Mefedrón (4-metylmetkatinón) je β-ketoamfetamínová stimulačná droga zneužívania s blízkymi štrukturálnymi a mechanickými podobnosťami s metamfetamínom. Jedným z najsilnejších účinkov spojených s mefedronom je schopnosť stimulovať uvoľňovanie dopamínu (DA) a blokovať jeho spätné vychytávanie prostredníctvom interakcie s dopamínovým transportérom (DAT). Hoci mefedrón nespôsobuje toxicitu DA nervových zakončení, jeho schopnosť slúžiť ako blokátor DAT by mohla poskytnúť ochranu pred neurotoxicitou vyvolanou metamfetamínom podobne ako iné inhibítory DAT. Na otestovanie tejto možnosti boli myši liečené mefedronom (10, 20 alebo 40 mg/kg) pred každou injekciou neurotoxického režimu metamfetamínu (4 injekcie 2,5 alebo 5,0 mg/kg v dvojhodinových intervaloch). Integrita DA nervových zakončení striata sa hodnotila prostredníctvom meraní hladín DA, DAT a tyrozín hydroxylázy. Stredne silnej až silnej DA toxicite spojenej s rôznymi dávkami metamfetamínu nezabránila žiadna dávka mefedrónu, ale v skutočnosti sa výrazne zvýšila. Hypertermia spôsobená kombinovanou liečbou mefedrónom a metamfetamínom bola rovnaká ako tá, ktorá sa pozorovala po podaní ktoréhokoľvek z týchto liečiv samostatne. Mefedrón tiež zosilnil neurotoxické účinky amfetamínu a MDMA na nervové zakončenia DA. Naopak, nomifenzín chránil pred neurotoxicitou vyvolanou metamfetamínom. Keďže mefedrón zvyšuje neurotoxicitu metamfetamínu, súčasné výsledky naznačujú, že interaguje s DAT spôsobom odlišným od iných typických inhibítorov DAT. Relatívne neškodné účinky samotného mefedrónu na nervové zakončenia DA maskujú potenciálne nebezpečnú interakciu s drogami, ktoré sa s ním často užívajú spoločne, čo vedie k zvýšenej neurotoxicite.
Mefedrón (4-metylmetkatinón) je derivát katinónu a štrukturálny analóg metamfetamínu a 3,4-metyléndioxy-metamfetamínu (MDMA). Mefedrón je jednou z psychoaktívnych zložiek "kúpeľových solí" spolu s ďalšími zlúčeninami, ako sú metylón, butylón a 3,4-metyléndioxypyrovalerón (MDPV). β-ketoamfetamíny sa zneužívajú čoraz častejšie, čo je v nemalej miere spôsobené veľmi obmedzenou dostupnosťou prekurzorov potrebných na syntézu metamfetamínu a MDMA v tajných laboratóriách a zodpovedajúcim znížením ich čistoty (Winstock a kol. 2011b, Brunt a kol. 2011). Keďže zneužívanie β-ketoamfetamínov stále rastie, zoznam ich nežiaducich účinkov sa rozšíril o kardiovaskulárne komplikácie, agitovanosť, nespavosť, psychózy a depresie (Schifano a kol. 2011, Prosser a Nelson 2012).
Ako chemické príbuzné metamfetamínu a MDMA nie je prekvapujúce, že β-ketoamfetamíny majú na centrálny nervový systém mnohé rovnaké účinky ako tieto predchádzajúce drogy. Tieto drogy napríklad blokujú dopamínové (DA) a serotonínové (5-HT) transportéry (DAT, resp. SERT) (Cozzi et al. 1999, Rothman et al. 2003, Fleckenstein et al. 2000, Lopez-Arnau et al. 2012) a stimulujú uvoľňovanie monoamínov in vitro (Kalix a Glennon 1986, Gygi et al. 1997, Rothman et al. 2003) a in vivo (Gygi et al. 1997, Kehr et al. 2011). Metkatinón spôsobuje trvalé zníženie aktivity tryptofán hydroxylázy a tyrozín hydroxylázy (TH) a vyčerpanie DA a 5-HT (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). PET zobrazovacie štúdie u abstinujúcich užívateľov metkatinónu odhalili zníženú striatálnu hustotu DAT, čo naznačuje stratu DA terminálov (McCann et al. 1998). Súčasná stimulácia uvoľňovania DA a inhibícia jeho vychytávania odráža kritické prvky, ktoré sú základom neurotoxicity spojenej s metamfetamínom (Kuhn a kol. 2008, Yamamoto a Bankson 2005, Cadet a kol. 2007, Fleckenstein a kol. 2007).
My (Angoa-Perez et al. 2012) a ďalší (Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011) sme nedávno skúmali možnosť, že by mefedrón mohol spôsobovať neurotoxicitu ako metamfetamín a MDMA. Prekvapivo mefedrón nebol toxický pre DA nervové zakončenia striata (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Otázka, či mefedrón poškodzuje nervové zakončenia 5-HT, zostáva nedoriešená, keďže jedna štúdia dokumentovala pozitívne účinky (Hadlock et al. 2011), zatiaľ čo iná bola negatívna (Baumann et al. 2012). Vzhľadom na relatívne priaznivý účinok mefedrónu na nervové zakončenia DA a vzhľadom na jeho vlastnosti ako blokátora DAT sme predpokladali, že by mohol skutočne chrániť DA neurónový systém pred neurotoxickými účinkami metamfetamínu podobne, ako je to známe pri iných blokátoroch DAT, ako je kyselina amfonelová (Pu et al. 1994, Schmidt a Gibb 1985, Marek et al. 1990) a nomifenzín (Poth et al. 2012). V súčasnosti uvádzame, že mefedrón významne zvyšuje neurotoxicitu metamfetamínu. Tento účinok sa rozširuje aj na amfetamín a MDMA, drogy, ktoré sa často užívajú spolu s mefedrónom (Feyissa a Kelly 2008, Schifano a kol. 2011). Tieto prekvapivé výsledky stavajú zneužívanie mefedrónu do nového svetla a zvyšujú naliehavosť rozpoznania tejto jemnej a nebezpečnej vlastnosti tohto β-ketoamfetamínu.
Materiály a metódy
Drogy a činidlá
Mefedrón hydrochlorid a 3,4-metyléndioxymetamfetamín (MDMA) boli získané z programu NIDA Research Resources Drug Supply Program. (+) Metamfetamín hydrochlorid, nomifenzín maleát, d-amfetamín sulfát, pentobarbital, DA a všetky pufre a HPLC činidlá boli zakúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Súpravy na stanovenie bielkovín kyseliny bicinchonínovej boli získané od spoločnosti Pierce (Rockford, IL, USA). Polyklonálne protilátky proti potkaniu TH boli vyrobené podľa predchádzajúceho opisu (Kuhn a Billingsley 1987). Monoklonálne protilátky proti DAT potkanov veľkoryso poskytla Dr. Roxanne A. Vaughan (University of North Dakota, Grand Forks, ND, USA). Sekundárne protilátky proti IgG konjugované s HRP poskytla spoločnosť Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc (West Grove, PA, USA).
Zvieratá
Samice myší C57BL/6 (Harlan, Indianapolis, IN, USA) s hmotnosťou 20 - 25 g v čase experimentu boli umiestnené po 5 v klietke vo veľkých klietkach s obuvou v miestnosti s kontrolovaným svetlom (12 h svetlo/tma) a teplotou. Použili sa samice myší, pretože je známe, že sú veľmi citlivé na poškodenie neurónov neurotoxickými amfetamínmi, a aby sa zachovala konzistentnosť s našimi predchádzajúcimi štúdiami neurotoxicity metamfetamínu (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Myši mali voľný prístup k potrave a vode. Inštitucionálny výbor pre starostlivosť a používanie na Wayne State University schválil starostlivosť o zvieratá a experimentálne postupy. Všetky postupy boli tiež v súlade s Príručkou NIH pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat.
Farmakologické, fyziologické a behaviorálne postupy
Myši boli liečené mefedrónom pomocou režimu podobného fetovaniu, ktorý pozostával zo 4 injekcií 10, 20 alebo 40 mg/kg s dvojhodinovým intervalom medzi jednotlivými injekciami. Tento režim liečby binge, keď sa používa na injekčné podávanie substituovaných amfetamínov a derivátov katinónu, vedie k rozsiahlemu poškodeniu zakončenia DA nervu. Dávky mefedrónu používané v súčasnosti sa predtým ukázali ako netoxické pre DA nervové zakončenia (Angoa-Perez a kol. 2012). Myši boli liečené metamfetamínom (4X 2,5 alebo 5 mg/kg), amfetamínom (4X 5 mg/kg) alebo MDMA (4X 20 mg/kg) samostatne alebo v kombinácii s mefedrónom. Pri liečbe dvoma drogami dostali myši injekciu mefedrónu 30 minút pred každou zo 4 injekcií metamfetamínu, amfetamínu alebo MDMA. Kontroly dostali injekcie fyziologického roztoku podľa rovnakého rozpisu, aký sa použil pre mefedrón samotný alebo v kombinácii s inými amfetamínmi. Ako kontrola účinkov inhibítora DAT na toxicitu metamfetamínu sa myšiam 30 minút pred každou injekciou metamfetamínu (4X 5 mg/kg) podával nomifenzín (4X 5 mg/kg). Všetky injekcie sa podávali i.p. cestou. Myši boli usmrtené 2 dni po poslednej liečbe liekom, keď neurotoxicita spojená s amfetamínom dosiahla maximum. Telesná teplota sa monitorovala telemetricky pomocou implantovateľných teplotných transpondérov IPTT-300 od spoločnosti Bio Medic Data Systems, Inc (Seaford, DE, USA). Teplota sa zaznamenávala neinvazívne každých 20 minút počnúc 60 minút pred prvou injekciou METH a pokračujúc potom počas 9 hodín pomocou konzolového systému DAS-5001 od spoločnosti Bio Medic.
Stanovenie obsahu striatálneho DA
Striatálne tkanivo bolo po liečbe obojstranne vypreparované z mozgu a uložené pri -80 °C. Zmrazené tkanivá sa odvážili a sonikovali v 10 objemoch 0,16 N kyseliny chloristej pri 4 °C. Nerozpustné bielkoviny sa odstránili centrifugáciou a DA sa stanovil pomocou HPLC s elektrochemickou detekciou, ako už bolo opísané pre metamfetamín (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
Stanovenie hladín proteínov TH a DAT pomocou imunoblotu
Účinky liečby liekmi na striatálne hladiny TH a DAT sa stanovili imunoblotovaním ako index toxicity striatálnych DA nervových zakončení. Myši boli po liečbe usmrtené dekapitáciou a striatum bolo obojstranne vypreparované. Tkanivo sa skladovalo pri teplote -80 °C. Zmrazené tkanivo sa rozrušilo sonikáciou v 1 % SDS pri 95 °C a nerozpustný materiál sa odstredil. Proteín sa stanovil metódou kyseliny bicinchonínovej a rovnaké množstvá proteínu (70 μg/l) sa rozlíšili elektroforézou v SDS-polyakrylamidovom géle a potom sa elektroblotovali na nitrocelulózu. Bloty boli blokované v Trisovom pufrovanom fyziologickom roztoku obsahujúcom Tween 20 (0,1 % v/v) a 5 % odtučnené suché mlieko počas 1 hodiny pri izbovej teplote. Primárne protilátky proti TH (1:1000) alebo DAT (1:1000) sa pridali na bloty a nechali sa inkubovať 16 h pri 4 °C. Bloty sa 3x premyli v Tris-buffered saline na odstránenie nezreagovaných protilátok a potom sa inkubovali s HRP-konjugovanou sekundárnou protilátkou anti-IgG (1:4000) počas 1 h pri izbovej teplote. Imunoreaktívne pásy sa vizualizovali pomocou zvýšenej chemiluminiscencie a relatívna hustota pásov reagujúcich na TH a DAT sa stanovila zobrazením pomocou Kodak Image Station (Carestream Molecular Systems, Rochester, NY, USA) a kvantifikovala pomocou softvéru ImageJ (NIH).
Analýza údajov
Na analýzu účinkov dávky metamfetamínu oproti mefedronu na DA, DAT a TH sa vykonali dvojcestné ANOVA. Účinky liečby liekmi na striatálny obsah DA, TH a DAT sa testovali na významnosť pomocou jednosmernej ANOVA, po ktorej nasledoval Tukeyho test viacnásobného porovnania. Výsledky liečby liekmi na teplotu telesného jadra v čase sa analyzovali pomocou dvojcestnej ANOVA, po ktorej nasledoval Bonferroniho test na určenie významnosti rozdielov v teplote v jednotlivých časoch po liečbe. Rozdiely sa považovali za významné, ak p < 0,05. Všetky štatistické analýzy sa vykonali pomocou programu GraphPad Prism verzia 5.02 pre Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com).
Prejsť na: 1:
Výsledky
Účinky mefedrónu na neurotoxicitu vyvolanú metamfetamínom
Mefedrón v dávkach (10, 20 alebo 40 mg/kg), o ktorých je známe, že nespôsobujú toxicitu DA nervových zakončení (Angoa-Perez et al. 2012), sa podával 30 min pred každou injekciou metamfetamínu. Metamfetamín sa podával v dávkach, ktoré spôsobujú stredne závažné (4x 2,5 mg/kg) alebo závažné (4x 5 mg/kg) poškodenie DA nervových zakončení striata (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). Výsledky uvedené na obr. 1 ukazujú, že hlavné účinky dávky metamfetamínu (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) a dávky mefedrónu (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) na hladiny DA v striate boli vysoko signifikantné podľa dvojcestnej ANOVA. Hlavný účinok mefedrónu podávaného v kombinácii s 2,5 mg/kg (F4,22 = 35,96, p < 0,001) alebo 5,0 mg/kg metamfetamínu (F4,17 = 953,9, p < 0,0001) bol tiež vysoko významný pomocou jednocestnej ANOVA. Všetky ošetrenia s ktoroukoľvek dávkou metamfetamínu ± mefedrónu spôsobili významne väčšie zníženie DA v porovnaní s príslušnou kontrolou (p < 0,0001 pre všetky). Z obr. 1 tiež vyplýva, že dávky mefedrónu 20 (p < 0,01) a 40 mg/kg (p < 0,001) významne zvýšili vyčerpávajúce účinky metamfetamínu 2,5 mg/kg na DA, zatiaľ čo všetky dávky mefedrónu významne zvýšili účinky metamfetamínu 5,0 mg/kg na hladiny DA (p < 0,0001 pre všetky).
Obr.1
Účinky mefedrónu na metamfetamínom indukované zníženie striatálneho DA. Myši boli liečené uvedenými dávkami mefedrónu (MEPH) 30 minút pred každou injekciou 2,5 (-) alebo 5,0 mg/kg (■) metamfetamínu (METH) a o 2 dni neskôr usmrtené na stanovenie striatálnych hladín DA pomocou HPLC. Údaje sú priemerné ± SEM pre 5 - 7 myší v každej skupine. Niektoré chybové čiary boli príliš malé na to, aby presiahli veľkosť symbolov, a nie sú viditeľné. ***p < 0,001 oproti kontrolám a #p < 0,01, ##p < 0,001 alebo ###p < 0,0001 oproti príslušnej dávke metamfetamínu (Tukeyho test viacnásobného porovnania).
Obr. 2a ukazuje, že mefedrón významne zvýšil metamfetamínom indukované zníženie hladín DAT, ako sa stanovilo imunoblotovaním. Imunobloty boli kvantifikované a v zhode s výsledkami pre DA boli hlavné účinky dávky metamfetamínu (F1,92 = 9,48, p < 0,001) a dávky mefedrónu (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) na hladiny DAT v striate vysoko významné pomocou dvojcestnej ANOVA (obr. 2b). Hlavný účinok mefedrónu podávaného v kombinácii s 2,5 mg/kg (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) alebo 5,0 mg/kg metamfetamínu (F4,39 = 24,84, p < 0,0001) bol tiež vysoko signifikantný pomocou jednocestnej ANOVA. Všetky ošetrenia s ktoroukoľvek dávkou metamfetamínu ± mefedrónu spôsobili významne väčšie zníženie DAT v porovnaní s príslušnou kontrolou (p < 0,01 pre samotný metamfetamín 2,5 mg/kg; p < 0,0001 pre všetky ostatné ošetrenia). Obr. 2b tiež ukazuje, že dávky mefedrónu 20 mg/kg (p < 0,01) a 40 mg/kg (p < 0,001) významne zvýšili zníženie DAT spôsobené 2,5 mg/kg metamfetamínu, zatiaľ čo iba dávka 40 mg/kg mefedrónu významne zvýšila (p < 0,01) účinky 5,0 mg/kg metamfetamínu na zníženie DAT.
Obr. 2
Účinky mefedrónu na metamfetamínom indukované zníženie striatálneho DAT. Myši boli liečené uvedenými dávkami mefedrónu (MEPH) 30 minút pred každou injekciou 2,5 (●) alebo 5,0 mg/kg (■) metamfetamínu (METH) a o 2 dni neskôr usmrtené na stanovenie striatálnych hladín DAT pomocou imunoblotu (a). Bloty boli kvantifikované pomocou ImageJ a údaje sú priemer ± SEM pre 10 - 12 myší v každej skupine (b). *p < 0,01 alebo ***p < 0,0001 oproti kontrole (C) a #p < 0,01 alebo ##p < 0,001 oproti príslušnej dávke metamfetamínu (Tukeyho test viacnásobného porovnania).
Obr. 3a ukazuje, že mefedrón významne zvýšil metamfetamínom indukované zníženie hladín TH, ako sa stanovilo imunoblotovaním. Imunobloty boli kvantifikované a v zhode s výsledkami uvedenými vyššie pre DA a DAT boli hlavné účinky dávky metamfetamínu (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) a dávky mefedrónu (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) vysoko významné pomocou dvojcestnej ANOVA (obr. 3b). Hlavný účinok mefedrónu podávaného v kombinácii s 2,5 mg/kg (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) alebo 5,0 mg/kg metamfetamínu (F4,49 = 99,16, p < 0,0001) bol vysoko signifikantný aj pri jednocestnej ANOVA. Všetky ošetrenia s ktoroukoľvek dávkou metamfetamínu ± mefedrónu spôsobili významne väčšie zníženie TH v porovnaní s príslušnou kontrolou (p < 0,001 pre 2,5 mg/kg metamfetamínu + 10 mg/kg mefedrónu; p < 0,0001 pre všetky ostatné kombinácie) s výnimkou samotného 2,5 mg/kg metamfetamínu, ktorý významne nezmenil hladiny TH (t. j. žiadna toxicita). Obr. 3b tiež ukazuje, že dávky mefedrónu 20 mg/kg (p < 0,01) a 40 mg/kg (p < 0,001) významne zvýšili zníženie TH spôsobené metamfetamínom 2,5 mg/kg a všetky tri dávky mefedrónu významne (p < 0,0001) zvýšili účinky metamfetamínu 5,0 mg/kg na zníženie TH.
Obr. 3
Účinky mefedrónu na metamfetamínom indukované zníženie striatálneho TH. Myši boli liečené uvedenými dávkami mefedrónu (MEPH) 30 minút pred každou injekciou 2,5 (●) alebo 5,0 mg/kg (■) metamfetamínu (METH) a o 2 dni neskôr usmrtené na stanovenie striatálnych hladín TH imunoblotovaním (a). Bloty boli kvantifikované pomocou ImageJ a údaje sú priemer ± SEM pre 10 - 12 myší v každej skupine (b). Niektoré chybové čiary boli príliš malé na to, aby presiahli veľkosť symbolov, a nie sú viditeľné. **p < 0,001 alebo ***p < 0,0001 oproti kontrole (C) a #p < 0,01, ##p < 0,001 alebo ###p < 0,0001) oproti príslušnej dávke metamfetamínu (Tukeyho test viacnásobného porovnania).
Účinky mefedrónu na hypertermiu vyvolanú metamfetamínom
Mefedrón, podobne ako metamfetamín, spôsobuje významnú hypertermiu (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Keď sa mefedrón podával 30 minút pred každou injekciou metamfetamínu, na obr. 4 možno vidieť, že hlavné účinky dávok metamfetamínu a mefedrónu (F1,300 = 11,99, p < 0,0001) v čase (F4,300 = 51,73, p < 0,0001) boli vysoko signifikantné pomocou dvojcestnej ANOVA. Hlavné účinky mefedrónu podávaného v kombinácii buď s 2,5 mg/kg metamfetamínu (F4,120 = 41,44, p < 0,0001, panel a) v čase (F30,120 = 3,84, p < 0,0001) alebo 5,0 mg/kg metamfetamínu (F4,120 = 78,09, p < 0,0001, panel b) v čase (F30,120 = 9,98, p < 0,0001) boli tiež vysoko významné pomocou dvojcestnej ANOVA. Všetky ošetrenia s ktoroukoľvek dávkou metamfetamínu ± mefedrónu sa významne líšili od príslušných kontrol (p < 0,0001 pre všetky ošetrenia).
Obr. 4
Účinky mefedrónu na hypertermiu vyvolanú metamfetamínom. Myši boli liečené uvedenými dávkami mefedrónu (MEPH) 30 minút pred každou injekciou 2,5 (a) alebo 5,0 mg/kg (b) metamfetamínu (METH). Teplota jadra sa merala v 20-minútových intervaloch telemetricky od 60 min pred prvou injekciou metamfetamínu. Štyri injekcie metamfetamínu sú označené šípkami ležiacimi na osi x. Údaje sú vyjadrené ako priemerná telesná teplota 6 - 8 myší v každej skupine. SEM boli vždy < 10 % priemeru a kvôli prehľadnosti sú vynechané.
Účinky mefedrónu na neurotoxicitu vyvolanú amfetamínom a MDMA
S cieľom otestovať, či by sa zosilňujúce účinky mefedrónu na metamfetamín mohli rozšíriť aj na iné neurotoxické amfetamíny, boli myši liečené týmto β-ketoamfetamínom (20 mg/kg) plus amfetamínom (4X 5 mg/kg) alebo MDMA (4X 20 mg/kg) a výsledky sú uvedené na obr. 5. Pripomeňme, že samotný mefedrón neznižuje striatálne DA, DAT ani TH (Angoa-Perez et al. 2012). Hlavný účinok lieku (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) bol vysoko signifikantný podľa jednocestnej ANOVA pre zníženie DA (obr. 5a). Na obr. 5a je tiež vidieť, že všetky liečby amfetamínom (p < 0,001) alebo MDMA (p < 0,001) samostatne alebo v kombinácii s mefedronom (p < 0,0001 pre obe drogy) významne znížili hladiny DA oproti kontrole. Mefedrón významne zvýšil zníženie DA spôsobené amfetamínom (p < 0,01) alebo MDMA (p < 0,01). Obr. 5b ukazuje podobné účinky kombinovanej liečby liekmi na hladiny DAT v striate. Hlavný účinok lieku (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) bol vysoko signifikantný podľa jednocestnej ANOVA pre DAT. Na obr. 5b je tiež vidieť, že všetky ošetrenia amfetamínom alebo MDMA boli v porovnaní s kontrolou významne (p < 0,0001 pre všetky) nižšie. Mefedrón tiež významne zvýšil zníženie DAT spôsobené amfetamínom alebo MDMA (p < 0,0001 v oboch prípadoch). Nakoniec, na obr. 5c je vidieť, že hlavný účinok lieku (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) bol vysoko významný podľa jednocestnej ANOVA pre zníženie TH. Na obr. 5c je tiež vidieť, že všetky liečby amfetamínom alebo MDMA boli významne (p < 0,0001 pre všetky) nižšie v porovnaní s kontrolou. Mefedrón tiež významne zvýšil zníženie TH spôsobené amfetamínom alebo MDMA (p < 0,0001 v oboch prípadoch)
Obr. 5
Účinky mefedrónu na neurotoxicitu DA nervových zakončení vyvolanú amfetamínom alebo MDMA. Myši boli liečené mefedrónom 20 mg/kg (MEPH) 30 minút pred každou injekciou amfetamínu 5,0 mg/kg (AMPH) alebo MDMA 20 mg/kg a usmrtené 2d po liečbe na stanovenie striatálnych hladín a) DA pomocou HPLC. (b) DAT a (c) TH sa stanovili imunoblotovaním a bloty sa kvantifikovali pomocou ImageJ. Reprezentatívne imunobloty pre DAT a TH sú zahrnuté ako vložky do panelov (b) a (c) v uvedenom poradí a liečby pre oba panely sú označené 1,5: kontrola; 2,6: MEPH; 3: AMPH; 4: AMPH + MEPH; 7: MDMA; a 8: MDMA + MEPH. Údaje sú priemerné ± SEM pre 5 - 12 myší v každej skupine. **p < 0,001 alebo ***p < 0,0001 oproti kontrole a #p < 0,01 alebo ###p < 0,0001 oproti AMPH alebo MDMA (Tukeyho test viacnásobného porovnania).
Účinky nomifenzínu na neurotoxicitu vyvolanú metamfetamínom
Nomifenzín, silný blokátor DAT bez známeho zneužívacieho alebo neurotoxického potenciálu, bol testovaný na schopnosť chrániť pred neurotoxicitou vyvolanou metamfetamínom a na kontrast s účinkami mefedrónu na toxicitu DA nervových zakončení spôsobenú metamfetamínom, amfetamínom a MDMA. Výsledky na obr. 6a ukazujú, že hlavný účinok lieku (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) na hladiny DA bol vysoko významný podľa jednocestnej ANOVA. Samotný nomifenzín nezmenil hladiny DA, ale zníženie spôsobené metamfetamínom (p < 0,0001) bolo mierne, ale významne zvrátené nomifenzínom (p < 0,01). Hlavný účinok lieku (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) na hladiny DAT bol vysoko signifikantný pomocou jednocestnej ANOVA, ako je znázornené na obr. 6b. Nomifenzín nezmenil hladiny DAT, ale poskytol významnú ochranu (p < 0,001) pred znížením striatálneho DAT spôsobeným metamfetamínom (p < 0,0001) v porovnaní s kontrolou. Nakoniec, obr. 6c ukazuje, že hlavný účinok lieku (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) na hladiny TH bol vysoko významný podľa jednocestnej ANOVA. Podobne ako v prípade DA a DAT, zníženiu TH spôsobenému metamfetamínom (p < 0,0001) mierne, ale významne zabránil nomifenzín (p < 0,01).
Obr. 6
Účinky nomifenzínu na neurotoxicitu DA nervového zakončenia vyvolanú metamfetamínom. Myši boli liečené 5,0 mg/kg nomifenzínu (NOM) 30 minút pred každou injekciou 5,0 mg/kg metamfetamínu (METH) a o 2d neskôr usmrtené na stanovenie striatálnych hladín (a) DA pomocou HPLC. (b) DAT a (c) TH boli stanovené imunoblotovaním a bloty boli kvantifikované pomocou ImageJ. Reprezentatívne imunobloty pre DAT a TH sú zahrnuté ako vložky k panelom (b) a (c). Údaje sú priemerné plus SEM pre 5 - 7 myší na skupinu. ***p < 0,0001 oproti kontrole (C) a #p < 0,01 alebo ##p < 0,001 oproti samotnému metamfetamínu (Tukeyho test viacnásobného porovnania).
Diskusia
Cieľom tejto štúdie bolo zistiť, či mefedrón zabráni toxicite DA nervových zakončení spôsobenej metamfetamínom. Na základe jeho chemickej podobnosti s metamfetamínom a MDMA sa pôvodne očakávalo, že mefedrón bude mať škodlivé účinky na DA neurónový systém. Vo viacerých štúdiách sa však takmer súčasne zistilo, že mefedrón nie je toxický pre nervové zakončenia DA (Angoa-Perez et al. 2012, Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011). Otázka, či tento liek spôsobuje poškodenie neurónového systému 5-HT, zostáva otvorená. V jednej štúdii sa uvádza pretrvávajúce zníženie funkcie nervových zakončení 5-HT (Hadlock et al. 2011), zatiaľ čo v inej sa zistilo, že mefedrón nespôsobuje poškodenie (Baumann et al. 2012). Mefedrón interaguje s nervovým zakončením DA spôsobom, ktorý naznačuje, že skutočne stimuluje uvoľňovanie a blokuje spätné vychytávanie DA prostredníctvom interakcií s DAT. Kľúčovým aspektom neurotoxického mechanizmu účinku metamfetamínu je jeho schopnosť získať prístup k DA nervovým zakončeniam prostredníctvom DAT a narušiť homeostázu DA (Sulzer 2011). Ak sa tomuto skorému kroku v neurotoxickej kaskáde metamfetamínu zabráni inhibíciou DAT, zabráni sa toxicite (Pu a kol. 1994, Poth a kol. 2012, Marek a kol. 1990, Schmidt a Gibb 1985). Predpokladali sme, že mefedrón by mohol mať rovnakú ochrannú vlastnosť ako iné inhibítory DAT, ale namiesto toho sme pozorovali výrazné zvýšenie toxicity. Táto interakcia sa pozorovala pri použití dvoch rôznych dávok metamfetamínu, ktoré spôsobujú stredne závažné alebo závažné poškodenie DA nervových zakončení (4X 2,5, resp. 5,0 mg/kg). Tento zosilňujúci účinok mefedrónu sa neobmedzil len na metamfetamín a rozšíril sa aj na amfetamín a MDMA, dve drogy, ktoré sa často užívajú spolu s mefedrónom a inými β-ketoamfetamínmi (Feyissa a Kelly 2008, Schifano a kol. 2011, Kelly 2011). Preto napriek tomu, že mefedrón nespôsobuje toxicitu aspoň DA nervových zakončení striata, zosilňuje neurotoxické účinky iných drog zneužívania. Toto nové zistenie by malo zneužívanie mefedrónu postaviť do ešte ostrejších podmienok, pretože jeho nedostatočná vnútorná neurotoxicita môže spôsobiť, že sa bude javiť ako neškodný.
Hypertermia je bežne hlásený akútny nežiaduci účinok požitia metamfetamínu (Greene a kol. 2008) a β-ketoamfetamínu u ľudí (Borek a Holstege 2012, Prosser a Nelson 2012). Podobne ako metamfetamín, aj mnohé z β-ketoamfetamínových drog spôsobujú u hlodavcov výrazné zvýšenie telesnej teploty (Angoa-Perez a kol. 2012, Hadlock a kol. 2011, Baumann a kol. 2012, Rockhold a kol. 1997). Hoci hypertermia spôsobená metamfetamínom môže prispievať k jeho morfologickým a neuronálne poškodzujúcim účinkom, nemusí byť nevyhnutne hypertermia priamou príčinou týchto účinkov (Kiyatkin a Sharma 2009). Zaznamenávali sme teplotu telesného jadra u myší liečených mefedrónom a metamfetamínom a pozorovali sme, že kombinovaná liečba nezvýšila teplotu nad maximálny nárast pozorovaný po jednom z týchto liekov samostatne. Metamfetamín spôsobil zvýšenie telesnej teploty v závislosti od dávky a táto hypertermia bola nemenná v celom testovanom rozsahu dávok mefedrónu. V skutočnosti sa pokles telesnej teploty po injekcii pozorovaný po liečbe mefedrónom (Angoa-Perez et al. 2012) zachoval aj pri vyšších dávkach mefedrónu a metamfetamínu. Aj keď hypertermia vyvolaná liekom nebola kombinovanou liečbou liekom zvýšená, neurotoxické účinky boli aditívne. Preto sa aspoň v tomto prípade zdá, že neurotoxické účinky metamfetamínu môžu byť zosilnené mefedrónom spôsobom, ktorý je nezávislý od hypertermie.
Mefedrón jednoznačne inhibuje funkciu DAT a blokuje spätné vychytávanie DA in vitro (Lopez-Arnau et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Kehr et al. 2011, Martinez-Clemente et al. 2012, Cozzi et al. 1999). Mefedrón vytláča WIN-35,428 z jeho väzbového miesta na DAT, čo naznačuje, že je kompetitívnym inhibítorom vychytávania DA (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). Účinnosť mefedrónu je v tomto ohľade veľmi podobná účinnosti metamfetamínu (Cozzi et al. 1999) a MDMA (Escubedo et al. 2011). Nie je známe, či je mefedrón transportovaný DAT, ale metkatinón áno (Cozzi a Foley 2003). Nomifenzín a kyselina amfonelová, ktoré sa viažu na DAT a inhibujú vychytávanie DA, poskytujú značnú ochranu pred neurotoxicitou vyvolanou metamfetamínom (Pu a kol. 1994, Marek a kol. 1990, Schmidt a Gibb 1985, Poth a kol. 2012) a myši bez DAT sú rezistentné voči neuronálnej toxicite metamfetamínu (Fumagalli a kol. 1998). Poznanie, že mefedrón nie je neurotoxický a je blokátorom DAT, vedie k predpovedi, že by mal zabrániť toxicite. V tejto súvislosti sme testovali nomifenzín ako pozitívnu kontrolu a potvrdili sme, že chráni pred depléciou DA, DAT a TH vyvolanou metamfetamínom. Nomifenzín tiež inhibuje noradrenalínový transportér (Brogden et al. 1979), ale táto vlastnosť nemôže vysvetliť súčasné výsledky, pretože väčšina β-ketoamfetamínov vrátane mefedrónu inhibuje noradrenalínový transportér a blokuje vychytávanie noradrenalínu (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). Úloha neuronálneho systému 5-HT v niektorých farmakologických účinkoch mefedrónu je možná vzhľadom na schopnosť tejto drogy, podobne ako MDMA (Yamamoto et al. 1995), spôsobovať vyplavovanie striatálneho DA prostredníctvom interakcií s receptormi 5-HT2A (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). Hyperlokomócia spôsobená mefedrónom závisí od endogénneho 5-HT (Lopez-Arnau et al. 2012) a tento liek tiež stimuluje uvoľňovanie 5-HT a inhibuje jeho vychytávanie in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) a in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). Úlohu endogénneho 5-HT v DA neurotoxicite prinajmenšom metamfetamínu však môžeme vylúčiť tým, že sme preukázali, že myši geneticky ochudobnené o 5-HT si zachovávajú citlivosť na neurotoxicitu (Thomas et al. 2010).
Mefedrón by mohol zvýšiť neurotoxicitu metamfetamínu niekoľkými možnými mechanizmami. Po prvé, mefedrón by mohol interagovať s VMAT a spôsobiť únik DA do cytoplazmy presynaptického nervového zakončenia. Liečby, ktoré zvyšujú cytoplazmatický pool (t. j. uvoľniteľný liekom) DA, zvyšujú neurotoxicitu metamfetamínu (Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009, Schmidt et al. 1985). Tento mechanizmus nie je pravdepodobný, pretože metkatinón len slabo interaguje s VMAT (Cozzi et al. 1999). Po druhé, kombinácia mefedrónu a metamfetamínu by mohla mať synergický účinok na nevezikulárne uvoľňovanie DA, ale táto možnosť sa tiež zdá nepravdepodobná vzhľadom na výsledky, ktoré ukazujú, že ošetrenie buniek CHO exprimujúcich DAT alebo SERT metylónom a metamfetamínom nemá aditívny účinok na uvoľňovanie DA alebo 5-HT (Sogawa et al. 2011). Po tretie, mefedrón by mohol interagovať s DAT novým spôsobom, ktorý prispieva k aditívnej toxicite. Ukázalo sa, že metylón v kombinácii s metamfetamínom spôsobuje synergickú cytotoxicitu v bunkách CHO exprimujúcich DAT alebo SERT, ale nie v bunkách CHO divokého typu bez týchto transportérov (Sogawa et al. 2011). Cytotoxicita pozorovaná v kultivovaných bunkách v týchto štúdiách (t. j. uvoľňovanie LDH) je veľmi odlišná od poškodenia DA nervových zakončení spôsobeného metamfetamínom, ale tento mechanizmus naznačuje zaujímavú, ale nedefinovanú úlohu DAT pri zvýšenej cytotoxicite. Napokon, mefedrón by mohol zmeniť metabolizmus metamfetamínu. Mefedrón sa primárne metabolizuje N-demetyláciou (Meyer a Maurer 2010), rovnako ako metamfetamín a MDMA (Caldwell 1976). Podpora tohto mechanizmu vyplýva z preukázania, že metamfetamín a MDMA vzájomne inhibujú tvorbu svojich príslušných primárnych metabolitov a zvyšujú plazmatické hladiny drog nad hodnoty pozorované po podaní jednej z nich samostatne (Kuwayama et al. 2012). Dávky mefedrónu použité v súčasnosti a v našej predchádzajúcej štúdii (Angoa-Perez a kol. 2012) sú síce vysoké, ale nie sú neurotoxické a spadajú do rozsahu, ktorý ľudia zneužívajú (McErath a O'Neill 2011). Preto by mefedrón mohol pôsobiť podobne ako MDMA na zvýšenie plazmatických hladín metamfetamínu inhibíciou jeho metabolizmu. Na potvrdenie tejto druhej možnosti bude potrebná hĺbková farmakokinetická analýza.
Zneužívanie β-ketoamfetamínov narastá alarmujúcim tempom a mefedrón je v súčasnosti po kanabise, MDMA a kokaíne jednou z najčastejšie užívaných drog (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Okrem toho mefedrón vyvoláva u ľudí silnejší pocit túžby v porovnaní s MDMA (Brunt et al. 2011) a užívatelia, ktorí mefedrón šnupú, ho hodnotia ako návykovejší ako kokaín (Winstock et al. 2011b). Mefedrón ľudia konzumujú nárazovo (t. j. "stohovaním") a často ho užívajú spolu s inými drogami, ako je kanabis a amfetamínové psychostimulanciá (Schifano a kol. 2011, Fass a kol. 2012, Winstock a kol. 2011a, Kelly 2011, Torrance a Cooper 2010). Mefedrón sa čoraz častejšie nachádza v tabletách predávaných ako MDMA (Brunt et al. 2011) a jeho užívanie pravdepodobne prekoná užívanie MDMA, keďže čistota tejto druhej drogy stále klesá (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Na základe bežných modelov zneužívania mefedrónu a ďalších zložiek "kúpeľových solí" je dôležité zvážiť, či pri úmyselnej alebo neúmyselnej kombinácii týchto drog s amfetamínmi vznikajú u ľudí ďalšie zdravotné riziká. Naše výsledky, ktoré ukazujú, že prinajmenšom mefedrón výrazne zvyšuje neurotoxicitu DA nervových zakončení striata spôsobenú metamfetamínom, amfetamínom a MDMA, odhaľujú obzvlášť nebezpečnú a neočakávanú vlastnosť tohto β-ketoamfetamínu.
Použité skratky
5-HT serotonín
DA dopamín
DAT DA transportér
MDMA 3,4-metyléndioxymetamfetamín
TH tyrozínhydroxyláza
VMAT vezikulárny monoamínový transportér
Mefedrón (4-metylmetkatinón) je derivát katinónu a štrukturálny analóg metamfetamínu a 3,4-metyléndioxy-metamfetamínu (MDMA). Mefedrón je jednou z psychoaktívnych zložiek "kúpeľových solí" spolu s ďalšími zlúčeninami, ako sú metylón, butylón a 3,4-metyléndioxypyrovalerón (MDPV). β-ketoamfetamíny sa zneužívajú čoraz častejšie, čo je v nemalej miere spôsobené veľmi obmedzenou dostupnosťou prekurzorov potrebných na syntézu metamfetamínu a MDMA v tajných laboratóriách a zodpovedajúcim znížením ich čistoty (Winstock a kol. 2011b, Brunt a kol. 2011). Keďže zneužívanie β-ketoamfetamínov stále rastie, zoznam ich nežiaducich účinkov sa rozšíril o kardiovaskulárne komplikácie, agitovanosť, nespavosť, psychózy a depresie (Schifano a kol. 2011, Prosser a Nelson 2012).
Ako chemické príbuzné metamfetamínu a MDMA nie je prekvapujúce, že β-ketoamfetamíny majú na centrálny nervový systém mnohé rovnaké účinky ako tieto predchádzajúce drogy. Tieto drogy napríklad blokujú dopamínové (DA) a serotonínové (5-HT) transportéry (DAT, resp. SERT) (Cozzi et al. 1999, Rothman et al. 2003, Fleckenstein et al. 2000, Lopez-Arnau et al. 2012) a stimulujú uvoľňovanie monoamínov in vitro (Kalix a Glennon 1986, Gygi et al. 1997, Rothman et al. 2003) a in vivo (Gygi et al. 1997, Kehr et al. 2011). Metkatinón spôsobuje trvalé zníženie aktivity tryptofán hydroxylázy a tyrozín hydroxylázy (TH) a vyčerpanie DA a 5-HT (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). PET zobrazovacie štúdie u abstinujúcich užívateľov metkatinónu odhalili zníženú striatálnu hustotu DAT, čo naznačuje stratu DA terminálov (McCann et al. 1998). Súčasná stimulácia uvoľňovania DA a inhibícia jeho vychytávania odráža kritické prvky, ktoré sú základom neurotoxicity spojenej s metamfetamínom (Kuhn a kol. 2008, Yamamoto a Bankson 2005, Cadet a kol. 2007, Fleckenstein a kol. 2007).
My (Angoa-Perez et al. 2012) a ďalší (Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011) sme nedávno skúmali možnosť, že by mefedrón mohol spôsobovať neurotoxicitu ako metamfetamín a MDMA. Prekvapivo mefedrón nebol toxický pre DA nervové zakončenia striata (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Otázka, či mefedrón poškodzuje nervové zakončenia 5-HT, zostáva nedoriešená, keďže jedna štúdia dokumentovala pozitívne účinky (Hadlock et al. 2011), zatiaľ čo iná bola negatívna (Baumann et al. 2012). Vzhľadom na relatívne priaznivý účinok mefedrónu na nervové zakončenia DA a vzhľadom na jeho vlastnosti ako blokátora DAT sme predpokladali, že by mohol skutočne chrániť DA neurónový systém pred neurotoxickými účinkami metamfetamínu podobne, ako je to známe pri iných blokátoroch DAT, ako je kyselina amfonelová (Pu et al. 1994, Schmidt a Gibb 1985, Marek et al. 1990) a nomifenzín (Poth et al. 2012). V súčasnosti uvádzame, že mefedrón významne zvyšuje neurotoxicitu metamfetamínu. Tento účinok sa rozširuje aj na amfetamín a MDMA, drogy, ktoré sa často užívajú spolu s mefedrónom (Feyissa a Kelly 2008, Schifano a kol. 2011). Tieto prekvapivé výsledky stavajú zneužívanie mefedrónu do nového svetla a zvyšujú naliehavosť rozpoznania tejto jemnej a nebezpečnej vlastnosti tohto β-ketoamfetamínu.
Materiály a metódy
Drogy a činidlá
Mefedrón hydrochlorid a 3,4-metyléndioxymetamfetamín (MDMA) boli získané z programu NIDA Research Resources Drug Supply Program. (+) Metamfetamín hydrochlorid, nomifenzín maleát, d-amfetamín sulfát, pentobarbital, DA a všetky pufre a HPLC činidlá boli zakúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Súpravy na stanovenie bielkovín kyseliny bicinchonínovej boli získané od spoločnosti Pierce (Rockford, IL, USA). Polyklonálne protilátky proti potkaniu TH boli vyrobené podľa predchádzajúceho opisu (Kuhn a Billingsley 1987). Monoklonálne protilátky proti DAT potkanov veľkoryso poskytla Dr. Roxanne A. Vaughan (University of North Dakota, Grand Forks, ND, USA). Sekundárne protilátky proti IgG konjugované s HRP poskytla spoločnosť Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc (West Grove, PA, USA).
Zvieratá
Samice myší C57BL/6 (Harlan, Indianapolis, IN, USA) s hmotnosťou 20 - 25 g v čase experimentu boli umiestnené po 5 v klietke vo veľkých klietkach s obuvou v miestnosti s kontrolovaným svetlom (12 h svetlo/tma) a teplotou. Použili sa samice myší, pretože je známe, že sú veľmi citlivé na poškodenie neurónov neurotoxickými amfetamínmi, a aby sa zachovala konzistentnosť s našimi predchádzajúcimi štúdiami neurotoxicity metamfetamínu (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Myši mali voľný prístup k potrave a vode. Inštitucionálny výbor pre starostlivosť a používanie na Wayne State University schválil starostlivosť o zvieratá a experimentálne postupy. Všetky postupy boli tiež v súlade s Príručkou NIH pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat.
Farmakologické, fyziologické a behaviorálne postupy
Myši boli liečené mefedrónom pomocou režimu podobného fetovaniu, ktorý pozostával zo 4 injekcií 10, 20 alebo 40 mg/kg s dvojhodinovým intervalom medzi jednotlivými injekciami. Tento režim liečby binge, keď sa používa na injekčné podávanie substituovaných amfetamínov a derivátov katinónu, vedie k rozsiahlemu poškodeniu zakončenia DA nervu. Dávky mefedrónu používané v súčasnosti sa predtým ukázali ako netoxické pre DA nervové zakončenia (Angoa-Perez a kol. 2012). Myši boli liečené metamfetamínom (4X 2,5 alebo 5 mg/kg), amfetamínom (4X 5 mg/kg) alebo MDMA (4X 20 mg/kg) samostatne alebo v kombinácii s mefedrónom. Pri liečbe dvoma drogami dostali myši injekciu mefedrónu 30 minút pred každou zo 4 injekcií metamfetamínu, amfetamínu alebo MDMA. Kontroly dostali injekcie fyziologického roztoku podľa rovnakého rozpisu, aký sa použil pre mefedrón samotný alebo v kombinácii s inými amfetamínmi. Ako kontrola účinkov inhibítora DAT na toxicitu metamfetamínu sa myšiam 30 minút pred každou injekciou metamfetamínu (4X 5 mg/kg) podával nomifenzín (4X 5 mg/kg). Všetky injekcie sa podávali i.p. cestou. Myši boli usmrtené 2 dni po poslednej liečbe liekom, keď neurotoxicita spojená s amfetamínom dosiahla maximum. Telesná teplota sa monitorovala telemetricky pomocou implantovateľných teplotných transpondérov IPTT-300 od spoločnosti Bio Medic Data Systems, Inc (Seaford, DE, USA). Teplota sa zaznamenávala neinvazívne každých 20 minút počnúc 60 minút pred prvou injekciou METH a pokračujúc potom počas 9 hodín pomocou konzolového systému DAS-5001 od spoločnosti Bio Medic.
Stanovenie obsahu striatálneho DA
Striatálne tkanivo bolo po liečbe obojstranne vypreparované z mozgu a uložené pri -80 °C. Zmrazené tkanivá sa odvážili a sonikovali v 10 objemoch 0,16 N kyseliny chloristej pri 4 °C. Nerozpustné bielkoviny sa odstránili centrifugáciou a DA sa stanovil pomocou HPLC s elektrochemickou detekciou, ako už bolo opísané pre metamfetamín (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
Stanovenie hladín proteínov TH a DAT pomocou imunoblotu
Účinky liečby liekmi na striatálne hladiny TH a DAT sa stanovili imunoblotovaním ako index toxicity striatálnych DA nervových zakončení. Myši boli po liečbe usmrtené dekapitáciou a striatum bolo obojstranne vypreparované. Tkanivo sa skladovalo pri teplote -80 °C. Zmrazené tkanivo sa rozrušilo sonikáciou v 1 % SDS pri 95 °C a nerozpustný materiál sa odstredil. Proteín sa stanovil metódou kyseliny bicinchonínovej a rovnaké množstvá proteínu (70 μg/l) sa rozlíšili elektroforézou v SDS-polyakrylamidovom géle a potom sa elektroblotovali na nitrocelulózu. Bloty boli blokované v Trisovom pufrovanom fyziologickom roztoku obsahujúcom Tween 20 (0,1 % v/v) a 5 % odtučnené suché mlieko počas 1 hodiny pri izbovej teplote. Primárne protilátky proti TH (1:1000) alebo DAT (1:1000) sa pridali na bloty a nechali sa inkubovať 16 h pri 4 °C. Bloty sa 3x premyli v Tris-buffered saline na odstránenie nezreagovaných protilátok a potom sa inkubovali s HRP-konjugovanou sekundárnou protilátkou anti-IgG (1:4000) počas 1 h pri izbovej teplote. Imunoreaktívne pásy sa vizualizovali pomocou zvýšenej chemiluminiscencie a relatívna hustota pásov reagujúcich na TH a DAT sa stanovila zobrazením pomocou Kodak Image Station (Carestream Molecular Systems, Rochester, NY, USA) a kvantifikovala pomocou softvéru ImageJ (NIH).
Analýza údajov
Na analýzu účinkov dávky metamfetamínu oproti mefedronu na DA, DAT a TH sa vykonali dvojcestné ANOVA. Účinky liečby liekmi na striatálny obsah DA, TH a DAT sa testovali na významnosť pomocou jednosmernej ANOVA, po ktorej nasledoval Tukeyho test viacnásobného porovnania. Výsledky liečby liekmi na teplotu telesného jadra v čase sa analyzovali pomocou dvojcestnej ANOVA, po ktorej nasledoval Bonferroniho test na určenie významnosti rozdielov v teplote v jednotlivých časoch po liečbe. Rozdiely sa považovali za významné, ak p < 0,05. Všetky štatistické analýzy sa vykonali pomocou programu GraphPad Prism verzia 5.02 pre Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com).
Prejsť na: 1:
Výsledky
Účinky mefedrónu na neurotoxicitu vyvolanú metamfetamínom
Mefedrón v dávkach (10, 20 alebo 40 mg/kg), o ktorých je známe, že nespôsobujú toxicitu DA nervových zakončení (Angoa-Perez et al. 2012), sa podával 30 min pred každou injekciou metamfetamínu. Metamfetamín sa podával v dávkach, ktoré spôsobujú stredne závažné (4x 2,5 mg/kg) alebo závažné (4x 5 mg/kg) poškodenie DA nervových zakončení striata (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). Výsledky uvedené na obr. 1 ukazujú, že hlavné účinky dávky metamfetamínu (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) a dávky mefedrónu (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) na hladiny DA v striate boli vysoko signifikantné podľa dvojcestnej ANOVA. Hlavný účinok mefedrónu podávaného v kombinácii s 2,5 mg/kg (F4,22 = 35,96, p < 0,001) alebo 5,0 mg/kg metamfetamínu (F4,17 = 953,9, p < 0,0001) bol tiež vysoko významný pomocou jednocestnej ANOVA. Všetky ošetrenia s ktoroukoľvek dávkou metamfetamínu ± mefedrónu spôsobili významne väčšie zníženie DA v porovnaní s príslušnou kontrolou (p < 0,0001 pre všetky). Z obr. 1 tiež vyplýva, že dávky mefedrónu 20 (p < 0,01) a 40 mg/kg (p < 0,001) významne zvýšili vyčerpávajúce účinky metamfetamínu 2,5 mg/kg na DA, zatiaľ čo všetky dávky mefedrónu významne zvýšili účinky metamfetamínu 5,0 mg/kg na hladiny DA (p < 0,0001 pre všetky).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/sywobkqrnd-jpg.47/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Obr.1
Účinky mefedrónu na metamfetamínom indukované zníženie striatálneho DA. Myši boli liečené uvedenými dávkami mefedrónu (MEPH) 30 minút pred každou injekciou 2,5 (-) alebo 5,0 mg/kg (■) metamfetamínu (METH) a o 2 dni neskôr usmrtené na stanovenie striatálnych hladín DA pomocou HPLC. Údaje sú priemerné ± SEM pre 5 - 7 myší v každej skupine. Niektoré chybové čiary boli príliš malé na to, aby presiahli veľkosť symbolov, a nie sú viditeľné. ***p < 0,001 oproti kontrolám a #p < 0,01, ##p < 0,001 alebo ###p < 0,0001 oproti príslušnej dávke metamfetamínu (Tukeyho test viacnásobného porovnania).
Obr. 2a ukazuje, že mefedrón významne zvýšil metamfetamínom indukované zníženie hladín DAT, ako sa stanovilo imunoblotovaním. Imunobloty boli kvantifikované a v zhode s výsledkami pre DA boli hlavné účinky dávky metamfetamínu (F1,92 = 9,48, p < 0,001) a dávky mefedrónu (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) na hladiny DAT v striate vysoko významné pomocou dvojcestnej ANOVA (obr. 2b). Hlavný účinok mefedrónu podávaného v kombinácii s 2,5 mg/kg (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) alebo 5,0 mg/kg metamfetamínu (F4,39 = 24,84, p < 0,0001) bol tiež vysoko signifikantný pomocou jednocestnej ANOVA. Všetky ošetrenia s ktoroukoľvek dávkou metamfetamínu ± mefedrónu spôsobili významne väčšie zníženie DAT v porovnaní s príslušnou kontrolou (p < 0,01 pre samotný metamfetamín 2,5 mg/kg; p < 0,0001 pre všetky ostatné ošetrenia). Obr. 2b tiež ukazuje, že dávky mefedrónu 20 mg/kg (p < 0,01) a 40 mg/kg (p < 0,001) významne zvýšili zníženie DAT spôsobené 2,5 mg/kg metamfetamínu, zatiaľ čo iba dávka 40 mg/kg mefedrónu významne zvýšila (p < 0,01) účinky 5,0 mg/kg metamfetamínu na zníženie DAT.
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/bfu3sx5dnr-jpg.4797/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Obr. 2
Účinky mefedrónu na metamfetamínom indukované zníženie striatálneho DAT. Myši boli liečené uvedenými dávkami mefedrónu (MEPH) 30 minút pred každou injekciou 2,5 (●) alebo 5,0 mg/kg (■) metamfetamínu (METH) a o 2 dni neskôr usmrtené na stanovenie striatálnych hladín DAT pomocou imunoblotu (a). Bloty boli kvantifikované pomocou ImageJ a údaje sú priemer ± SEM pre 10 - 12 myší v každej skupine (b). *p < 0,01 alebo ***p < 0,0001 oproti kontrole (C) a #p < 0,01 alebo ##p < 0,001 oproti príslušnej dávke metamfetamínu (Tukeyho test viacnásobného porovnania).
Obr. 3a ukazuje, že mefedrón významne zvýšil metamfetamínom indukované zníženie hladín TH, ako sa stanovilo imunoblotovaním. Imunobloty boli kvantifikované a v zhode s výsledkami uvedenými vyššie pre DA a DAT boli hlavné účinky dávky metamfetamínu (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) a dávky mefedrónu (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) vysoko významné pomocou dvojcestnej ANOVA (obr. 3b). Hlavný účinok mefedrónu podávaného v kombinácii s 2,5 mg/kg (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) alebo 5,0 mg/kg metamfetamínu (F4,49 = 99,16, p < 0,0001) bol vysoko signifikantný aj pri jednocestnej ANOVA. Všetky ošetrenia s ktoroukoľvek dávkou metamfetamínu ± mefedrónu spôsobili významne väčšie zníženie TH v porovnaní s príslušnou kontrolou (p < 0,001 pre 2,5 mg/kg metamfetamínu + 10 mg/kg mefedrónu; p < 0,0001 pre všetky ostatné kombinácie) s výnimkou samotného 2,5 mg/kg metamfetamínu, ktorý významne nezmenil hladiny TH (t. j. žiadna toxicita). Obr. 3b tiež ukazuje, že dávky mefedrónu 20 mg/kg (p < 0,01) a 40 mg/kg (p < 0,001) významne zvýšili zníženie TH spôsobené metamfetamínom 2,5 mg/kg a všetky tri dávky mefedrónu významne (p < 0,0001) zvýšili účinky metamfetamínu 5,0 mg/kg na zníženie TH.
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/tggfrjpqru-jpg.4798/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Obr. 3
Účinky mefedrónu na metamfetamínom indukované zníženie striatálneho TH. Myši boli liečené uvedenými dávkami mefedrónu (MEPH) 30 minút pred každou injekciou 2,5 (●) alebo 5,0 mg/kg (■) metamfetamínu (METH) a o 2 dni neskôr usmrtené na stanovenie striatálnych hladín TH imunoblotovaním (a). Bloty boli kvantifikované pomocou ImageJ a údaje sú priemer ± SEM pre 10 - 12 myší v každej skupine (b). Niektoré chybové čiary boli príliš malé na to, aby presiahli veľkosť symbolov, a nie sú viditeľné. **p < 0,001 alebo ***p < 0,0001 oproti kontrole (C) a #p < 0,01, ##p < 0,001 alebo ###p < 0,0001) oproti príslušnej dávke metamfetamínu (Tukeyho test viacnásobného porovnania).
Účinky mefedrónu na hypertermiu vyvolanú metamfetamínom
Mefedrón, podobne ako metamfetamín, spôsobuje významnú hypertermiu (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Keď sa mefedrón podával 30 minút pred každou injekciou metamfetamínu, na obr. 4 možno vidieť, že hlavné účinky dávok metamfetamínu a mefedrónu (F1,300 = 11,99, p < 0,0001) v čase (F4,300 = 51,73, p < 0,0001) boli vysoko signifikantné pomocou dvojcestnej ANOVA. Hlavné účinky mefedrónu podávaného v kombinácii buď s 2,5 mg/kg metamfetamínu (F4,120 = 41,44, p < 0,0001, panel a) v čase (F30,120 = 3,84, p < 0,0001) alebo 5,0 mg/kg metamfetamínu (F4,120 = 78,09, p < 0,0001, panel b) v čase (F30,120 = 9,98, p < 0,0001) boli tiež vysoko významné pomocou dvojcestnej ANOVA. Všetky ošetrenia s ktoroukoľvek dávkou metamfetamínu ± mefedrónu sa významne líšili od príslušných kontrol (p < 0,0001 pre všetky ošetrenia).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/x0ik9hdwsw-jpg.4799/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Obr. 4
Účinky mefedrónu na hypertermiu vyvolanú metamfetamínom. Myši boli liečené uvedenými dávkami mefedrónu (MEPH) 30 minút pred každou injekciou 2,5 (a) alebo 5,0 mg/kg (b) metamfetamínu (METH). Teplota jadra sa merala v 20-minútových intervaloch telemetricky od 60 min pred prvou injekciou metamfetamínu. Štyri injekcie metamfetamínu sú označené šípkami ležiacimi na osi x. Údaje sú vyjadrené ako priemerná telesná teplota 6 - 8 myší v každej skupine. SEM boli vždy < 10 % priemeru a kvôli prehľadnosti sú vynechané.
Účinky mefedrónu na neurotoxicitu vyvolanú amfetamínom a MDMA
S cieľom otestovať, či by sa zosilňujúce účinky mefedrónu na metamfetamín mohli rozšíriť aj na iné neurotoxické amfetamíny, boli myši liečené týmto β-ketoamfetamínom (20 mg/kg) plus amfetamínom (4X 5 mg/kg) alebo MDMA (4X 20 mg/kg) a výsledky sú uvedené na obr. 5. Pripomeňme, že samotný mefedrón neznižuje striatálne DA, DAT ani TH (Angoa-Perez et al. 2012). Hlavný účinok lieku (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) bol vysoko signifikantný podľa jednocestnej ANOVA pre zníženie DA (obr. 5a). Na obr. 5a je tiež vidieť, že všetky liečby amfetamínom (p < 0,001) alebo MDMA (p < 0,001) samostatne alebo v kombinácii s mefedronom (p < 0,0001 pre obe drogy) významne znížili hladiny DA oproti kontrole. Mefedrón významne zvýšil zníženie DA spôsobené amfetamínom (p < 0,01) alebo MDMA (p < 0,01). Obr. 5b ukazuje podobné účinky kombinovanej liečby liekmi na hladiny DAT v striate. Hlavný účinok lieku (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) bol vysoko signifikantný podľa jednocestnej ANOVA pre DAT. Na obr. 5b je tiež vidieť, že všetky ošetrenia amfetamínom alebo MDMA boli v porovnaní s kontrolou významne (p < 0,0001 pre všetky) nižšie. Mefedrón tiež významne zvýšil zníženie DAT spôsobené amfetamínom alebo MDMA (p < 0,0001 v oboch prípadoch). Nakoniec, na obr. 5c je vidieť, že hlavný účinok lieku (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) bol vysoko významný podľa jednocestnej ANOVA pre zníženie TH. Na obr. 5c je tiež vidieť, že všetky liečby amfetamínom alebo MDMA boli významne (p < 0,0001 pre všetky) nižšie v porovnaní s kontrolou. Mefedrón tiež významne zvýšil zníženie TH spôsobené amfetamínom alebo MDMA (p < 0,0001 v oboch prípadoch)
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/onvypkgxvn-jpg.4800/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Obr. 5
Účinky mefedrónu na neurotoxicitu DA nervových zakončení vyvolanú amfetamínom alebo MDMA. Myši boli liečené mefedrónom 20 mg/kg (MEPH) 30 minút pred každou injekciou amfetamínu 5,0 mg/kg (AMPH) alebo MDMA 20 mg/kg a usmrtené 2d po liečbe na stanovenie striatálnych hladín a) DA pomocou HPLC. (b) DAT a (c) TH sa stanovili imunoblotovaním a bloty sa kvantifikovali pomocou ImageJ. Reprezentatívne imunobloty pre DAT a TH sú zahrnuté ako vložky do panelov (b) a (c) v uvedenom poradí a liečby pre oba panely sú označené 1,5: kontrola; 2,6: MEPH; 3: AMPH; 4: AMPH + MEPH; 7: MDMA; a 8: MDMA + MEPH. Údaje sú priemerné ± SEM pre 5 - 12 myší v každej skupine. **p < 0,001 alebo ***p < 0,0001 oproti kontrole a #p < 0,01 alebo ###p < 0,0001 oproti AMPH alebo MDMA (Tukeyho test viacnásobného porovnania).
Účinky nomifenzínu na neurotoxicitu vyvolanú metamfetamínom
Nomifenzín, silný blokátor DAT bez známeho zneužívacieho alebo neurotoxického potenciálu, bol testovaný na schopnosť chrániť pred neurotoxicitou vyvolanou metamfetamínom a na kontrast s účinkami mefedrónu na toxicitu DA nervových zakončení spôsobenú metamfetamínom, amfetamínom a MDMA. Výsledky na obr. 6a ukazujú, že hlavný účinok lieku (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) na hladiny DA bol vysoko významný podľa jednocestnej ANOVA. Samotný nomifenzín nezmenil hladiny DA, ale zníženie spôsobené metamfetamínom (p < 0,0001) bolo mierne, ale významne zvrátené nomifenzínom (p < 0,01). Hlavný účinok lieku (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) na hladiny DAT bol vysoko signifikantný pomocou jednocestnej ANOVA, ako je znázornené na obr. 6b. Nomifenzín nezmenil hladiny DAT, ale poskytol významnú ochranu (p < 0,001) pred znížením striatálneho DAT spôsobeným metamfetamínom (p < 0,0001) v porovnaní s kontrolou. Nakoniec, obr. 6c ukazuje, že hlavný účinok lieku (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) na hladiny TH bol vysoko významný podľa jednocestnej ANOVA. Podobne ako v prípade DA a DAT, zníženiu TH spôsobenému metamfetamínom (p < 0,0001) mierne, ale významne zabránil nomifenzín (p < 0,01).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/daczg9cwfv-jpg.4801/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Obr. 6
Účinky nomifenzínu na neurotoxicitu DA nervového zakončenia vyvolanú metamfetamínom. Myši boli liečené 5,0 mg/kg nomifenzínu (NOM) 30 minút pred každou injekciou 5,0 mg/kg metamfetamínu (METH) a o 2d neskôr usmrtené na stanovenie striatálnych hladín (a) DA pomocou HPLC. (b) DAT a (c) TH boli stanovené imunoblotovaním a bloty boli kvantifikované pomocou ImageJ. Reprezentatívne imunobloty pre DAT a TH sú zahrnuté ako vložky k panelom (b) a (c). Údaje sú priemerné plus SEM pre 5 - 7 myší na skupinu. ***p < 0,0001 oproti kontrole (C) a #p < 0,01 alebo ##p < 0,001 oproti samotnému metamfetamínu (Tukeyho test viacnásobného porovnania).
Diskusia
Cieľom tejto štúdie bolo zistiť, či mefedrón zabráni toxicite DA nervových zakončení spôsobenej metamfetamínom. Na základe jeho chemickej podobnosti s metamfetamínom a MDMA sa pôvodne očakávalo, že mefedrón bude mať škodlivé účinky na DA neurónový systém. Vo viacerých štúdiách sa však takmer súčasne zistilo, že mefedrón nie je toxický pre nervové zakončenia DA (Angoa-Perez et al. 2012, Baumann et al. 2012, Hadlock et al. 2011). Otázka, či tento liek spôsobuje poškodenie neurónového systému 5-HT, zostáva otvorená. V jednej štúdii sa uvádza pretrvávajúce zníženie funkcie nervových zakončení 5-HT (Hadlock et al. 2011), zatiaľ čo v inej sa zistilo, že mefedrón nespôsobuje poškodenie (Baumann et al. 2012). Mefedrón interaguje s nervovým zakončením DA spôsobom, ktorý naznačuje, že skutočne stimuluje uvoľňovanie a blokuje spätné vychytávanie DA prostredníctvom interakcií s DAT. Kľúčovým aspektom neurotoxického mechanizmu účinku metamfetamínu je jeho schopnosť získať prístup k DA nervovým zakončeniam prostredníctvom DAT a narušiť homeostázu DA (Sulzer 2011). Ak sa tomuto skorému kroku v neurotoxickej kaskáde metamfetamínu zabráni inhibíciou DAT, zabráni sa toxicite (Pu a kol. 1994, Poth a kol. 2012, Marek a kol. 1990, Schmidt a Gibb 1985). Predpokladali sme, že mefedrón by mohol mať rovnakú ochrannú vlastnosť ako iné inhibítory DAT, ale namiesto toho sme pozorovali výrazné zvýšenie toxicity. Táto interakcia sa pozorovala pri použití dvoch rôznych dávok metamfetamínu, ktoré spôsobujú stredne závažné alebo závažné poškodenie DA nervových zakončení (4X 2,5, resp. 5,0 mg/kg). Tento zosilňujúci účinok mefedrónu sa neobmedzil len na metamfetamín a rozšíril sa aj na amfetamín a MDMA, dve drogy, ktoré sa často užívajú spolu s mefedrónom a inými β-ketoamfetamínmi (Feyissa a Kelly 2008, Schifano a kol. 2011, Kelly 2011). Preto napriek tomu, že mefedrón nespôsobuje toxicitu aspoň DA nervových zakončení striata, zosilňuje neurotoxické účinky iných drog zneužívania. Toto nové zistenie by malo zneužívanie mefedrónu postaviť do ešte ostrejších podmienok, pretože jeho nedostatočná vnútorná neurotoxicita môže spôsobiť, že sa bude javiť ako neškodný.
Hypertermia je bežne hlásený akútny nežiaduci účinok požitia metamfetamínu (Greene a kol. 2008) a β-ketoamfetamínu u ľudí (Borek a Holstege 2012, Prosser a Nelson 2012). Podobne ako metamfetamín, aj mnohé z β-ketoamfetamínových drog spôsobujú u hlodavcov výrazné zvýšenie telesnej teploty (Angoa-Perez a kol. 2012, Hadlock a kol. 2011, Baumann a kol. 2012, Rockhold a kol. 1997). Hoci hypertermia spôsobená metamfetamínom môže prispievať k jeho morfologickým a neuronálne poškodzujúcim účinkom, nemusí byť nevyhnutne hypertermia priamou príčinou týchto účinkov (Kiyatkin a Sharma 2009). Zaznamenávali sme teplotu telesného jadra u myší liečených mefedrónom a metamfetamínom a pozorovali sme, že kombinovaná liečba nezvýšila teplotu nad maximálny nárast pozorovaný po jednom z týchto liekov samostatne. Metamfetamín spôsobil zvýšenie telesnej teploty v závislosti od dávky a táto hypertermia bola nemenná v celom testovanom rozsahu dávok mefedrónu. V skutočnosti sa pokles telesnej teploty po injekcii pozorovaný po liečbe mefedrónom (Angoa-Perez et al. 2012) zachoval aj pri vyšších dávkach mefedrónu a metamfetamínu. Aj keď hypertermia vyvolaná liekom nebola kombinovanou liečbou liekom zvýšená, neurotoxické účinky boli aditívne. Preto sa aspoň v tomto prípade zdá, že neurotoxické účinky metamfetamínu môžu byť zosilnené mefedrónom spôsobom, ktorý je nezávislý od hypertermie.
Mefedrón jednoznačne inhibuje funkciu DAT a blokuje spätné vychytávanie DA in vitro (Lopez-Arnau et al. 2012, Hadlock et al. 2011, Kehr et al. 2011, Martinez-Clemente et al. 2012, Cozzi et al. 1999). Mefedrón vytláča WIN-35,428 z jeho väzbového miesta na DAT, čo naznačuje, že je kompetitívnym inhibítorom vychytávania DA (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). Účinnosť mefedrónu je v tomto ohľade veľmi podobná účinnosti metamfetamínu (Cozzi et al. 1999) a MDMA (Escubedo et al. 2011). Nie je známe, či je mefedrón transportovaný DAT, ale metkatinón áno (Cozzi a Foley 2003). Nomifenzín a kyselina amfonelová, ktoré sa viažu na DAT a inhibujú vychytávanie DA, poskytujú značnú ochranu pred neurotoxicitou vyvolanou metamfetamínom (Pu a kol. 1994, Marek a kol. 1990, Schmidt a Gibb 1985, Poth a kol. 2012) a myši bez DAT sú rezistentné voči neuronálnej toxicite metamfetamínu (Fumagalli a kol. 1998). Poznanie, že mefedrón nie je neurotoxický a je blokátorom DAT, vedie k predpovedi, že by mal zabrániť toxicite. V tejto súvislosti sme testovali nomifenzín ako pozitívnu kontrolu a potvrdili sme, že chráni pred depléciou DA, DAT a TH vyvolanou metamfetamínom. Nomifenzín tiež inhibuje noradrenalínový transportér (Brogden et al. 1979), ale táto vlastnosť nemôže vysvetliť súčasné výsledky, pretože väčšina β-ketoamfetamínov vrátane mefedrónu inhibuje noradrenalínový transportér a blokuje vychytávanie noradrenalínu (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). Úloha neuronálneho systému 5-HT v niektorých farmakologických účinkoch mefedrónu je možná vzhľadom na schopnosť tejto drogy, podobne ako MDMA (Yamamoto et al. 1995), spôsobovať vyplavovanie striatálneho DA prostredníctvom interakcií s receptormi 5-HT2A (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). Hyperlokomócia spôsobená mefedrónom závisí od endogénneho 5-HT (Lopez-Arnau et al. 2012) a tento liek tiež stimuluje uvoľňovanie 5-HT a inhibuje jeho vychytávanie in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) a in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). Úlohu endogénneho 5-HT v DA neurotoxicite prinajmenšom metamfetamínu však môžeme vylúčiť tým, že sme preukázali, že myši geneticky ochudobnené o 5-HT si zachovávajú citlivosť na neurotoxicitu (Thomas et al. 2010).
Mefedrón by mohol zvýšiť neurotoxicitu metamfetamínu niekoľkými možnými mechanizmami. Po prvé, mefedrón by mohol interagovať s VMAT a spôsobiť únik DA do cytoplazmy presynaptického nervového zakončenia. Liečby, ktoré zvyšujú cytoplazmatický pool (t. j. uvoľniteľný liekom) DA, zvyšujú neurotoxicitu metamfetamínu (Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009, Schmidt et al. 1985). Tento mechanizmus nie je pravdepodobný, pretože metkatinón len slabo interaguje s VMAT (Cozzi et al. 1999). Po druhé, kombinácia mefedrónu a metamfetamínu by mohla mať synergický účinok na nevezikulárne uvoľňovanie DA, ale táto možnosť sa tiež zdá nepravdepodobná vzhľadom na výsledky, ktoré ukazujú, že ošetrenie buniek CHO exprimujúcich DAT alebo SERT metylónom a metamfetamínom nemá aditívny účinok na uvoľňovanie DA alebo 5-HT (Sogawa et al. 2011). Po tretie, mefedrón by mohol interagovať s DAT novým spôsobom, ktorý prispieva k aditívnej toxicite. Ukázalo sa, že metylón v kombinácii s metamfetamínom spôsobuje synergickú cytotoxicitu v bunkách CHO exprimujúcich DAT alebo SERT, ale nie v bunkách CHO divokého typu bez týchto transportérov (Sogawa et al. 2011). Cytotoxicita pozorovaná v kultivovaných bunkách v týchto štúdiách (t. j. uvoľňovanie LDH) je veľmi odlišná od poškodenia DA nervových zakončení spôsobeného metamfetamínom, ale tento mechanizmus naznačuje zaujímavú, ale nedefinovanú úlohu DAT pri zvýšenej cytotoxicite. Napokon, mefedrón by mohol zmeniť metabolizmus metamfetamínu. Mefedrón sa primárne metabolizuje N-demetyláciou (Meyer a Maurer 2010), rovnako ako metamfetamín a MDMA (Caldwell 1976). Podpora tohto mechanizmu vyplýva z preukázania, že metamfetamín a MDMA vzájomne inhibujú tvorbu svojich príslušných primárnych metabolitov a zvyšujú plazmatické hladiny drog nad hodnoty pozorované po podaní jednej z nich samostatne (Kuwayama et al. 2012). Dávky mefedrónu použité v súčasnosti a v našej predchádzajúcej štúdii (Angoa-Perez a kol. 2012) sú síce vysoké, ale nie sú neurotoxické a spadajú do rozsahu, ktorý ľudia zneužívajú (McErath a O'Neill 2011). Preto by mefedrón mohol pôsobiť podobne ako MDMA na zvýšenie plazmatických hladín metamfetamínu inhibíciou jeho metabolizmu. Na potvrdenie tejto druhej možnosti bude potrebná hĺbková farmakokinetická analýza.
Zneužívanie β-ketoamfetamínov narastá alarmujúcim tempom a mefedrón je v súčasnosti po kanabise, MDMA a kokaíne jednou z najčastejšie užívaných drog (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Okrem toho mefedrón vyvoláva u ľudí silnejší pocit túžby v porovnaní s MDMA (Brunt et al. 2011) a užívatelia, ktorí mefedrón šnupú, ho hodnotia ako návykovejší ako kokaín (Winstock et al. 2011b). Mefedrón ľudia konzumujú nárazovo (t. j. "stohovaním") a často ho užívajú spolu s inými drogami, ako je kanabis a amfetamínové psychostimulanciá (Schifano a kol. 2011, Fass a kol. 2012, Winstock a kol. 2011a, Kelly 2011, Torrance a Cooper 2010). Mefedrón sa čoraz častejšie nachádza v tabletách predávaných ako MDMA (Brunt et al. 2011) a jeho užívanie pravdepodobne prekoná užívanie MDMA, keďže čistota tejto druhej drogy stále klesá (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Na základe bežných modelov zneužívania mefedrónu a ďalších zložiek "kúpeľových solí" je dôležité zvážiť, či pri úmyselnej alebo neúmyselnej kombinácii týchto drog s amfetamínmi vznikajú u ľudí ďalšie zdravotné riziká. Naše výsledky, ktoré ukazujú, že prinajmenšom mefedrón výrazne zvyšuje neurotoxicitu DA nervových zakončení striata spôsobenú metamfetamínom, amfetamínom a MDMA, odhaľujú obzvlášť nebezpečnú a neočakávanú vlastnosť tohto β-ketoamfetamínu.
Použité skratky
5-HT serotonín
DA dopamín
DAT DA transportér
MDMA 3,4-metyléndioxymetamfetamín
TH tyrozínhydroxyláza
VMAT vezikulárny monoamínový transportér
