetitívne sekvencie, ktorých dĺžka sa líši u dvoch náhodne odobratých jedincov. Po amplifikácii sa dĺžka získaných fragmentov vyhodnocuje pomocou gélovej elektroforézy alebo kapilárnej elektroforézy.
Na tento účel možno použiť súpravu Quantifiler DNA Quantification Kit a systém QuantStudio od spoločnosti Termo Fisher Scientific. QuantStudio je kompaktný stolový prístroj so širokou škálou funkcií.
Rovnako ako pri predchádzajúcej metóde je hlavným identifikačným faktorom STR testu dĺžka získaných fragmentov, ktorá je pre každého jedinca jedinečná a závisí od počtu opakovaní v analyzovanom mieste. STR-analýza sa vyznačuje vysokou presnosťou a rýchlosťou, ako aj nízkymi nákladmi. Dôležitou podmienkou analýzy je kvalita genetického materiálu.
Táto metóda však zahŕňa fragmentáciu DNA, a preto je citlivá na kvalitu a množstvo pôvodného genetického materiálu. Preto sa analýza RFLP v súčasnosti prakticky nepoužíva - na rozdiel od iných metód, o ktorých bude reč ďalej.
Analýza počtu tandemových opakovaní v genóme
Tandemové opakovania sú kópie tej istej krátkej sekvencie DnA opakujúce sa jedna za druhou [15]. Medzi opakovania, ktoré sú zaujímavé pre forenzných vedcov, patria lokusy s rôznym počtom tandemových opakovaní (VNTR) a krátke tandemové opakovania (STR). Nazývajú sa aj minisatelity, resp. mikrosatelity.
. Podstatou tejto metódy je PCR amplifikácia fragmentov DNA obsahujúcich tieto krátke repetitívne sekvencie, ktorých dĺžka sa líši u dvoch náhodne odobratých jedincov. Po amplifikácii sa dĺžka získaných fragmentov vyhodnocuje pomocou gélovej elektroforézy alebo kapilárnej elektroforézy.
Na tento účel možno použiť súpravu Quantifiler DNA Quantification Kit a systém QuantStudio od spoločnosti Termo Fisher Scientific. QuantStudio je kompaktný stolový prístroj so širokou škálou funkcií.
Rovnako ako pri predchádzajúcej metóde je hlavným identifikačným faktorom STR testu dĺžka získaných fragmentov, ktorá je pre každého jedinca jedinečná a závisí od počtu opakovaní v analyzovanom mieste. STR-analýza sa vyznačuje vysokou presnosťou a rýchlosťou, ako aj nízkymi nákladmi. Dôležitou podmienkou analýzy je kvalita genetického materiálu.
STR analýza sa v praktickej kriminalistike objavila takmer pred dvadsiatimi rokmi, ale dodnes zostáva hlavnou metódou identifikácie osôb. Výsledky analýzy DNA podozrivých osôb a zločincov - genetické profily - vkladajú kriminalisti do špeciálnych databáz.
Preto keď sa na mieste činu nájdu biologické stopy, z ktorých možno izolovať DNA, je možné identifikovať všetky osoby, ktoré sa už dostali do pozornosti orgánov činných v trestnom konaní. Rovnaké markery sa používajú pri pátraní po nezvestných osobách a pri určovaní otcovstva.
Preto keď sa na mieste činu nájdu biologické stopy, z ktorých možno izolovať DNA, je možné identifikovať všetky osoby, ktoré sa už dostali do pozornosti orgánov činných v trestnom konaní. Rovnaké markery sa používajú pri pátraní po nezvestných osobách a pri určovaní otcovstva.
Systémy určené na identifikáciu jedincov spravidla umožňujú analýzu viacerých genómových lokusov (10-24) naraz, vrátane génu pre proteín amelogenín, podľa ktorého sa určuje pohlavie. Gén amelogenin sa nachádza na chromozóme X aj Y, ale líši sa veľkosťou, čo umožňuje určiť pohlavie osoby.
Vďaka použitiu vysoko výkonných technológií sekvenovania získala kriminalistika účinný nástroj, ktorý otvoril nové možnosti súčasnej analýzy viacerých miest (lokusov) jadrového a mitochondriálneho genómu.
Dôležitou výhodou týchto metód je možnosť rozlíšiť dokonca aj identické dvojčatá (podľa somatických mutácií), čo je pri analýze RFLP alebo STR nemožné.
Vďaka použitiu vysoko výkonných technológií sekvenovania získala kriminalistika účinný nástroj, ktorý otvoril nové možnosti súčasnej analýzy viacerých miest (lokusov) jadrového a mitochondriálneho genómu.
Dôležitou výhodou týchto metód je možnosť rozlíšiť dokonca aj identické dvojčatá (podľa somatických mutácií), čo je pri analýze RFLP alebo STR nemožné.
V druhej časti tejto publikácie bude opísané, ako sa uvedené metódy dajú použiť na identifikáciu drogových laboratórií a drogových dílerov a ako môžete zamiesť kriminalistom hlavu zametaním stôp.
Prečítajte si ČASŤ II
