Genetske tehnologije, ki so v človeško življenje prodrle konec prejšnjega stoletja, so naš svet spremenile do te mere, da si ga brez njih že ne moremo predstavljati. Tem tehnologijam je uspelo prodreti tudi v kriminalistiko; genetska identifikacija se že desetletja uporablja kot hitra in razmeroma poceni metoda, ki omogoča iskanje storilcev kaznivih dejanj in razreševanje njihovih dejanj, ne da bi zapustili laboratorij. Ker sem po izobrazbi farmakolog, me genetika zelo zanima in z veseljem preučujem to področje z različnih vidikov. V tej publikaciji vam bom predstavil klasične genetske pristope na področju forenzike.
Malo zgodovine ali kaj ima to opraviti z vitezi?
Pred 150 leti je Johannes Friedrich Miescher odkril nukleinske kisline, koncept, ki je sčasoma obrnil svet na glavo [1]. Sredi 20. stoletja je postalo jasno, da sta DNK in RNK nosilca dedne informacije; nato je bila opisana njuna struktura, malo pozneje pa so se pojavile številne metode, ki so omogočile, da se te molekule "reže" in vitro z uporabo celičnih encimov - restriktaze [2]; pomnožuje s PCR [3]; in celo bere zaporedje določenih genov in genomov z uporabo številnih metod sekvenciranja [4].
Sprva je delo z genskim materialom potekalo dobesedno "v kuhinji" in ga ni bilo mogoče vedno ponoviti niti v sosednjem znanstvenem laboratoriju. Toda čas je tekel, pristopi so se spreminjali in metode so se standardizirale do te mere, da so bile postopoma uvedene v aplikativne raziskave in celo v biotehnološko proizvodnjo.
Leta 1984 je znanstveno skupnost razburkala novica, da je znanstvenikom uspelo izolirati in prebrati fragment DNK zebre Burchell, ki je izumrla in se ohranila le v muzejskih zbirkah [5]. Leto pozneje je švedski genetik Svante Pääbo potrdil možnost uporabe muzejskega in arheološkega gradiva za temeljne znanstvene raziskave, saj je prvi analiziral genetski material egipčanskih mumij. Leta pozneje se je izkazalo, da so bili vzorci, ki jih je analiziral, kontaminirani s sodobnim genetskim materialom [6], vendar je razvoj metod sekvenciranja vseeno omogočil delo tudi z minimalnimi količinami slabo ohranjene DNK.
Nove tehnike analize genetskega materiala so zanimale tudi forenzike. Dejstvo je, da so imele metode klasične daktiloskopije in analize krvnih skupin, ki so bile takrat običajne, svoje omejitve, v nekaterih primerih pa so bile napačne.
Leta 1984 je britanski znanstvenik sir Alec John Jeffreys (slika 3) razvil in predstavil metodo identifikacije osebe z uporabo njenega genetskega materiala. Pozneje se je ta pristop imenoval identifikacija DNK in si pridobil ljubezen in spoštovanje kriminologov po vsem svetu. Jeffreys je za svoje delo prejel viteški naziv.
Malo zgodovine ali kaj ima to opraviti z vitezi?
Pred 150 leti je Johannes Friedrich Miescher odkril nukleinske kisline, koncept, ki je sčasoma obrnil svet na glavo [1]. Sredi 20. stoletja je postalo jasno, da sta DNK in RNK nosilca dedne informacije; nato je bila opisana njuna struktura, malo pozneje pa so se pojavile številne metode, ki so omogočile, da se te molekule "reže" in vitro z uporabo celičnih encimov - restriktaze [2]; pomnožuje s PCR [3]; in celo bere zaporedje določenih genov in genomov z uporabo številnih metod sekvenciranja [4].
Sprva je delo z genskim materialom potekalo dobesedno "v kuhinji" in ga ni bilo mogoče vedno ponoviti niti v sosednjem znanstvenem laboratoriju. Toda čas je tekel, pristopi so se spreminjali in metode so se standardizirale do te mere, da so bile postopoma uvedene v aplikativne raziskave in celo v biotehnološko proizvodnjo.
Leta 1984 je znanstveno skupnost razburkala novica, da je znanstvenikom uspelo izolirati in prebrati fragment DNK zebre Burchell, ki je izumrla in se ohranila le v muzejskih zbirkah [5]. Leto pozneje je švedski genetik Svante Pääbo potrdil možnost uporabe muzejskega in arheološkega gradiva za temeljne znanstvene raziskave, saj je prvi analiziral genetski material egipčanskih mumij. Leta pozneje se je izkazalo, da so bili vzorci, ki jih je analiziral, kontaminirani s sodobnim genetskim materialom [6], vendar je razvoj metod sekvenciranja vseeno omogočil delo tudi z minimalnimi količinami slabo ohranjene DNK.
Nove tehnike analize genetskega materiala so zanimale tudi forenzike. Dejstvo je, da so imele metode klasične daktiloskopije in analize krvnih skupin, ki so bile takrat običajne, svoje omejitve, v nekaterih primerih pa so bile napačne.
Leta 1984 je britanski znanstvenik sir Alec John Jeffreys (slika 3) razvil in predstavil metodo identifikacije osebe z uporabo njenega genetskega materiala. Pozneje se je ta pristop imenoval identifikacija DNK in si pridobil ljubezen in spoštovanje kriminologov po vsem svetu. Jeffreys je za svoje delo prejel viteški naziv.
Daktiloskopija DNK: prednosti in slabosti
Genetska analiza bioloških vzorcev, pridobljenih na krajih kaznivih dejanj, je preiskovalcem močno olajšala delo. Zdaj imajo zanesljivo orodje za identifikacijo storilca ali žrtve, pridobivanje neizpodbitnih dokazov in reševanje kaznivih dejanj.
Glavni prednosti genetske daktiloskopije sta možnost dela tudi z majhnimi količinami biološkega materiala in visoka natančnost, ki omogoča identifikacijo posameznika - če so izpolnjene vse zahteve za analizo, njena zanesljivost presega 99 %. Ta pristop je postal eden najpomembnejših pri preiskovanju kaznivih dejanj [7].
Pomembno je poudariti, da klasične metode daktiloskopije DNK ne omogočajo identifikacije enojajčnih dvojčkov, katerih genetski profil je enak, saj so nastali iz istega oplojenega jajčeca.
Za analizo DNK je najprej potreben sam DnA, vendar iz bioloških vzorcev, ki so bili izpostavljeni kemičnim in termičnim dejavnikom, še zdaleč ni vedno mogoče pridobiti visokokakovostnega genetskega materiala. Ko se ta molekula znajde v okolju, vstopa v kemijske reakcije, se uničuje (fragmentira) in spreminja, čeprav se v ugodnih razmerah lahko ohrani več tisoč let [8].
Znano je, da je bil najstarejši genetski material človeških prednikov pridobljen iz kostnih ostankov naših humanoidnih sorodnikov, ki so živeli na ozemlju Iberskega polotoka (Sierra de Atapuerca) pred približno 430 tisoč leti [9]. Posebna mikroklima nekaterih jam z nizkimi vrednostmi vlage in temperature znatno podaljša življenjsko dobo genskega materiala. Vendar je DNK v vzorcih, ki jih najdemo na kraju kaznivega dejanja, pogosto zastopana v minimalnih količinah in je, tako kot v arheoloških vzorcih, močno degradirana.
V Evropi in Združenih državah Amerike opozarjajo na še eno pomanjkljivost genetskega odvzema prstnih odtisov, ki je povezana s poseganjem v zasebnost osebe in kršenjem zasebnosti.
Zagovornike človekovih pravic skrbi, da bi genetski podatki kriminalcev in osumljenih kaznivih dejanj lahko prišli v roke tretjih oseb in bili nato zlorabljeni [10]. Znani so na primer že primeri uporabe genetskih podatkov za nadzor muslimanskih manjšin v kitajski provinci Xinjiang.
Tudi ZDA načrtujejo sistematično zbiranje profilov DNK priseljencev v zveznem priporu [11]. Očitno je, da strahovi borcev za človekove pravice niso neutemeljeni in imajo realno podlago.
Glavni prednosti genetske daktiloskopije sta možnost dela tudi z majhnimi količinami biološkega materiala in visoka natančnost, ki omogoča identifikacijo posameznika - če so izpolnjene vse zahteve za analizo, njena zanesljivost presega 99 %. Ta pristop je postal eden najpomembnejših pri preiskovanju kaznivih dejanj [7].
Pomembno je poudariti, da klasične metode daktiloskopije DNK ne omogočajo identifikacije enojajčnih dvojčkov, katerih genetski profil je enak, saj so nastali iz istega oplojenega jajčeca.
Za analizo DNK je najprej potreben sam DnA, vendar iz bioloških vzorcev, ki so bili izpostavljeni kemičnim in termičnim dejavnikom, še zdaleč ni vedno mogoče pridobiti visokokakovostnega genetskega materiala. Ko se ta molekula znajde v okolju, vstopa v kemijske reakcije, se uničuje (fragmentira) in spreminja, čeprav se v ugodnih razmerah lahko ohrani več tisoč let [8].
Znano je, da je bil najstarejši genetski material človeških prednikov pridobljen iz kostnih ostankov naših humanoidnih sorodnikov, ki so živeli na ozemlju Iberskega polotoka (Sierra de Atapuerca) pred približno 430 tisoč leti [9]. Posebna mikroklima nekaterih jam z nizkimi vrednostmi vlage in temperature znatno podaljša življenjsko dobo genskega materiala. Vendar je DNK v vzorcih, ki jih najdemo na kraju kaznivega dejanja, pogosto zastopana v minimalnih količinah in je, tako kot v arheoloških vzorcih, močno degradirana.
V Evropi in Združenih državah Amerike opozarjajo na še eno pomanjkljivost genetskega odvzema prstnih odtisov, ki je povezana s poseganjem v zasebnost osebe in kršenjem zasebnosti.
Zagovornike človekovih pravic skrbi, da bi genetski podatki kriminalcev in osumljenih kaznivih dejanj lahko prišli v roke tretjih oseb in bili nato zlorabljeni [10]. Znani so na primer že primeri uporabe genetskih podatkov za nadzor muslimanskih manjšin v kitajski provinci Xinjiang.
Tudi ZDA načrtujejo sistematično zbiranje profilov DNK priseljencev v zveznem priporu [11]. Očitno je, da strahovi borcev za človekove pravice niso neutemeljeni in imajo realno podlago.
Kako deluje
Metode daktiloskopije DNK temeljijo na človeški genetski variabilnosti. Zaradi zamenjav nukleotidov v DNK (glede na pogostost v populaciji jih imenujemo tudi polimorfizmi DNK ali mutacije) se individualno razlikujemo. Te razlike pa lahko najdemo tako v jedrnem kot mitohondrijskem genomu, majhnih krožnih molekulah DNK, ki uravnavajo delovanje mitohondrijev, energetskih "tovarn" celic.
Poudariti je treba, da lahko polimorfizme DNK najdemo v genomu vsakega od nas - postanejo naša edinstvena črtna koda DNK. Nekateri od njih lahko povzročijo resne bolezni [12], v večini primerov pa ne vplivajo na naše življenjske funkcije.
Sodobne metode daktiloskopije DNK uporabljajo različne genetske različice v različnih delih genoma. Analiza tandemskih ponovitev - kratkih ponavljajočih se zaporedij genoma, katerih število se razlikuje pri dveh naključno izbranih posameznikih [13]- naprimer omogoča jasen test očetovstva ali iskanje dodatnih dokazov proti osumljencu kaznivega dejanja.
Z markerji Y-kromosomske DNK je mogoče določiti spol osebe. Genetski označevalci zagotavljajo informacije o etnični pripadnosti posameznikovih sorodnikov, barvi oči ali barvi las.
Poleg tega epigenetske informacije (npr. metilacija DNK) omogočajo oceno biološke starosti posameznih celic, tkiv in organizma kot celote [14]. V tem članku bom podrobneje spregovoril o zgoraj navedenih metodah genetske analize. Uporaba epigenetskih metod pri poslovanju z zdravili pa bo tema moje naslednje publikacije.
Z markerji Y-kromosomske DNK je mogoče določiti spol osebe. Genetski označevalci zagotavljajo informacije o etnični pripadnosti posameznikovih sorodnikov, barvi oči ali barvi las.
Poleg tega epigenetske informacije (npr. metilacija DNK) omogočajo oceno biološke starosti posameznih celic, tkiv in organizma kot celote [14]. V tem članku bom podrobneje spregovoril o zgoraj navedenih metodah genetske analize. Uporaba epigenetskih metod pri poslovanju z zdravili pa bo tema moje naslednje publikacije.
Zbiranje in izolacija DNK iz biološkega materiala
Odvzem in analiza DNK iz forenzičnih vzorcev sta na prvi pogled primerljiva z umetnostjo. Včasih si je nemogoče predstavljati, da lahko nekaj kapljic krvi ali košček kože pod nohti žrtve postane najpomembnejši dokaz v kriminalistični preiskavi.
Dejansko so ukrepi forenzikov na kraju kaznivega dejanja natančno uglašeni in sledijo enotnemu scenariju, katerega eden od glavnih ciljev je najti biološki material, primeren za ekstrakcijo DNK. V ta namen se lahko uporabijo vsa biološka tkiva in človeški izločki .
- kostni ostanki
- Zobje
- lasni mešički
- Kri
- Epitelijske celice
- Znoj
- Slina
- Vzorci sperme
- Izločki itd.
Biomaterial v skladišču dokazov lahko traja več desetletij. Preiskovalec pogosto vzame le del materiala za preiskavo, in sicer toliko, kolikor ga potrebuje za ekstrakcijo DNK. Če so na primer na nožu sledi krvi, izvedenec ne spere vse krvi, ampak naredi manjše izpiranje tik pred ekstrakcijo DNK. Tako na nožu ostanejo sledi, ki jih je mogoče uporabiti za ponovno preiskavo po več desetletjih.
V celičnem jedru je DNK v tesnem stiku s številnimi organskimi molekulami, ki so potrebne za njeno učinkovito delovanje. Za genetsko analizo pa je treba iz testnega vzorca odstraniti ogljikove hidrate, lipide in beljakovine, kar lahko zmanjša učinkovitost uporabljenih metod in posledično vpliva na topnost kaznivih dejanj.Ekstrakcija DNK traja malo časa zaradi različnih komercialnih kompletov in sistemov, posebej zasnovanih za ekstrakcijo nukleinskih kislin (npr. sistem AutoMate Express DNA Extraction System podjetja Thermo Fisher Scientific). Poleg tega je v velikih forenzičnih centrih, ki opravijo na tisoče analiz na dan, ta postopek popolnoma avtomatiziran in poteka s sodelovanjem robotov pod nadzorom operaterja.
Mimogrede, robotski sistemi se pogosto uporabljajo ne le v forenzičnih laboratorijih, temveč tudi v številnih medicinskih in biotehnoloških centrih, kar omogoča pospešitev postopka, zmanjšanje stroškov dela in znatno zmanjšanje možnosti napak.
Po ekstrakciji se DNA raztopi v posebni spojini, kjer jo lahko po potrebi hranimo več let (pri -20 °C ali -80 °C).
Genetska analiza
Takoj po ekstrakciji DnA se strokovnjak sooči z vprašanjem nadaljnjih načinov analize. Tehnike molekularne biologije so se od uvedbe identifikacije DNK v kriminalistiki tako spremenile, da obstaja več možnih različic. V naši nadaljnji zgodbi bomo osvetlili različne tehnike analize DNK, ki jih forenzični strokovnjaki uporabljajo v svoji praksi.
Polimorfizem dolžine restrikcijskih fragmentov (analiza RFLP)
Analiza RFLP je zgodovinsko gledano ena od prvih metod za identifikacijo DNK. Temelji na uporabi posebnih celičnih encimov, restrikcij. Restrikcijski encimi lahko prepoznajo določena mesta na molekuli nukleinske kisline in jo skozi ta mesta prerežejo. Do zdaj je bilo opisanih več tisoč takšnih encimov. Po rezanju molekule DnA z restrikcijskimi encimi se dolžine dobljenih fragmentov ocenijo z gelsko elektroforezo (slika 9).
Takoj po ekstrakciji DnA se strokovnjak sooči z vprašanjem nadaljnjih načinov analize. Tehnike molekularne biologije so se od uvedbe identifikacije DNK v kriminalistiki tako spremenile, da obstaja več možnih različic. V naši nadaljnji zgodbi bomo osvetlili različne tehnike analize DNK, ki jih forenzični strokovnjaki uporabljajo v svoji praksi.
Polimorfizem dolžine restrikcijskih fragmentov (analiza RFLP)
Analiza RFLP je zgodovinsko gledano ena od prvih metod za identifikacijo DNK. Temelji na uporabi posebnih celičnih encimov, restrikcij. Restrikcijski encimi lahko prepoznajo določena mesta na molekuli nukleinske kisline in jo skozi ta mesta prerežejo. Do zdaj je bilo opisanih več tisoč takšnih encimov. Po rezanju molekule DnA z restrikcijskimi encimi se dolžine dobljenih fragmentov ocenijo z gelsko elektroforezo (slika 9).
Ker ni popolnoma enakih človeških genomov (razen pri enojajčnih dvojčkih), je lahko razlika ali podobnost v dobljenih profilih dolžin fragmentov DNA dober označevalec za osebno identifikacijo in določanje sorodstva.
Vendar ta metoda vključuje fragmentacijo DNK, zato je občutljiva na kakovost in količino prvotnega genetskega materiala. Zato se analiza RFLP trenutno praktično ne uporablja - za razliko od drugih metod, ki jih bomo obravnavali v nadaljevanju.
Analiza števila tandemskih ponovitev v genomu
Tandemske ponovitve so kopije istega kratkega zaporedja DnA, ki se ponavljajo druga za drugo [15]. Ponovitve, ki so zanimive za forenzike, vključujejo lokuse z različnim številom tandemskih ponovitev (VNTR) in kratke tandemske ponovitve (STR). Imenujemo jih tudi minisateliti oziroma mikrosateliti.
. Bistvo te metode je pomnoževanje fragmentov DNA, ki vsebujejo ta kratka ponavljajoča se zaporedja, katerih dolžine se pri dveh naključno vzorčenih posameznikih razlikujejo, s PCR. Po amplifikaciji se dolžina dobljenih fragmentov oceni z elektroforezo v gelu ali kapilarno elektroforezo.
V ta namen se lahko uporabljata komplet za kvantifikacijo DNK Quantifiler in sistem QuantStudio podjetja Termo Fisher Scientific. QuantStudio je kompakten namizni instrument s širokim naborom funkcij.
Tako kot pri prejšnji metodi je glavni identifikacijski dejavnik testa STR dolžina pridobljenih fragmentov, ki je edinstvena za vsakega posameznika in je odvisna od števila ponovitev na analiziranem mestu. Za analizo STR je značilna visoka natančnost in hitrost ter nizka cena. Kakovost genskega materiala je pomemben pogoj za analizo.
Vendar ta metoda vključuje fragmentacijo DNK, zato je občutljiva na kakovost in količino prvotnega genetskega materiala. Zato se analiza RFLP trenutno praktično ne uporablja - za razliko od drugih metod, ki jih bomo obravnavali v nadaljevanju.
Analiza števila tandemskih ponovitev v genomu
Tandemske ponovitve so kopije istega kratkega zaporedja DnA, ki se ponavljajo druga za drugo [15]. Ponovitve, ki so zanimive za forenzike, vključujejo lokuse z različnim številom tandemskih ponovitev (VNTR) in kratke tandemske ponovitve (STR). Imenujemo jih tudi minisateliti oziroma mikrosateliti.
. Bistvo te metode je pomnoževanje fragmentov DNA, ki vsebujejo ta kratka ponavljajoča se zaporedja, katerih dolžine se pri dveh naključno vzorčenih posameznikih razlikujejo, s PCR. Po amplifikaciji se dolžina dobljenih fragmentov oceni z elektroforezo v gelu ali kapilarno elektroforezo.
V ta namen se lahko uporabljata komplet za kvantifikacijo DNK Quantifiler in sistem QuantStudio podjetja Termo Fisher Scientific. QuantStudio je kompakten namizni instrument s širokim naborom funkcij.
Tako kot pri prejšnji metodi je glavni identifikacijski dejavnik testa STR dolžina pridobljenih fragmentov, ki je edinstvena za vsakega posameznika in je odvisna od števila ponovitev na analiziranem mestu. Za analizo STR je značilna visoka natančnost in hitrost ter nizka cena. Kakovost genskega materiala je pomemben pogoj za analizo.
Analiza STR se je v praktični forenziki pojavila pred skoraj dvajsetimi leti, vendar še danes ostaja glavna metoda za identifikacijo posameznikov. Rezultate analize DNK osumljencev in storilcev kaznivih dejanj - genetske profile - kriminalisti vnašajo v posebne zbirke podatkov.
Ko se na kraju kaznivega dejanja najdejo biološke sledi, iz katerih je mogoče izolirati DNK, je tako mogoče identificirati vse osebe, ki so že prišle v stik z organi pregona. Isti označevalci se uporabljajo pri iskanju pogrešanih oseb in ugotavljanju očetovstva.
Ko se na kraju kaznivega dejanja najdejo biološke sledi, iz katerih je mogoče izolirati DNK, je tako mogoče identificirati vse osebe, ki so že prišle v stik z organi pregona. Isti označevalci se uporabljajo pri iskanju pogrešanih oseb in ugotavljanju očetovstva.
Sistemi, namenjeni prepoznavanju posameznikov, praviloma omogočajo analizo več genomskih lokusov (10-24) hkrati, vključno z genom za protein amelogenin, po katerem se določa spol. Gen za amelogenin se nahaja tako na kromosomu X kot na kromosomu Y, vendar se razlikuje po velikosti, kar omogoča določitev spola osebe.
Zaradi uporabe visoko zmogljivih tehnologij sekvenciranja je kriminalistika dobila učinkovito orodje, ki je odprlo nove možnosti za hkratno analizo več mest (lokusov) jedrnega in mitohondrijskega genoma.
Pomembna prednost teh metod je možnost razlikovanja celo med enojajčnimi dvojčki (po somatskih mutacijah), kar z analizo RFLP ali STR ni mogoče.
Zaradi uporabe visoko zmogljivih tehnologij sekvenciranja je kriminalistika dobila učinkovito orodje, ki je odprlo nove možnosti za hkratno analizo več mest (lokusov) jedrnega in mitohondrijskega genoma.
Pomembna prednost teh metod je možnost razlikovanja celo med enojajčnimi dvojčki (po somatskih mutacijah), kar z analizo RFLP ali STR ni mogoče.
V drugem delu te publikacije bo opisano, kako je mogoče zgoraj opisane metode uporabiti za identifikacijo laboratorijev za droge in preprodajalcev drog ter kako lahko z odstranjevanjem sledi zmedete kriminaliste.
Preberite drugi del
