Mefedron (4-metilmetkatinon) je β-ketoamfetaminska stimulativna droga za zlorabo, ki je strukturno in mehansko zelo podobna metamfetaminu. Eno najmočnejših učinkov, povezanih z mefedronom, je sposobnost spodbujanja sproščanja dopamina (DA) in blokiranja njegovega ponovnega privzema prek interakcije z dopaminskim transporterjem (DAT). Čeprav mefedron ne povzroča toksičnosti za živčne končiče DA, bi lahko njegova sposobnost delovanja kot blokator DAT zagotovila zaščito pred nevrotoksičnostjo, ki jo povzroča metamfetamin, tako kot drugi zaviralci DAT. Da bi preizkusili to možnost, so miši pred vsakim vbrizganjem nevrotoksičnega metamfetamina (4 vbrizgavanja po 2,5 ali 5,0 mg/kg v razmiku 2 ur) zdravili z mefedronom (10, 20 ali 40 mg/kg). Celovitost živčnih končičev DA v striatumu smo ocenili z merjenjem ravni DA, DAT in tirozin hidroksilaze. Zmerne do hude toksičnosti DA, povezane z različnimi odmerki metamfetamina, ni preprečil noben odmerek mefedrona, temveč se je znatno povečala. Hipertermija, ki jo je povzročilo kombinirano zdravljenje z mefedronom in metamfetaminom, je bila enaka kot pri zdravljenju s posameznim zdravilom. Mefedron je okrepil tudi nevrotoksične učinke amfetamina in MDMA na živčne končiče DA. Nasprotno pa je nomifenzin zaščitil pred nevrotoksičnostjo, ki jo je povzročil metamfetamin. Ker mefedron poveča nevrotoksičnost metamfetamina, pričujoči rezultati kažejo, da z DAT deluje drugače kot drugi značilni zaviralci DAT. Razmeroma neškodljivi učinki samega mefedrona na živčne končiče DA prikrivajo potencialno nevarno interakcijo z zdravili, ki se pogosto uporabljajo skupaj z njim, kar vodi do povečane nevrotoksičnosti.
Mefedron (4-metilmetkatinon) je derivat katinona in strukturni analog metamfetamina in 3,4-metilendioksi-metamfetamina (MDMA). Mefedron je ena od psihoaktivnih sestavin "kopalnih soli" skupaj z drugimi spojinami, kot so metilon, butilon in 3,4-metilendioksipirovaleron (MDPV). β-ketoamfetamini se zlorabljajo vse pogosteje, kar je v veliki meri posledica zelo omejene razpoložljivosti predhodnikov, potrebnih za sintezo metamfetamina in MDMA v tajnih laboratorijih, in ustreznega zmanjšanja njihove čistosti (Winstock et al. 2011b, Brunt et al. 2011). Ker zloraba β-ketoamfetaminov še naprej narašča, se je seznam njihovih škodljivih učinkov povečal in vključuje kardiovaskularne zaplete, agitacijo, nespečnost, psihozo in depresijo (Schifano et al. 2011, Prosser in Nelson 2012).
Ker so kemični sorodniki metamfetamina in MDMA, ni presenetljivo, da imajo β-ketoamfetamini na osrednji živčni sistem veliko enakih učinkov kot ti dve drogi. Te droge na primer blokirajo prenašalce dopamina (DA) in serotonina (5-HT) (DAT oziroma SERT) (Cozzi idr. 1999, Rothman idr. 2003, Fleckenstein idr. 2000, Lopez-Arnau idr. 2012) ter spodbujajo sproščanje monoaminov in vitro (Kalix in Glennon 1986, Gygi idr. 1997, Rothman idr. 2003) in in vivo (Gygi idr. 1997, Kehr idr. 2011). Metkatinon povzroča trajno zmanjšanje aktivnosti triptofan hidroksilaze in tirozin hidroksilaze (TH) ter izčrpavanje DA in 5-HT (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). Študije slikanja PET pri abstinentnih uživalcih metkatinona so pokazale zmanjšano gostoto striatnega DAT, kar kaže na izgubo terminalov DA (McCann et al. 1998). Hkratno spodbujanje sproščanja DA in zaviranje njegovega privzema odražata kritične elemente, na katerih temelji nevrotoksičnost, povezana z metamfetaminom (Kuhn idr. 2008, Yamamoto in Bankson 2005, Cadet idr. 2007, Fleckenstein idr. 2007).
Mi (Angoa-Perez idr. 2012) in drugi (Baumann idr. 2012, Hadlock idr. 2011) smo nedavno preučevali možnost, da bi mefedron lahko povzročil nevrotoksičnost kot metamfetamin in MDMA. Presenetljivo mefedron ni bil toksičen za živčne končiče DA v striatumu (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Vprašanje, ali mefedron poškoduje živčne končiče 5-HT, ostaja nerešeno, saj je ena študija dokumentirala pozitivne učinke (Hadlock et al. 2011), druga pa negativne (Baumann et al. 2012). Glede na razmeroma blagodejen učinek mefedrona na živčne končiče DA in ob upoštevanju njegovih lastnosti kot blokatorja DAT smo domnevali, da bi lahko dejansko zaščitil nevronski sistem DA pred nevrotoksičnimi učinki metamfetamina, podobno kot je znano pri drugih blokatorjih DAT, kot sta amfonilna kislina (Pu et al. 1994, Schmidt in Gibb 1985, Marek et al. 1990) in nomifenzin (Poth et al. 2012). Trenutno poročamo, da mefedron znatno poveča nevrotoksičnost metamfetamina. Ta učinek velja tudi za amfetamin in MDMA, droge, ki se pogosto uporabljajo skupaj z mefedronom (Feyissa in Kelly 2008, Schifano et al. 2011). Ti presenetljivi rezultati postavljajo zlorabo mefedrona v novo luč in dodajajo nujnost prepoznavanja te subtilne in nevarne lastnosti tega β-ketoamfetamina.
Materiali in metode
Droge in reagenti
Mefedronov hidroklorid in 3,4-metilendioksimetamfetamin (MDMA) sta bila pridobljena iz programa za oskrbo z drogami NIDA Research Resources. (+) Metamfetamin hidroklorid, nomifenzin maleat, d-amfetamin sulfat, pentobarbital, DA ter vsi pufri in reagenti za HPLC so bili kupljeni pri podjetju Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ZDA). Kompleti za testiranje beljakovin z bikinchoninsko kislino so bili pridobljeni pri podjetju Pierce (Rockford, IL, ZDA). Poliklonska protitelesa proti podganjemu TH so bila izdelana, kot je bilo že opisano (Kuhn in Billingsley, 1987). Monoklonska protitelesa proti podganjemu DAT je velikodušno zagotovila Dr. Roxanne A. Vaughan (University of North Dakota, Grand Forks, ND, ZDA). Sekundarna protitelesa anti-IgG, konjugirana s HRP, je zagotovilo podjetje Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA, ZDA).
Živali
Samice miši C57BL/6 (Harlan, Indianapolis, IN, ZDA), ki so v času poskusa tehtale 20-25 g, so bile nameščene po 5 na kletko v velikih kletkah v svetlobi (12 ur svetlobe/teme) in temperaturi v prostoru z nadzorovano svetlobo. Uporabili smo samice miši, ker je znano, da so zelo občutljive na poškodbe nevronov zaradi nevrotoksičnih amfetaminov, in da bi ohranili skladnost z našimi prejšnjimi študijami nevrotoksičnosti metamfetamina (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Miši so imele prost dostop do hrane in vode. Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo na univerzi Wayne State University je odobril oskrbo živali in eksperimentalne postopke. Vsi postopki so bili tudi v skladu z Vodnikom NIH za oskrbo in uporabo laboratorijskih živali.
Farmakološki, fiziološki in vedenjski postopki
Miše so bile zdravljene z mefedronom z binge-like režimom, sestavljenim iz 4 injekcij po 10, 20 ali 40 mg/kg z 2-urnim presledkom med posameznimi injekcijami. Ta režim zdravljenja z vbrizgavanjem substituiranih amfetaminov in katinonskih derivatov povzroči obsežne poškodbe živčnih končičev DA. Za zdaj uporabljene odmerke mefedrona se je že prej izkazalo, da niso toksični za živčne končiče DA (Angoa-Perez et al. 2012). Miše so zdravili z metamfetaminom (4X 2,5 ali 5 mg/kg), amfetaminom (4X 5 mg/kg) ali MDMA (4X 20 mg/kg) samostojno ali v kombinaciji z mefedronom. Pri zdravljenju z dvema zdraviloma so miši dobile injekcijo mefedrona 30 minut pred vsako od 4 injekcij metamfetamina, amfetamina ali MDMA. Kontrole so prejele injekcije fiziološke fiziološke raztopine po enakem urniku, kot je bil uporabljen za mefedron sam ali v kombinaciji z drugimi amfetamini. Za kontrolo učinkov zaviralca DAT na toksičnost metamfetamina so miši 30 minut pred vsako injekcijo metamfetamina (4X 5 mg/kg) zdravili z nomifenzinom (4X 5 mg/kg). Vse injekcije so se izvajale po i.p. poti. Miši so bile žrtvovane 2 dni po zadnjem zdravljenju z zdravilom, ko je nevrotoksičnost, povezana z amfetaminom, dosegla najvišjo vrednost. Telesno temperaturo smo spremljali s telemetrijo z uporabo implantiranih temperaturnih transponderjev IPTT-300 podjetja Bio Medic Data Systems, Inc (Seaford, DE, ZDA). Temperaturo smo neinvazivno beležili vsakih 20 minut od 60 minut pred prvo injekcijo METH in nato še 9 ur z uporabo konzolnega sistema DAS-5001 podjetja Bio Medic.
Določanje vsebnosti striatnega DA
Striatno tkivo je bilo po zdravljenju obojestransko izrezano iz možganov in shranjeno pri -80 °C. Zamrznjena tkiva so bila stehtana in sonicirana v 10 volumnih 0,16 N perklorne kisline pri 4 °C. Netopne beljakovine smo odstranili s centrifugiranjem, DA pa smo določili s HPLC z elektrokemično detekcijo, kot je bilo že opisano za metamfetamin (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
Določanje ravni beljakovin TH in DAT z imunoblottingom
Učinke zdravljenja z zdravili na ravni striatnih TH in DAT smo določili z imunoblottingom kot indeksom toksičnosti za striatne živčne končiče DA. Miši so po zdravljenju usmrtili z dekapitacijo, striatum pa so obojestransko razkosali. Tkivo je bilo shranjeno pri -80 °C. Zamrznjeno tkivo smo razdrobili s sonikacijo v 1 % SDS pri 95 °C, netopen material pa smo sedimentirali s centrifugiranjem. Beljakovine smo določili z metodo bikinchoninske kisline, enake količine beljakovin (70 μg/l) pa smo ločili z elektroforezo v SDS-poliakrilamidnem gelu in jih nato elektrolitsko nanesli na nitrocelulozo. Blote smo 1 uro pri sobni temperaturi blokirali v fiziološki raztopini, ki vsebuje Tween 20 (0,1 % v/v) in 5 % nemastnega suhega mleka. Na blote smo dodali primarna protitelesa proti TH (1:1000) ali DAT (1:1000) in jih pustili inkubirati 16 ur pri 4 °C. Blote smo trikrat sprali v fiziološki raztopini, puferirani s trisom, da smo odstranili nereagirana protitelesa, nato pa smo jih 1 h pri sobni temperaturi inkubirali s sekundarnim protitelesom anti-IgG (1:4000), konjugiranim s HRP. Imunoreaktivne pasove smo vizualizirali z okrepljeno kemiluminiscenco, relativno gostoto TH- in DAT-reaktivnih pasov pa smo določili s slikanjem s Kodak Image Station (Carestream Molecular Systems, Rochester, NY, ZDA) in kvantificirali s programsko opremo ImageJ (NIH).
Analiza podatkov
Za analizo učinkov odmerka metamfetamina v primerjavi z mefedronom na DA, DAT in TH so bile izvedene dvosmerne ANOVE. Učinki zdravljenja z zdravili na striatno vsebnost DA, TH in DAT so bili preverjeni za pomembnost z enosmerno ANOVA, ki ji je sledil Tukeyjev test večkratne primerjave. Rezultati zdravljenja z zdravili na temperaturo telesnega jedra v času so bili analizirani z dvosmerno ANOVA, ki ji je sledil Bonferronijev test za ugotavljanje pomembnosti razlik v temperaturi v posameznih časih po zdravljenju. Razlike so se štele za pomembne, če je bil p < 0,05. Vse statistične analize so bile opravljene z uporabo programa GraphPad Prism, različica 5.02 za Windows (GraphPad Software, San Diego, Kalifornija, ZDA, www.graphpad.com).
Pojdi na: "Vključite se v sistem za obdelavo podatkov, ki ga je mogoče uporabiti za obdelavo podatkov:
Rezultati
Učinki mefedrona na nevrotoksičnost, povzročeno z metamfetaminom
Mefedron v odmerkih (10, 20 ali 40 mg/kg), za katere je znano, da ne povzročajo toksičnosti za živčne končiče DA (Angoa-Perez et al. 2012), je bil dan 30 minut pred vsakim vbrizgom metamfetamina. Metamfetamin so dajali v odmerkih, ki povzročajo zmerno (4X 2,5 mg/kg) ali hudo (4X 5 mg/kg) poškodbo živčnih končičev DA v striatumu (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). Rezultati, predstavljeni na sliki 1, kažejo, da sta bila glavna učinka odmerka metamfetamina (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) in odmerka mefedrona (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) na ravni DA v striatumu z dvosmerno ANOVA zelo pomembna. Glavni učinek mefedrona, danega v kombinaciji z 2,5 mg/kg (F4,22 = 35,96, p < 0,001) ali 5,0 mg/kg metamfetamina (F4,17 = 953,9, p < 0,0001), je bil zelo pomemben tudi z enosmerno ANOVA. Vse obravnave s katerim koli odmerkom metamfetamina ± mefedrona so povzročile bistveno večje zmanjšanje DA v primerjavi z ustrezno kontrolo (p < 0,0001 za vse). Slika 1 tudi kaže, da sta odmerka mefedrona 20 (p < 0,01) in 40 mg/kg (p < 0,001) znatno povečala izčrpavajoče učinke metamfetamina 2,5 mg/kg na DA, medtem ko so vsi odmerki mefedrona znatno povečali učinke metamfetamina 5,0 mg/kg na raven DA (p < 0,0001 za vse).
Slika 1
Učinki mefedrona na metamfetaminsko povzročeno zmanjšanje striatnega DA. Miše so 30 minut pred vsakim vbrizganjem 2,5 (-) ali 5,0 mg/kg (■) metamfetamina (METH) zdravili z navedenimi odmerki mefedrona (MEPH) in jih 2d kasneje žrtvovali za določitev striatnih ravni DA s HPLC. Podatki so povprečje ± SEM za 5-7 miši na skupino. Nekatere črte napak so bile premajhne, da bi presegle velikost simbolov, in niso vidne. ***p < 0,001 v primerjavi s kontrolami in #p < 0,01, ##p < 0,001 ali ###p < 0,0001 v primerjavi z ustreznim odmerkom metamfetamina (Tukeyjev test večkratne primerjave).
Slika 2a prikazuje, da je mefedron znatno povečal zmanjšanje ravni DAT, ki ga povzroči metamfetamin, kot je bilo določeno z imunoblottingom. Imunoblote smo kvantificirali in v skladu z rezultati za DA sta bila glavna učinka odmerka metamfetamina (F1,92 = 9,48, p < 0,001) in odmerka mefedrona (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) na ravni DAT v striatumu zelo pomembna z dvosmerno ANOVA (slika 2b). Glavni učinek mefedrona, danega v kombinaciji z 2,5 mg/kg (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) ali 5,0 mg/kg metamfetamina (F4,39 = 24,84, p < 0,0001), je bil zelo pomemben tudi z enosmerno ANOVA. Vse obravnave s katerim koli odmerkom metamfetamina ± mefedrona so povzročile bistveno večje zmanjšanje DAT v primerjavi z ustrezno kontrolo (p < 0,01 za 2,5 mg/kg samega metamfetamina; p < 0,0001 za vse druge obravnave). Slika 2b tudi kaže, da sta odmerka mefedrona 20 mg/kg (p < 0,01) in 40 mg/kg (p < 0,001) znatno povečala zmanjšanje DAT, ki ga je povzročilo 2,5 mg/kg metamfetamina, medtem ko je samo odmerek mefedrona 40 mg/kg znatno povečal (p < 0,01) učinke 5,0 mg/kg metamfetamina na zmanjšanje DAT.
Slika 2
Učinki mefedrona na metamfetaminsko povzročeno zmanjšanje striatnega DAT. Miše so 30 minut pred vsako injekcijo 2,5 (●) ali 5,0 mg/kg (■) metamfetamina (METH) zdravili z navedenimi odmerki mefedrona (MEPH) in jih 2d kasneje žrtvovali za določitev striatnih ravni DAT z imunoblotom (a). Blote smo kvantificirali s programom ImageJ, podatki pa so povprečje ± SEM za 10-12 miši na skupino (b). *p < 0,01 ali ***p < 0,0001 v primerjavi s kontrolo (C) in #p < 0,01 ali ##p < 0,001 v primerjavi z ustreznim odmerkom metamfetamina (Tukeyjev test večkratne primerjave).
Slika 3a kaže, da je mefedron znatno povečal zmanjšanje ravni TH, ki ga povzroči metamfetamin, kot je bilo določeno z imunoblottingom. Imunoblote smo kvantificirali in v skladu z zgornjimi rezultati za DA in DAT sta bila glavna učinka odmerka metamfetamina (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) in odmerka mefedrona (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) zelo pomembna z dvosmerno ANOVA (sl. 3b). Glavni učinek mefedrona, danega v kombinaciji z 2,5 mg/kg (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) ali 5,0 mg/kg metamfetamina (F4,49 = 99,16, p < 0,0001), je bil zelo pomemben tudi z enosmerno ANOVA. Vse obravnave s katerim koli odmerkom metamfetamina ± mefedrona so povzročile bistveno večje zmanjšanje TH v primerjavi z ustrezno kontrolo (p < 0,001 za 2,5 mg/kg metamfetamina + 10 mg/kg mefedrona; p < 0,0001 za vse druge kombinacije), z izjemo 2,5 mg/kg samega metamfetamina, ki ni bistveno spremenil ravni TH (tj. brez toksičnosti). Slika 3b tudi kaže, da sta odmerka mefedrona 20 mg/kg (p < 0,01) in 40 mg/kg (p < 0,001) znatno povečala zmanjšanje TH, ki ga je povzročil metamfetamin 2,5 mg/kg, vsi trije odmerki mefedrona pa so znatno (p < 0,0001) povečali učinke metamfetamina 5,0 mg/kg na zmanjšanje TH.
Slika 3
Učinki mefedrona na metamfetaminsko povzročeno zmanjšanje striatnega TH. Miše so 30 minut pred vsako injekcijo 2,5 (●) ali 5,0 mg/kg (■) metamfetamina (METH) zdravili z navedenimi odmerki mefedrona (MEPH) in jih 2d kasneje žrtvovali za določitev striatnih ravni TH z imunoblottingom (a). Blote smo kvantificirali s programom ImageJ, podatki pa so povprečje ± SEM za 10-12 miši na skupino (b). Nekatere črte napak so bile premajhne, da bi presegle velikost simbolov, in niso vidne. **p < 0,001 ali ***p < 0,0001 v primerjavi s kontrolo (C) in #p < 0,01, ##p < 0,001 ali ###p < 0,0001) v primerjavi z ustreznim odmerkom metamfetamina (Tukeyjev test večkratne primerjave).
Učinki mefedrona na hipertermijo, povzročeno z metamfetaminom
Mefedron tako kot metamfetamin povzroča znatno hipertermijo (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Ko je bil mefedron dan 30 minut pred vsako injekcijo metamfetamina, je na sliki 4 razvidno, da so bili glavni učinki odmerkov metamfetamina in mefedrona (F1,300 = 11,99, p < 0,0001) v času (F4,300 = 51,73, p < 0,0001) z dvosmerno ANOVA zelo pomembni. Glavni učinki mefedrona, danega v kombinaciji z 2,5 mg/kg metamfetamina (F4,120 = 41,44, p < 0,0001, plošča a) skozi čas (F30,120 = 3,84, p < 0,0001) ali 5,0 mg/kg metamfetamina (F4,120 = 78,09, p < 0,0001, plošča b) skozi čas (F30,120 = 9,98, p < 0,0001), so bili prav tako zelo pomembni z dvosmerno ANOVA. Vse obravnave s katerim koli odmerkom metamfetamina ± mefedrona so se pomembno razlikovale od ustreznih kontrol (p < 0,0001 za vse obravnave).
Slika 4
Učinki mefedrona na hipertermijo, povzročeno z metamfetaminom. Miše so 30 minut pred vsako injekcijo 2,5 (a) ali 5,0 mg/kg (b) metamfetamina (METH) zdravili z navedenimi odmerki mefedrona (MEPH). Temperaturo jedra so merili v 20-minutnih intervalih s telemetrijo, ki se je začela 60 minut pred prvo injekcijo metamfetamina. Štiri injekcije metamfetamina so označene s puščicami na osi x. Podatki so izraženi kot povprečna telesna temperatura 6-8 miši na skupino. SEM so bili vedno < 10 % povprečja in so zaradi jasnosti izpuščeni.
Učinki mefedrona na nevrotoksičnost, povzročeno z amfetaminom in MDMA
Da bi preverili, ali je mogoče okrepljene učinke mefedrona na metamfetamin razširiti na druge nevrotoksične amfetamine, so miši zdravili s tem β-ketoamfetaminom (20 mg/kg) ter amfetaminom (4X 5 mg/kg) ali MDMA (4X 20 mg/kg), rezultati pa so predstavljeni na sliki 5. Spomnimo, da sam mefedron ne zmanjšuje striatnega DA, DAT ali TH (Angoa-Perez et al. 2012). Glavni učinek zdravila (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) je bil z enosmerno ANOVA za zmanjšanje DA zelo pomemben (slika 5a). Na sliki 5a je tudi razvidno, da so vsa zdravljenja z amfetaminom (p < 0,001) ali MDMA (p < 0,001) samostojno ali v kombinaciji z mefedronom (p < 0,0001 za obe zdravili) znatno znižala raven DA glede na kontrolo. Mefedron je znatno povečal znižanje DA, ki sta ga povzročila amfetamin (p < 0,01) ali MDMA (p < 0,01). Slika 5b prikazuje podobne učinke kombiniranega zdravljenja z zdravili na ravni DAT v striatumu. Glavni učinek zdravila (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) je bil z enosmerno ANOVA za DAT zelo pomemben. Na sliki 5b je tudi razvidno, da so bile pri vseh obravnavah z amfetaminom ali MDMA v primerjavi s kontrolo znatno (p < 0,0001 za vse) nižje. Mefedron je prav tako pomembno povečal zmanjšanje DAT, ki sta ga povzročila amfetamin ali MDMA (p < 0,0001 v obeh primerih). Nazadnje, slika 5c kaže, da je bil glavni učinek zdravila (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) zelo pomemben z enosmerno ANOVA za zmanjšanja TH. Na sliki 5c je tudi razvidno, da so bila vsa zdravljenja z amfetaminom ali MDMA v primerjavi s kontrolo pomembno (p < 0,0001 za vse) manjša. Mefedron je prav tako pomembno povečal zmanjšanje TH, ki sta ga povzročila amfetamin ali MDMA (p < 0,0001 v obeh primerih).
Slika 5
Učinki mefedrona na nevrotoksičnost živčnih končičev DA, povzročeno z amfetaminom ali MDMA. Miše so 30 minut pred vsako injekcijo 5,0 mg/kg amfetamina (AMPH) ali 20 mg/kg MDMA zdravili z 20 mg/kg mefedrona (MEPH) in jih 2d po zdravljenju usmrtili za določitev striatnih ravni (a) DA s HPLC. (b) DAT in (c) TH sta bila določena z imunoblottingom, bloti pa so bili kvantificirani s programom ImageJ. Reprezentativni imunobloti za DAT in TH so vključeni kot vstavki v plošče (b) oziroma (c), obdelave za obe plošči pa so označene z 1,5: kontrola; 2,6: MEPH; 3: AMPH; 4: AMPH + MEPH; 7: MDMA; in 8: MDMA + MEPH. Podatki so povprečje ± SEM za 5-12 miši v vsaki skupini. **p < 0,001 ali ***p < 0,0001 v primerjavi s kontrolo in #p < 0,01 ali ###p < 0,0001 v primerjavi z AMPH ali MDMA (Tukeyjev test večkratne primerjave).
Učinki nomifenzina na nevrotoksičnost, povzročeno z metamfetaminom
Nomifenzin, močan blokator DAT brez znanega potenciala zlorabe ali nevrotoksičnosti, je bil preizkušen za zaščito pred nevrotoksičnostjo, povzročeno z metamfetaminom, in za kontrast z delovanjem mefedrona na toksičnost živčnih končičev DA, ki jo povzročajo metamfetamin, amfetamin in MDMA. Rezultati na sliki 6a kažejo, da je bil glavni učinek zdravila (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) na ravni DA zelo pomemben z enosmerno ANOVA. Sam nomifenzin ni spremenil ravni DA, vendar je nomifenzin (p < 0,0001) rahlo, vendar pomembno spremenil zmanjšanje, ki ga je povzročil metamfetamin (p < 0,0001). Glavni učinek zdravila (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) na ravni DAT je bil zelo pomemben z enosmerno ANOVA, kot je prikazano na sliki 6b. Nomifenzin ni spremenil ravni DAT, vendar je v primerjavi s kontrolo zagotovil pomembno zaščito (p < 0,001) pred zmanjšanjem striatnega DAT zaradi metamfetamina (p < 0,0001). Nazadnje, slika 6c kaže, da je bil glavni učinek zdravila (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) na ravni TH zelo pomemben z enosmerno ANOVA. Kot smo videli pri DA in DAT, je zmanjšanje TH, ki ga je povzročil metamfetamin (p < 0,0001), nekoliko, vendar pomembno preprečil nomifenzin (p < 0,01).
Slika 6
Učinki nomifenzina na nevrotoksičnost živčnih končičev DA, povzročeno z metamfetaminom. Miše so 30 minut pred vsako injekcijo 5,0 mg/kg metamfetamina (METH) zdravili s 5,0 mg/kg nomifenzina (NOM) in jih 2d kasneje usmrtili za določitev striatnih ravni (a) DA s HPLC. (b) DAT in (c) TH smo določili z imunoblottingom, blote pa smo kvantificirali z uporabo ImageJ. Reprezentativni imunobloti za DAT in TH so vključeni kot vstavki v panelih (b) in (c). Podatki so povprečje plus SEM za 5-7 miši na skupino. ***p < 0,0001 v primerjavi s kontrolo (C) in #p < 0,01 ali ##p < 0,001 v primerjavi s samim metamfetaminom (Tukeyjev test večkratne primerjave).
Razprava
Namen pričujoče študije je bil ugotoviti, ali bi mefedron preprečil toksičnost živčnih končičev DA, ki jo povzroča metamfetamin. Na podlagi kemijske podobnosti z metamfetaminom in MDMA je bilo sprva pričakovati, da bo mefedron škodljivo vplival na nevronski sistem DA. Vendar je več študij skoraj hkrati pokazalo, da mefedron ni toksičen za živčne končiče DA (Angoa-Perez idr. 2012, Baumann idr. 2012, Hadlock idr. 2011). Vprašanje, ali to zdravilo povzroča poškodbe nevronskega sistema 5-HT, ostaja odprto. V eni študiji so poročali o trajnem zmanjšanju delovanja živčnih končičev 5-HT (Hadlock et al. 2011), v drugi pa so ugotovili, da mefedron ne povzroča škode (Baumann et al. 2012). Mefedron sodeluje z živčnim končičem DA na način, ki nakazuje, da prek interakcij z DAT dejansko spodbuja sproščanje in blokira ponovni privzem DA. Ključni vidik nevrotoksičnega mehanizma delovanja metamfetamina je njegova sposobnost, da prek DAT pridobi dostop do živčnih končičev DA in moti homeostazo DA (Sulzer 2011). Če se ta zgodnji korak v nevrotoksični kaskadi metamfetamina prepreči z inhibicijo DAT, se toksičnost prepreči (Pu idr. 1994, Poth idr. 2012, Marek idr. 1990, Schmidt in Gibb 1985). Domnevali smo, da bi mefedron lahko imel enako zaščitno lastnost kot drugi zaviralci DAT, vendar smo namesto tega opazili znatno povečanje toksičnosti. To interakcijo smo opazili z uporabo dveh različnih odmerkov metamfetamina, ki povzročita zmerno ali hudo poškodbo živčnih končičev DA (4X 2,5 oziroma 5,0 mg/kg). Ta ojačevalni učinek mefedrona ni bil omejen na metamfetamin in se je razširil tudi na amfetamin in MDMA, dve drogi, ki se pogosto uporabljata skupaj z mefedronom in drugimi β-ketoamfetamini (Feyissa in Kelly 2008, Schifano idr. 2011, Kelly 2011). Zato kljub temu, da mefedron ne povzroča toksičnosti vsaj za živčne končiče DA v striatumu, potencira nevrotoksične učinke drugih drog zlorabe. Ta nova ugotovitev bi morala zlorabo mefedrona postaviti v še bolj ostre okvirje, saj se zaradi pomanjkanja lastne nevrotoksičnosti lahko zdi neškodljiva.
Hipertermija je pogosto opisan akutni neželeni učinek zaužitja metamfetamina (Greene et al. 2008) in β-ketoamfetamina pri ljudeh (Borek in Holstege 2012, Prosser in Nelson 2012). Podobno kot metamfetamin tudi številne β-ketoamfetaminske droge pri glodavcih povzročajo znatno zvišanje temperature jedra (Angoa-Perez idr. 2012, Hadlock idr. 2011, Baumann idr. 2012, Rockhold idr. 1997). Hipertermija, ki jo povzroča metamfetamin, bi sicer lahko prispevala k njegovim morfološkim in nevronskim škodljivim učinkom, ni pa nujno, da je hipertermija neposredni vzrok teh učinkov (Kiyatkin in Sharma 2009). Pri miših, zdravljenih z mefedronom in metamfetaminom, smo beležili temperaturo jedra telesa in opazili, da kombinirano zdravljenje ni povečalo temperature prek največjega povečanja, ki smo ga opazili po uporabi enega od obeh zdravil. Metamfetamin je povzročil zvišanje telesne temperature, povezano z odmerkom, ta hipertermija pa je bila nespremenljiva v celotnem testiranem območju odmerkov mefedrona. Dejansko se je padec telesne temperature po vbrizganju, opažen po zdravljenju z mefedronom (Angoa-Perez idr. 2012), ohranil pri višjih odmerkih mefedrona in metamfetamina. Čeprav se hipertermija, povzročena z zdravilom, s kombiniranim zdravljenjem z zdravilom ni povečala, so bili nevrotoksični učinki aditivni. Zato se vsaj v tem primeru zdi, da lahko nevrotoksične učinke metamfetamina okrepi mefedron na način, ki je neodvisen od hipertermije.
Mefedron jasno zavira delovanje DAT in blokira ponovni privzem DA in vitro (Lopez-Arnau idr. 2012, Hadlock idr. 2011, Kehr idr. 2011, Martinez-Clemente idr. 2012, Cozzi idr. 1999). Mefedron izpodriva WIN-35,428 z njegovega vezavnega mesta na DAT, kar kaže na to, da je kompetitivni zaviralec privzema DA (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). Moč mefedrona je v tem pogledu zelo podobna moči metamfetamina (Cozzi et al. 1999) in MDMA (Escubedo et al. 2011). Ni znano, ali se mefedron prenaša prek DAT, metkatinon pa se (Cozzi in Foley 2003). Nomifenzin in amfonilna kislina, ki se vežeta na DAT in zavirata privzem DA, zagotavljata precejšnjo zaščito pred nevrotoksičnostjo, povzročeno z metamfetaminom (Pu idr. 1994, Marek idr. 1990, Schmidt in Gibb 1985, Poth idr. 2012), miši brez DAT pa so odporne na nevronsko toksičnost metamfetamina (Fumagalli idr. 1998). Ker vemo, da mefedron ni nevrotoksičen in je blokator DAT, lahko predvidevamo, da bi moral preprečiti toksičnost. V zvezi s tem smo kot pozitivno kontrolo preizkusili nomifenzin in potrdili, da ščiti pred izčrpavanjem DA, DAT in TH, ki ga povzroči metamfetamin. Nomifenzin zavira tudi norepinefrinski transporter (Brogden et al. 1979), vendar s to lastnostjo ni mogoče pojasniti sedanjih rezultatov, saj večina β-ketoamfetaminov, vključno z mefedronom, zavira norepinefrinski transporter in blokira privzem norepinefrina (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). Vloga nevronskega sistema 5-HT pri nekaterih farmakoloških učinkih mefedrona je mogoča glede na sposobnost tega zdravila, da tako kot MDMA (Yamamoto et al. 1995) povzroča iztekanje striatnega DA prek interakcij z receptorji 5-HT2A (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). Hiperlokomocija, ki jo povzroča mefedron, je odvisna od endogenega 5-HT (Lopez-Arnau et al. 2012), to zdravilo pa spodbuja tudi sproščanje 5-HT in zavira njegov privzem in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) in in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). Vendar lahko vlogo endogenega 5-HT pri nevrotoksičnosti DA vsaj metamfetamina izključimo, saj smo dokazali, da miši, ki jim je genetsko osiromašen 5-HT, ohranijo občutljivost na nevrotoksičnost (Thomas et al. 2010).
Mefedron bi lahko okrepil nevrotoksičnost metamfetamina z več možnimi mehanizmi. Prvič, mefedron bi lahko sodeloval z VMAT in povzročil uhajanje DA v citoplazmo presinaptičnega živčnega končiča. Zdravila, ki povečajo citoplazemski bazen (tj. sproščanja DA iz zdravila), povečajo nevrotoksičnost metamfetamina (Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009, Schmidt et al. 1985). Ta mehanizem je malo verjeten, saj metkatinon le šibko sodeluje z VMAT (Cozzi et al. 1999). Drugič, kombinacija mefedrona in metamfetamina bi lahko imela sinergistični učinek na nevezikularno sproščanje DA, vendar se tudi ta možnost zdi malo verjetna glede na rezultate, ki kažejo, da zdravljenje celic CHO, ki izražajo DAT ali SERT, z mefedronom in metamfetaminom nima aditivnega učinka na sproščanje DA ali 5-HT (Sogawa et al. 2011). Tretjič, mefedron bi lahko z DAT sodeloval na nov način, ki prispeva k aditivni toksičnosti. Pokazalo se je, da metilen v kombinaciji z metamfetaminom povzroča sinergično citotoksičnost v celicah CHO, ki izražajo DAT ali SERT, ne pa tudi v celicah CHO divjega tipa brez prenašalcev (Sogawa et al. 2011). Citotoksičnost, opažena v gojenih celicah v teh študijah (tj. sproščanje LDH), se zelo razlikuje od poškodb živčnih končičev DA, ki jih povzroča metamfetamin, vendar ta mehanizem kaže na zanimivo, vendar nedoločeno vlogo DAT pri povečani citotoksičnosti. Nazadnje, mefedron bi lahko spremenil presnovo metamfetamina. Mefedron se primarno presnavlja z N-demetilacijo (Meyer in Maurer 2010), tako kot metamfetamin in MDMA (Caldwell 1976). Podporo temu mehanizmu daje dokaz, da metamfetamin in MDMA vzajemno zavirata nastajanje svojih primarnih presnovkov in zvišujeta plazemske ravni zdravil nad tiste, ki jih opazimo po dajanju enega samega zdravila (Kuwayama et al. 2012). Odmerki mefedrona, uporabljeni zdaj in v naši prejšnji študiji (Angoa-Perez et al. 2012), so sicer visoki, vendar niso nevrotoksični in spadajo v območje, ki ga zlorabljajo ljudje (McErath in O'Neill 2011). Zato bi lahko mefedron deloval podobno kot MDMA in z zaviranjem presnove metamfetamina povečal njegovo raven v plazmi. Za potrditev slednje možnosti bo potrebna poglobljena farmakokinetična analiza.
Zloraba β-ketoamfetaminov se zaskrbljujoče povečuje in mefedron je zdaj ena najpogosteje uporabljenih drog, takoj za konopljo, MDMA in kokainom (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Poleg tega mefedron pri ljudeh v primerjavi z MDMA povzroča močnejše občutke hrepenenja (Brunt et al. 2011), uporabniki, ki mefedron smrkajo, pa ga ocenjujejo kot bolj zasvojljivega od kokaina (Winstock et al. 2011b). Mefedron ljudje uživajo na način, podoben popivanju (tj. "zlaganju"), in ga pogosto jemljejo skupaj z drugimi drogami, kot so konoplja in amfetaminski psihostimulansi (Schifano idr. 2011, Fass idr. 2012, Winstock idr. 2011a, Kelly 2011, Torrance in Cooper 2010). Mefedron se vse pogosteje pojavlja v tabletah, ki se prodajajo kot MDMA (Brunt et al. 2011), njegova uporaba pa bo verjetno presegla uporabo MDMA, saj čistost te droge še naprej pada (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Na podlagi pogostih vzorcev zlorabe mefedrona in drugih sestavin "kopalnih soli" je pomembno razmisliti, ali se pri ljudeh pojavijo dodatna tveganja za zdravje, kadar se te droge namerno ali nenamerno kombinirajo z amfetamini. Naši rezultati, ki kažejo, da vsaj mefedron znatno poveča nevrotoksičnost živčnih končičev DA v striatumu, ki jo povzročajo metamfetamin, amfetamin in MDMA, razkrivajo posebno nevarno in nepričakovano lastnost tega β-ketoamfetamina.
Uporabljene kratice
5-HT serotonin
DA dopamin
DAT DA transporter
MDMA 3,4-metilendioksimetamfetamin
TH tirozin hidroksilaza
VMAT vezikularni monoaminski transporter
Mefedron (4-metilmetkatinon) je derivat katinona in strukturni analog metamfetamina in 3,4-metilendioksi-metamfetamina (MDMA). Mefedron je ena od psihoaktivnih sestavin "kopalnih soli" skupaj z drugimi spojinami, kot so metilon, butilon in 3,4-metilendioksipirovaleron (MDPV). β-ketoamfetamini se zlorabljajo vse pogosteje, kar je v veliki meri posledica zelo omejene razpoložljivosti predhodnikov, potrebnih za sintezo metamfetamina in MDMA v tajnih laboratorijih, in ustreznega zmanjšanja njihove čistosti (Winstock et al. 2011b, Brunt et al. 2011). Ker zloraba β-ketoamfetaminov še naprej narašča, se je seznam njihovih škodljivih učinkov povečal in vključuje kardiovaskularne zaplete, agitacijo, nespečnost, psihozo in depresijo (Schifano et al. 2011, Prosser in Nelson 2012).
Ker so kemični sorodniki metamfetamina in MDMA, ni presenetljivo, da imajo β-ketoamfetamini na osrednji živčni sistem veliko enakih učinkov kot ti dve drogi. Te droge na primer blokirajo prenašalce dopamina (DA) in serotonina (5-HT) (DAT oziroma SERT) (Cozzi idr. 1999, Rothman idr. 2003, Fleckenstein idr. 2000, Lopez-Arnau idr. 2012) ter spodbujajo sproščanje monoaminov in vitro (Kalix in Glennon 1986, Gygi idr. 1997, Rothman idr. 2003) in in vivo (Gygi idr. 1997, Kehr idr. 2011). Metkatinon povzroča trajno zmanjšanje aktivnosti triptofan hidroksilaze in tirozin hidroksilaze (TH) ter izčrpavanje DA in 5-HT (Gygi et al. 1997, Gygi et al. 1996, Sparago et al. 1996). Študije slikanja PET pri abstinentnih uživalcih metkatinona so pokazale zmanjšano gostoto striatnega DAT, kar kaže na izgubo terminalov DA (McCann et al. 1998). Hkratno spodbujanje sproščanja DA in zaviranje njegovega privzema odražata kritične elemente, na katerih temelji nevrotoksičnost, povezana z metamfetaminom (Kuhn idr. 2008, Yamamoto in Bankson 2005, Cadet idr. 2007, Fleckenstein idr. 2007).
Mi (Angoa-Perez idr. 2012) in drugi (Baumann idr. 2012, Hadlock idr. 2011) smo nedavno preučevali možnost, da bi mefedron lahko povzročil nevrotoksičnost kot metamfetamin in MDMA. Presenetljivo mefedron ni bil toksičen za živčne končiče DA v striatumu (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Vprašanje, ali mefedron poškoduje živčne končiče 5-HT, ostaja nerešeno, saj je ena študija dokumentirala pozitivne učinke (Hadlock et al. 2011), druga pa negativne (Baumann et al. 2012). Glede na razmeroma blagodejen učinek mefedrona na živčne končiče DA in ob upoštevanju njegovih lastnosti kot blokatorja DAT smo domnevali, da bi lahko dejansko zaščitil nevronski sistem DA pred nevrotoksičnimi učinki metamfetamina, podobno kot je znano pri drugih blokatorjih DAT, kot sta amfonilna kislina (Pu et al. 1994, Schmidt in Gibb 1985, Marek et al. 1990) in nomifenzin (Poth et al. 2012). Trenutno poročamo, da mefedron znatno poveča nevrotoksičnost metamfetamina. Ta učinek velja tudi za amfetamin in MDMA, droge, ki se pogosto uporabljajo skupaj z mefedronom (Feyissa in Kelly 2008, Schifano et al. 2011). Ti presenetljivi rezultati postavljajo zlorabo mefedrona v novo luč in dodajajo nujnost prepoznavanja te subtilne in nevarne lastnosti tega β-ketoamfetamina.
Materiali in metode
Droge in reagenti
Mefedronov hidroklorid in 3,4-metilendioksimetamfetamin (MDMA) sta bila pridobljena iz programa za oskrbo z drogami NIDA Research Resources. (+) Metamfetamin hidroklorid, nomifenzin maleat, d-amfetamin sulfat, pentobarbital, DA ter vsi pufri in reagenti za HPLC so bili kupljeni pri podjetju Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ZDA). Kompleti za testiranje beljakovin z bikinchoninsko kislino so bili pridobljeni pri podjetju Pierce (Rockford, IL, ZDA). Poliklonska protitelesa proti podganjemu TH so bila izdelana, kot je bilo že opisano (Kuhn in Billingsley, 1987). Monoklonska protitelesa proti podganjemu DAT je velikodušno zagotovila Dr. Roxanne A. Vaughan (University of North Dakota, Grand Forks, ND, ZDA). Sekundarna protitelesa anti-IgG, konjugirana s HRP, je zagotovilo podjetje Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA, ZDA).
Živali
Samice miši C57BL/6 (Harlan, Indianapolis, IN, ZDA), ki so v času poskusa tehtale 20-25 g, so bile nameščene po 5 na kletko v velikih kletkah v svetlobi (12 ur svetlobe/teme) in temperaturi v prostoru z nadzorovano svetlobo. Uporabili smo samice miši, ker je znano, da so zelo občutljive na poškodbe nevronov zaradi nevrotoksičnih amfetaminov, in da bi ohranili skladnost z našimi prejšnjimi študijami nevrotoksičnosti metamfetamina (Thomas et al. 2010, Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009). Miši so imele prost dostop do hrane in vode. Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo na univerzi Wayne State University je odobril oskrbo živali in eksperimentalne postopke. Vsi postopki so bili tudi v skladu z Vodnikom NIH za oskrbo in uporabo laboratorijskih živali.
Farmakološki, fiziološki in vedenjski postopki
Miše so bile zdravljene z mefedronom z binge-like režimom, sestavljenim iz 4 injekcij po 10, 20 ali 40 mg/kg z 2-urnim presledkom med posameznimi injekcijami. Ta režim zdravljenja z vbrizgavanjem substituiranih amfetaminov in katinonskih derivatov povzroči obsežne poškodbe živčnih končičev DA. Za zdaj uporabljene odmerke mefedrona se je že prej izkazalo, da niso toksični za živčne končiče DA (Angoa-Perez et al. 2012). Miše so zdravili z metamfetaminom (4X 2,5 ali 5 mg/kg), amfetaminom (4X 5 mg/kg) ali MDMA (4X 20 mg/kg) samostojno ali v kombinaciji z mefedronom. Pri zdravljenju z dvema zdraviloma so miši dobile injekcijo mefedrona 30 minut pred vsako od 4 injekcij metamfetamina, amfetamina ali MDMA. Kontrole so prejele injekcije fiziološke fiziološke raztopine po enakem urniku, kot je bil uporabljen za mefedron sam ali v kombinaciji z drugimi amfetamini. Za kontrolo učinkov zaviralca DAT na toksičnost metamfetamina so miši 30 minut pred vsako injekcijo metamfetamina (4X 5 mg/kg) zdravili z nomifenzinom (4X 5 mg/kg). Vse injekcije so se izvajale po i.p. poti. Miši so bile žrtvovane 2 dni po zadnjem zdravljenju z zdravilom, ko je nevrotoksičnost, povezana z amfetaminom, dosegla najvišjo vrednost. Telesno temperaturo smo spremljali s telemetrijo z uporabo implantiranih temperaturnih transponderjev IPTT-300 podjetja Bio Medic Data Systems, Inc (Seaford, DE, ZDA). Temperaturo smo neinvazivno beležili vsakih 20 minut od 60 minut pred prvo injekcijo METH in nato še 9 ur z uporabo konzolnega sistema DAS-5001 podjetja Bio Medic.
Določanje vsebnosti striatnega DA
Striatno tkivo je bilo po zdravljenju obojestransko izrezano iz možganov in shranjeno pri -80 °C. Zamrznjena tkiva so bila stehtana in sonicirana v 10 volumnih 0,16 N perklorne kisline pri 4 °C. Netopne beljakovine smo odstranili s centrifugiranjem, DA pa smo določili s HPLC z elektrokemično detekcijo, kot je bilo že opisano za metamfetamin (Thomas et al. 2010, Thomas et al, 2009).
Določanje ravni beljakovin TH in DAT z imunoblottingom
Učinke zdravljenja z zdravili na ravni striatnih TH in DAT smo določili z imunoblottingom kot indeksom toksičnosti za striatne živčne končiče DA. Miši so po zdravljenju usmrtili z dekapitacijo, striatum pa so obojestransko razkosali. Tkivo je bilo shranjeno pri -80 °C. Zamrznjeno tkivo smo razdrobili s sonikacijo v 1 % SDS pri 95 °C, netopen material pa smo sedimentirali s centrifugiranjem. Beljakovine smo določili z metodo bikinchoninske kisline, enake količine beljakovin (70 μg/l) pa smo ločili z elektroforezo v SDS-poliakrilamidnem gelu in jih nato elektrolitsko nanesli na nitrocelulozo. Blote smo 1 uro pri sobni temperaturi blokirali v fiziološki raztopini, ki vsebuje Tween 20 (0,1 % v/v) in 5 % nemastnega suhega mleka. Na blote smo dodali primarna protitelesa proti TH (1:1000) ali DAT (1:1000) in jih pustili inkubirati 16 ur pri 4 °C. Blote smo trikrat sprali v fiziološki raztopini, puferirani s trisom, da smo odstranili nereagirana protitelesa, nato pa smo jih 1 h pri sobni temperaturi inkubirali s sekundarnim protitelesom anti-IgG (1:4000), konjugiranim s HRP. Imunoreaktivne pasove smo vizualizirali z okrepljeno kemiluminiscenco, relativno gostoto TH- in DAT-reaktivnih pasov pa smo določili s slikanjem s Kodak Image Station (Carestream Molecular Systems, Rochester, NY, ZDA) in kvantificirali s programsko opremo ImageJ (NIH).
Analiza podatkov
Za analizo učinkov odmerka metamfetamina v primerjavi z mefedronom na DA, DAT in TH so bile izvedene dvosmerne ANOVE. Učinki zdravljenja z zdravili na striatno vsebnost DA, TH in DAT so bili preverjeni za pomembnost z enosmerno ANOVA, ki ji je sledil Tukeyjev test večkratne primerjave. Rezultati zdravljenja z zdravili na temperaturo telesnega jedra v času so bili analizirani z dvosmerno ANOVA, ki ji je sledil Bonferronijev test za ugotavljanje pomembnosti razlik v temperaturi v posameznih časih po zdravljenju. Razlike so se štele za pomembne, če je bil p < 0,05. Vse statistične analize so bile opravljene z uporabo programa GraphPad Prism, različica 5.02 za Windows (GraphPad Software, San Diego, Kalifornija, ZDA, www.graphpad.com).
Pojdi na: "Vključite se v sistem za obdelavo podatkov, ki ga je mogoče uporabiti za obdelavo podatkov:
Rezultati
Učinki mefedrona na nevrotoksičnost, povzročeno z metamfetaminom
Mefedron v odmerkih (10, 20 ali 40 mg/kg), za katere je znano, da ne povzročajo toksičnosti za živčne končiče DA (Angoa-Perez et al. 2012), je bil dan 30 minut pred vsakim vbrizgom metamfetamina. Metamfetamin so dajali v odmerkih, ki povzročajo zmerno (4X 2,5 mg/kg) ali hudo (4X 5 mg/kg) poškodbo živčnih končičev DA v striatumu (Thomas et al. 2004, Thomas et al. 2010). Rezultati, predstavljeni na sliki 1, kažejo, da sta bila glavna učinka odmerka metamfetamina (F1,40 = 66,60, p < 0,0001) in odmerka mefedrona (F4,40 = 131,3, p < 0,0001) na ravni DA v striatumu z dvosmerno ANOVA zelo pomembna. Glavni učinek mefedrona, danega v kombinaciji z 2,5 mg/kg (F4,22 = 35,96, p < 0,001) ali 5,0 mg/kg metamfetamina (F4,17 = 953,9, p < 0,0001), je bil zelo pomemben tudi z enosmerno ANOVA. Vse obravnave s katerim koli odmerkom metamfetamina ± mefedrona so povzročile bistveno večje zmanjšanje DA v primerjavi z ustrezno kontrolo (p < 0,0001 za vse). Slika 1 tudi kaže, da sta odmerka mefedrona 20 (p < 0,01) in 40 mg/kg (p < 0,001) znatno povečala izčrpavajoče učinke metamfetamina 2,5 mg/kg na DA, medtem ko so vsi odmerki mefedrona znatno povečali učinke metamfetamina 5,0 mg/kg na raven DA (p < 0,0001 za vse).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/sywobkqrnd-jpg.47/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Slika 1
Učinki mefedrona na metamfetaminsko povzročeno zmanjšanje striatnega DA. Miše so 30 minut pred vsakim vbrizganjem 2,5 (-) ali 5,0 mg/kg (■) metamfetamina (METH) zdravili z navedenimi odmerki mefedrona (MEPH) in jih 2d kasneje žrtvovali za določitev striatnih ravni DA s HPLC. Podatki so povprečje ± SEM za 5-7 miši na skupino. Nekatere črte napak so bile premajhne, da bi presegle velikost simbolov, in niso vidne. ***p < 0,001 v primerjavi s kontrolami in #p < 0,01, ##p < 0,001 ali ###p < 0,0001 v primerjavi z ustreznim odmerkom metamfetamina (Tukeyjev test večkratne primerjave).
Slika 2a prikazuje, da je mefedron znatno povečal zmanjšanje ravni DAT, ki ga povzroči metamfetamin, kot je bilo določeno z imunoblottingom. Imunoblote smo kvantificirali in v skladu z rezultati za DA sta bila glavna učinka odmerka metamfetamina (F1,92 = 9,48, p < 0,001) in odmerka mefedrona (F4,92 = 37,56, p < 0,0001) na ravni DAT v striatumu zelo pomembna z dvosmerno ANOVA (slika 2b). Glavni učinek mefedrona, danega v kombinaciji z 2,5 mg/kg (F4,56 = 15,55, p < 0,0001) ali 5,0 mg/kg metamfetamina (F4,39 = 24,84, p < 0,0001), je bil zelo pomemben tudi z enosmerno ANOVA. Vse obravnave s katerim koli odmerkom metamfetamina ± mefedrona so povzročile bistveno večje zmanjšanje DAT v primerjavi z ustrezno kontrolo (p < 0,01 za 2,5 mg/kg samega metamfetamina; p < 0,0001 za vse druge obravnave). Slika 2b tudi kaže, da sta odmerka mefedrona 20 mg/kg (p < 0,01) in 40 mg/kg (p < 0,001) znatno povečala zmanjšanje DAT, ki ga je povzročilo 2,5 mg/kg metamfetamina, medtem ko je samo odmerek mefedrona 40 mg/kg znatno povečal (p < 0,01) učinke 5,0 mg/kg metamfetamina na zmanjšanje DAT.
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/bfu3sx5dnr-jpg.4797/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Slika 2
Učinki mefedrona na metamfetaminsko povzročeno zmanjšanje striatnega DAT. Miše so 30 minut pred vsako injekcijo 2,5 (●) ali 5,0 mg/kg (■) metamfetamina (METH) zdravili z navedenimi odmerki mefedrona (MEPH) in jih 2d kasneje žrtvovali za določitev striatnih ravni DAT z imunoblotom (a). Blote smo kvantificirali s programom ImageJ, podatki pa so povprečje ± SEM za 10-12 miši na skupino (b). *p < 0,01 ali ***p < 0,0001 v primerjavi s kontrolo (C) in #p < 0,01 ali ##p < 0,001 v primerjavi z ustreznim odmerkom metamfetamina (Tukeyjev test večkratne primerjave).
Slika 3a kaže, da je mefedron znatno povečal zmanjšanje ravni TH, ki ga povzroči metamfetamin, kot je bilo določeno z imunoblottingom. Imunoblote smo kvantificirali in v skladu z zgornjimi rezultati za DA in DAT sta bila glavna učinka odmerka metamfetamina (F1,81 = 47,89, p < 0,0001) in odmerka mefedrona (F4,81 = 63,57, p < 0,0001) zelo pomembna z dvosmerno ANOVA (sl. 3b). Glavni učinek mefedrona, danega v kombinaciji z 2,5 mg/kg (F4,34 = 12,98, p < 0,0001) ali 5,0 mg/kg metamfetamina (F4,49 = 99,16, p < 0,0001), je bil zelo pomemben tudi z enosmerno ANOVA. Vse obravnave s katerim koli odmerkom metamfetamina ± mefedrona so povzročile bistveno večje zmanjšanje TH v primerjavi z ustrezno kontrolo (p < 0,001 za 2,5 mg/kg metamfetamina + 10 mg/kg mefedrona; p < 0,0001 za vse druge kombinacije), z izjemo 2,5 mg/kg samega metamfetamina, ki ni bistveno spremenil ravni TH (tj. brez toksičnosti). Slika 3b tudi kaže, da sta odmerka mefedrona 20 mg/kg (p < 0,01) in 40 mg/kg (p < 0,001) znatno povečala zmanjšanje TH, ki ga je povzročil metamfetamin 2,5 mg/kg, vsi trije odmerki mefedrona pa so znatno (p < 0,0001) povečali učinke metamfetamina 5,0 mg/kg na zmanjšanje TH.
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/tggfrjpqru-jpg.4798/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Slika 3
Učinki mefedrona na metamfetaminsko povzročeno zmanjšanje striatnega TH. Miše so 30 minut pred vsako injekcijo 2,5 (●) ali 5,0 mg/kg (■) metamfetamina (METH) zdravili z navedenimi odmerki mefedrona (MEPH) in jih 2d kasneje žrtvovali za določitev striatnih ravni TH z imunoblottingom (a). Blote smo kvantificirali s programom ImageJ, podatki pa so povprečje ± SEM za 10-12 miši na skupino (b). Nekatere črte napak so bile premajhne, da bi presegle velikost simbolov, in niso vidne. **p < 0,001 ali ***p < 0,0001 v primerjavi s kontrolo (C) in #p < 0,01, ##p < 0,001 ali ###p < 0,0001) v primerjavi z ustreznim odmerkom metamfetamina (Tukeyjev test večkratne primerjave).
Učinki mefedrona na hipertermijo, povzročeno z metamfetaminom
Mefedron tako kot metamfetamin povzroča znatno hipertermijo (Hadlock et al. 2011, Baumann et al. 2012, Angoa-Perez et al. 2012). Ko je bil mefedron dan 30 minut pred vsako injekcijo metamfetamina, je na sliki 4 razvidno, da so bili glavni učinki odmerkov metamfetamina in mefedrona (F1,300 = 11,99, p < 0,0001) v času (F4,300 = 51,73, p < 0,0001) z dvosmerno ANOVA zelo pomembni. Glavni učinki mefedrona, danega v kombinaciji z 2,5 mg/kg metamfetamina (F4,120 = 41,44, p < 0,0001, plošča a) skozi čas (F30,120 = 3,84, p < 0,0001) ali 5,0 mg/kg metamfetamina (F4,120 = 78,09, p < 0,0001, plošča b) skozi čas (F30,120 = 9,98, p < 0,0001), so bili prav tako zelo pomembni z dvosmerno ANOVA. Vse obravnave s katerim koli odmerkom metamfetamina ± mefedrona so se pomembno razlikovale od ustreznih kontrol (p < 0,0001 za vse obravnave).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/x0ik9hdwsw-jpg.4799/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Slika 4
Učinki mefedrona na hipertermijo, povzročeno z metamfetaminom. Miše so 30 minut pred vsako injekcijo 2,5 (a) ali 5,0 mg/kg (b) metamfetamina (METH) zdravili z navedenimi odmerki mefedrona (MEPH). Temperaturo jedra so merili v 20-minutnih intervalih s telemetrijo, ki se je začela 60 minut pred prvo injekcijo metamfetamina. Štiri injekcije metamfetamina so označene s puščicami na osi x. Podatki so izraženi kot povprečna telesna temperatura 6-8 miši na skupino. SEM so bili vedno < 10 % povprečja in so zaradi jasnosti izpuščeni.
Učinki mefedrona na nevrotoksičnost, povzročeno z amfetaminom in MDMA
Da bi preverili, ali je mogoče okrepljene učinke mefedrona na metamfetamin razširiti na druge nevrotoksične amfetamine, so miši zdravili s tem β-ketoamfetaminom (20 mg/kg) ter amfetaminom (4X 5 mg/kg) ali MDMA (4X 20 mg/kg), rezultati pa so predstavljeni na sliki 5. Spomnimo, da sam mefedron ne zmanjšuje striatnega DA, DAT ali TH (Angoa-Perez et al. 2012). Glavni učinek zdravila (F5,27 = 27,18, p < 0,0001) je bil z enosmerno ANOVA za zmanjšanje DA zelo pomemben (slika 5a). Na sliki 5a je tudi razvidno, da so vsa zdravljenja z amfetaminom (p < 0,001) ali MDMA (p < 0,001) samostojno ali v kombinaciji z mefedronom (p < 0,0001 za obe zdravili) znatno znižala raven DA glede na kontrolo. Mefedron je znatno povečal znižanje DA, ki sta ga povzročila amfetamin (p < 0,01) ali MDMA (p < 0,01). Slika 5b prikazuje podobne učinke kombiniranega zdravljenja z zdravili na ravni DAT v striatumu. Glavni učinek zdravila (F4,49 = 42,63, p < 0,0001) je bil z enosmerno ANOVA za DAT zelo pomemben. Na sliki 5b je tudi razvidno, da so bile pri vseh obravnavah z amfetaminom ali MDMA v primerjavi s kontrolo znatno (p < 0,0001 za vse) nižje. Mefedron je prav tako pomembno povečal zmanjšanje DAT, ki sta ga povzročila amfetamin ali MDMA (p < 0,0001 v obeh primerih). Nazadnje, slika 5c kaže, da je bil glavni učinek zdravila (F4,50 = 75,06, p < 0,0001) zelo pomemben z enosmerno ANOVA za zmanjšanja TH. Na sliki 5c je tudi razvidno, da so bila vsa zdravljenja z amfetaminom ali MDMA v primerjavi s kontrolo pomembno (p < 0,0001 za vse) manjša. Mefedron je prav tako pomembno povečal zmanjšanje TH, ki sta ga povzročila amfetamin ali MDMA (p < 0,0001 v obeh primerih).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/onvypkgxvn-jpg.4800/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Slika 5
Učinki mefedrona na nevrotoksičnost živčnih končičev DA, povzročeno z amfetaminom ali MDMA. Miše so 30 minut pred vsako injekcijo 5,0 mg/kg amfetamina (AMPH) ali 20 mg/kg MDMA zdravili z 20 mg/kg mefedrona (MEPH) in jih 2d po zdravljenju usmrtili za določitev striatnih ravni (a) DA s HPLC. (b) DAT in (c) TH sta bila določena z imunoblottingom, bloti pa so bili kvantificirani s programom ImageJ. Reprezentativni imunobloti za DAT in TH so vključeni kot vstavki v plošče (b) oziroma (c), obdelave za obe plošči pa so označene z 1,5: kontrola; 2,6: MEPH; 3: AMPH; 4: AMPH + MEPH; 7: MDMA; in 8: MDMA + MEPH. Podatki so povprečje ± SEM za 5-12 miši v vsaki skupini. **p < 0,001 ali ***p < 0,0001 v primerjavi s kontrolo in #p < 0,01 ali ###p < 0,0001 v primerjavi z AMPH ali MDMA (Tukeyjev test večkratne primerjave).
Učinki nomifenzina na nevrotoksičnost, povzročeno z metamfetaminom
Nomifenzin, močan blokator DAT brez znanega potenciala zlorabe ali nevrotoksičnosti, je bil preizkušen za zaščito pred nevrotoksičnostjo, povzročeno z metamfetaminom, in za kontrast z delovanjem mefedrona na toksičnost živčnih končičev DA, ki jo povzročajo metamfetamin, amfetamin in MDMA. Rezultati na sliki 6a kažejo, da je bil glavni učinek zdravila (F3,16 = 63,39, p < 0,0001) na ravni DA zelo pomemben z enosmerno ANOVA. Sam nomifenzin ni spremenil ravni DA, vendar je nomifenzin (p < 0,0001) rahlo, vendar pomembno spremenil zmanjšanje, ki ga je povzročil metamfetamin (p < 0,0001). Glavni učinek zdravila (F3,20 = 16,78, p < 0,0001) na ravni DAT je bil zelo pomemben z enosmerno ANOVA, kot je prikazano na sliki 6b. Nomifenzin ni spremenil ravni DAT, vendar je v primerjavi s kontrolo zagotovil pomembno zaščito (p < 0,001) pred zmanjšanjem striatnega DAT zaradi metamfetamina (p < 0,0001). Nazadnje, slika 6c kaže, da je bil glavni učinek zdravila (F3,15 = 14,10, p < 0,0001) na ravni TH zelo pomemben z enosmerno ANOVA. Kot smo videli pri DA in DAT, je zmanjšanje TH, ki ga je povzročil metamfetamin (p < 0,0001), nekoliko, vendar pomembno preprečil nomifenzin (p < 0,01).
http://bbzzzsvqcrqtki6umym6itiixfhni37ybtt7mkbjyxn2pgllzxf2qgyd.onion/index.php?attachments/daczg9cwfv-jpg.4801/&hash=f31155ada4e59f22a35f9110aaa6a7e5
Slika 6
Učinki nomifenzina na nevrotoksičnost živčnih končičev DA, povzročeno z metamfetaminom. Miše so 30 minut pred vsako injekcijo 5,0 mg/kg metamfetamina (METH) zdravili s 5,0 mg/kg nomifenzina (NOM) in jih 2d kasneje usmrtili za določitev striatnih ravni (a) DA s HPLC. (b) DAT in (c) TH smo določili z imunoblottingom, blote pa smo kvantificirali z uporabo ImageJ. Reprezentativni imunobloti za DAT in TH so vključeni kot vstavki v panelih (b) in (c). Podatki so povprečje plus SEM za 5-7 miši na skupino. ***p < 0,0001 v primerjavi s kontrolo (C) in #p < 0,01 ali ##p < 0,001 v primerjavi s samim metamfetaminom (Tukeyjev test večkratne primerjave).
Razprava
Namen pričujoče študije je bil ugotoviti, ali bi mefedron preprečil toksičnost živčnih končičev DA, ki jo povzroča metamfetamin. Na podlagi kemijske podobnosti z metamfetaminom in MDMA je bilo sprva pričakovati, da bo mefedron škodljivo vplival na nevronski sistem DA. Vendar je več študij skoraj hkrati pokazalo, da mefedron ni toksičen za živčne končiče DA (Angoa-Perez idr. 2012, Baumann idr. 2012, Hadlock idr. 2011). Vprašanje, ali to zdravilo povzroča poškodbe nevronskega sistema 5-HT, ostaja odprto. V eni študiji so poročali o trajnem zmanjšanju delovanja živčnih končičev 5-HT (Hadlock et al. 2011), v drugi pa so ugotovili, da mefedron ne povzroča škode (Baumann et al. 2012). Mefedron sodeluje z živčnim končičem DA na način, ki nakazuje, da prek interakcij z DAT dejansko spodbuja sproščanje in blokira ponovni privzem DA. Ključni vidik nevrotoksičnega mehanizma delovanja metamfetamina je njegova sposobnost, da prek DAT pridobi dostop do živčnih končičev DA in moti homeostazo DA (Sulzer 2011). Če se ta zgodnji korak v nevrotoksični kaskadi metamfetamina prepreči z inhibicijo DAT, se toksičnost prepreči (Pu idr. 1994, Poth idr. 2012, Marek idr. 1990, Schmidt in Gibb 1985). Domnevali smo, da bi mefedron lahko imel enako zaščitno lastnost kot drugi zaviralci DAT, vendar smo namesto tega opazili znatno povečanje toksičnosti. To interakcijo smo opazili z uporabo dveh različnih odmerkov metamfetamina, ki povzročita zmerno ali hudo poškodbo živčnih končičev DA (4X 2,5 oziroma 5,0 mg/kg). Ta ojačevalni učinek mefedrona ni bil omejen na metamfetamin in se je razširil tudi na amfetamin in MDMA, dve drogi, ki se pogosto uporabljata skupaj z mefedronom in drugimi β-ketoamfetamini (Feyissa in Kelly 2008, Schifano idr. 2011, Kelly 2011). Zato kljub temu, da mefedron ne povzroča toksičnosti vsaj za živčne končiče DA v striatumu, potencira nevrotoksične učinke drugih drog zlorabe. Ta nova ugotovitev bi morala zlorabo mefedrona postaviti v še bolj ostre okvirje, saj se zaradi pomanjkanja lastne nevrotoksičnosti lahko zdi neškodljiva.
Hipertermija je pogosto opisan akutni neželeni učinek zaužitja metamfetamina (Greene et al. 2008) in β-ketoamfetamina pri ljudeh (Borek in Holstege 2012, Prosser in Nelson 2012). Podobno kot metamfetamin tudi številne β-ketoamfetaminske droge pri glodavcih povzročajo znatno zvišanje temperature jedra (Angoa-Perez idr. 2012, Hadlock idr. 2011, Baumann idr. 2012, Rockhold idr. 1997). Hipertermija, ki jo povzroča metamfetamin, bi sicer lahko prispevala k njegovim morfološkim in nevronskim škodljivim učinkom, ni pa nujno, da je hipertermija neposredni vzrok teh učinkov (Kiyatkin in Sharma 2009). Pri miših, zdravljenih z mefedronom in metamfetaminom, smo beležili temperaturo jedra telesa in opazili, da kombinirano zdravljenje ni povečalo temperature prek največjega povečanja, ki smo ga opazili po uporabi enega od obeh zdravil. Metamfetamin je povzročil zvišanje telesne temperature, povezano z odmerkom, ta hipertermija pa je bila nespremenljiva v celotnem testiranem območju odmerkov mefedrona. Dejansko se je padec telesne temperature po vbrizganju, opažen po zdravljenju z mefedronom (Angoa-Perez idr. 2012), ohranil pri višjih odmerkih mefedrona in metamfetamina. Čeprav se hipertermija, povzročena z zdravilom, s kombiniranim zdravljenjem z zdravilom ni povečala, so bili nevrotoksični učinki aditivni. Zato se vsaj v tem primeru zdi, da lahko nevrotoksične učinke metamfetamina okrepi mefedron na način, ki je neodvisen od hipertermije.
Mefedron jasno zavira delovanje DAT in blokira ponovni privzem DA in vitro (Lopez-Arnau idr. 2012, Hadlock idr. 2011, Kehr idr. 2011, Martinez-Clemente idr. 2012, Cozzi idr. 1999). Mefedron izpodriva WIN-35,428 z njegovega vezavnega mesta na DAT, kar kaže na to, da je kompetitivni zaviralec privzema DA (Martinez-Clemente et al. 2012, Lopez-Arnau et al. 2012). Moč mefedrona je v tem pogledu zelo podobna moči metamfetamina (Cozzi et al. 1999) in MDMA (Escubedo et al. 2011). Ni znano, ali se mefedron prenaša prek DAT, metkatinon pa se (Cozzi in Foley 2003). Nomifenzin in amfonilna kislina, ki se vežeta na DAT in zavirata privzem DA, zagotavljata precejšnjo zaščito pred nevrotoksičnostjo, povzročeno z metamfetaminom (Pu idr. 1994, Marek idr. 1990, Schmidt in Gibb 1985, Poth idr. 2012), miši brez DAT pa so odporne na nevronsko toksičnost metamfetamina (Fumagalli idr. 1998). Ker vemo, da mefedron ni nevrotoksičen in je blokator DAT, lahko predvidevamo, da bi moral preprečiti toksičnost. V zvezi s tem smo kot pozitivno kontrolo preizkusili nomifenzin in potrdili, da ščiti pred izčrpavanjem DA, DAT in TH, ki ga povzroči metamfetamin. Nomifenzin zavira tudi norepinefrinski transporter (Brogden et al. 1979), vendar s to lastnostjo ni mogoče pojasniti sedanjih rezultatov, saj večina β-ketoamfetaminov, vključno z mefedronom, zavira norepinefrinski transporter in blokira privzem norepinefrina (Kelly 2011, Rothman et al. 2003, Cozzi et al. 1999, Sogawa et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012). Vloga nevronskega sistema 5-HT pri nekaterih farmakoloških učinkih mefedrona je mogoča glede na sposobnost tega zdravila, da tako kot MDMA (Yamamoto et al. 1995) povzroča iztekanje striatnega DA prek interakcij z receptorji 5-HT2A (Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012). Hiperlokomocija, ki jo povzroča mefedron, je odvisna od endogenega 5-HT (Lopez-Arnau et al. 2012), to zdravilo pa spodbuja tudi sproščanje 5-HT in zavira njegov privzem in vitro (Sogawa et al. 2011, Cozzi et al. 1999, Nagai et al. 2007, Hadlock et al. 2011, Lopez-Arnau et al. 2012, Martinez-Clemente et al. 2012) in in vivo (Baumann et al. 2012, Kehr et al. 2011). Vendar lahko vlogo endogenega 5-HT pri nevrotoksičnosti DA vsaj metamfetamina izključimo, saj smo dokazali, da miši, ki jim je genetsko osiromašen 5-HT, ohranijo občutljivost na nevrotoksičnost (Thomas et al. 2010).
Mefedron bi lahko okrepil nevrotoksičnost metamfetamina z več možnimi mehanizmi. Prvič, mefedron bi lahko sodeloval z VMAT in povzročil uhajanje DA v citoplazmo presinaptičnega živčnega končiča. Zdravila, ki povečajo citoplazemski bazen (tj. sproščanja DA iz zdravila), povečajo nevrotoksičnost metamfetamina (Thomas et al. 2008, Thomas et al. 2009, Schmidt et al. 1985). Ta mehanizem je malo verjeten, saj metkatinon le šibko sodeluje z VMAT (Cozzi et al. 1999). Drugič, kombinacija mefedrona in metamfetamina bi lahko imela sinergistični učinek na nevezikularno sproščanje DA, vendar se tudi ta možnost zdi malo verjetna glede na rezultate, ki kažejo, da zdravljenje celic CHO, ki izražajo DAT ali SERT, z mefedronom in metamfetaminom nima aditivnega učinka na sproščanje DA ali 5-HT (Sogawa et al. 2011). Tretjič, mefedron bi lahko z DAT sodeloval na nov način, ki prispeva k aditivni toksičnosti. Pokazalo se je, da metilen v kombinaciji z metamfetaminom povzroča sinergično citotoksičnost v celicah CHO, ki izražajo DAT ali SERT, ne pa tudi v celicah CHO divjega tipa brez prenašalcev (Sogawa et al. 2011). Citotoksičnost, opažena v gojenih celicah v teh študijah (tj. sproščanje LDH), se zelo razlikuje od poškodb živčnih končičev DA, ki jih povzroča metamfetamin, vendar ta mehanizem kaže na zanimivo, vendar nedoločeno vlogo DAT pri povečani citotoksičnosti. Nazadnje, mefedron bi lahko spremenil presnovo metamfetamina. Mefedron se primarno presnavlja z N-demetilacijo (Meyer in Maurer 2010), tako kot metamfetamin in MDMA (Caldwell 1976). Podporo temu mehanizmu daje dokaz, da metamfetamin in MDMA vzajemno zavirata nastajanje svojih primarnih presnovkov in zvišujeta plazemske ravni zdravil nad tiste, ki jih opazimo po dajanju enega samega zdravila (Kuwayama et al. 2012). Odmerki mefedrona, uporabljeni zdaj in v naši prejšnji študiji (Angoa-Perez et al. 2012), so sicer visoki, vendar niso nevrotoksični in spadajo v območje, ki ga zlorabljajo ljudje (McErath in O'Neill 2011). Zato bi lahko mefedron deloval podobno kot MDMA in z zaviranjem presnove metamfetamina povečal njegovo raven v plazmi. Za potrditev slednje možnosti bo potrebna poglobljena farmakokinetična analiza.
Zloraba β-ketoamfetaminov se zaskrbljujoče povečuje in mefedron je zdaj ena najpogosteje uporabljenih drog, takoj za konopljo, MDMA in kokainom (Morris 2010, Winstock et al. 2011b). Poleg tega mefedron pri ljudeh v primerjavi z MDMA povzroča močnejše občutke hrepenenja (Brunt et al. 2011), uporabniki, ki mefedron smrkajo, pa ga ocenjujejo kot bolj zasvojljivega od kokaina (Winstock et al. 2011b). Mefedron ljudje uživajo na način, podoben popivanju (tj. "zlaganju"), in ga pogosto jemljejo skupaj z drugimi drogami, kot so konoplja in amfetaminski psihostimulansi (Schifano idr. 2011, Fass idr. 2012, Winstock idr. 2011a, Kelly 2011, Torrance in Cooper 2010). Mefedron se vse pogosteje pojavlja v tabletah, ki se prodajajo kot MDMA (Brunt et al. 2011), njegova uporaba pa bo verjetno presegla uporabo MDMA, saj čistost te droge še naprej pada (Brunt et al. 2011, Tanner-Smith 2006, Teng et al. 2006). Na podlagi pogostih vzorcev zlorabe mefedrona in drugih sestavin "kopalnih soli" je pomembno razmisliti, ali se pri ljudeh pojavijo dodatna tveganja za zdravje, kadar se te droge namerno ali nenamerno kombinirajo z amfetamini. Naši rezultati, ki kažejo, da vsaj mefedron znatno poveča nevrotoksičnost živčnih končičev DA v striatumu, ki jo povzročajo metamfetamin, amfetamin in MDMA, razkrivajo posebno nevarno in nepričakovano lastnost tega β-ketoamfetamina.
Uporabljene kratice
5-HT serotonin
DA dopamin
DAT DA transporter
MDMA 3,4-metilendioksimetamfetamin
TH tirozin hidroksilaza
VMAT vezikularni monoaminski transporter
