Gentekniken, som gjorde sitt intåg i människans liv i slutet av förra seklet, har förändrat vår värld så till den grad att den redan är otänkbar utan den. Dessa tekniker har också lyckats tränga in i kriminaltekniken; i årtionden har genetisk identifiering använts som en snabb och relativt billig metod som gör det möjligt att hitta brottslingar och lösa deras gärningar utan att lämna laboratoriet. Som utbildad farmakolog är jag mycket intresserad av genetik och är angelägen om att studera detta område i dess olika aspekter. I den här publikationen kommer jag att presentera klassiska genetiska metoder inom kriminaltekniken.
Lite historia eller vad har det med riddare att göra?
För 150 år sedan upptäckte Johannes Friedrich Miescher nukleinsyror, ett begrepp som så småningom vände upp och ner på världen [1]. I mitten av 1900-talet stod det klart att DNA och RNA var bärare av ärftlig information; sedan beskrevs deras struktur och lite senare dök många metoder upp som gjorde det möjligt att "klippa" dessa molekyler in vitro med hjälp av cellulära enzymer - restrictaser [2]; amplifiera dem med PCR [3]; och till och med läsa sekvensen av specifika gener och genom med hjälp av flera sekvenseringsmetoder [4].
Inledningsvis utfördes arbetet med genetiskt material bokstavligen "i köket" och kunde inte alltid reproduceras ens i det närliggande vetenskapliga laboratoriet. Men tiden gick, tillvägagångssätten förändrades och metoderna standardiserades i sådan utsträckning att de gradvis infördes i tillämpad forskning och till och med i bioteknisk produktion.
1984 upprördes forskarsamhället av nyheten att forskare lyckats isolera och avläsa ett DNA-fragment från Burchell-zebran, som är utdöd och endast finns kvar i museisamlingar [5]. Ett år senare bekräftade den svenske genetikern Svante Pääbo möjligheten att använda musei- och arkeologiskt material för grundläggande vetenskaplig forskning, efter att först ha analyserat det genetiska materialet i egyptiska mumier. Flera år senare visade det sig att de prover han analyserat var kontaminerade med modernt genetiskt material [6], men utvecklingen av sekvenseringsmetoder gjorde det ändå möjligt att arbeta med även minimala mängder dåligt bevarat DNA.
Även rättsmedicinare var intresserade av de nya teknikerna för analys av genetiskt material. Faktum är att metoderna med klassisk daktyloskopi och blodgruppsanalys, som var vanliga vid den här tiden, hade sina begränsningar och i vissa fall misslyckades de.
1984 utvecklade och presenterade den brittiske forskaren Sir Alec John Jeffreys (figur 3) en metod för att identifiera en person med hjälp av dennes genetiska material. Denna metod kom senare att kallas DNA-identifiering och vann kärlek och respekt hos kriminologer över hela världen. Jeffreys adlades för sitt arbete.
Lite historia eller vad har det med riddare att göra?
För 150 år sedan upptäckte Johannes Friedrich Miescher nukleinsyror, ett begrepp som så småningom vände upp och ner på världen [1]. I mitten av 1900-talet stod det klart att DNA och RNA var bärare av ärftlig information; sedan beskrevs deras struktur och lite senare dök många metoder upp som gjorde det möjligt att "klippa" dessa molekyler in vitro med hjälp av cellulära enzymer - restrictaser [2]; amplifiera dem med PCR [3]; och till och med läsa sekvensen av specifika gener och genom med hjälp av flera sekvenseringsmetoder [4].
Inledningsvis utfördes arbetet med genetiskt material bokstavligen "i köket" och kunde inte alltid reproduceras ens i det närliggande vetenskapliga laboratoriet. Men tiden gick, tillvägagångssätten förändrades och metoderna standardiserades i sådan utsträckning att de gradvis infördes i tillämpad forskning och till och med i bioteknisk produktion.
1984 upprördes forskarsamhället av nyheten att forskare lyckats isolera och avläsa ett DNA-fragment från Burchell-zebran, som är utdöd och endast finns kvar i museisamlingar [5]. Ett år senare bekräftade den svenske genetikern Svante Pääbo möjligheten att använda musei- och arkeologiskt material för grundläggande vetenskaplig forskning, efter att först ha analyserat det genetiska materialet i egyptiska mumier. Flera år senare visade det sig att de prover han analyserat var kontaminerade med modernt genetiskt material [6], men utvecklingen av sekvenseringsmetoder gjorde det ändå möjligt att arbeta med även minimala mängder dåligt bevarat DNA.
Även rättsmedicinare var intresserade av de nya teknikerna för analys av genetiskt material. Faktum är att metoderna med klassisk daktyloskopi och blodgruppsanalys, som var vanliga vid den här tiden, hade sina begränsningar och i vissa fall misslyckades de.
1984 utvecklade och presenterade den brittiske forskaren Sir Alec John Jeffreys (figur 3) en metod för att identifiera en person med hjälp av dennes genetiska material. Denna metod kom senare att kallas DNA-identifiering och vann kärlek och respekt hos kriminologer över hela världen. Jeffreys adlades för sitt arbete.
DNA-daktyloskopi: fördelar och nackdelar
Genetisk analys av biologiska prover från brottsplatser har i hög grad förenklat utredarnas arbete. De har nu ett tillförlitligt verktyg för att identifiera gärningsmannen eller offret, få fram obestridliga bevis och lösa brott.
De främsta fördelarna med genetiskt fingeravtryck är förmågan att arbeta även med små mängder biologiskt material och den höga noggrannheten som möjliggör identifiering av en individ - om alla krav för analys är uppfyllda överstiger tillförlitligheten 99%. Detta tillvägagångssätt har blivit ett av de viktigaste i utredningen av brott [7].
Det är viktigt att notera att klassiska DNA-daktyloskopimetoder inte gör det möjligt att identifiera enäggstvillingar vars genetiska profil är densamma, eftersom de bildas från samma befruktade ägg.
För DNA-analys behövs först och främst DnA i sig, men det är långt ifrån alltid möjligt att extrahera genetiskt material av hög kvalitet från biologiska prover som har utsatts för kemiska och termiska faktorer. Väl i miljön ingår denna molekyl i kemiska reaktioner, förstörs (fragmenteras) och modifieras, även om den under gynnsamma förhållanden kan bestå i tusentals år [8].
Det är känt att det äldsta genetiska materialet från mänskliga förfäder extraherades från benresterna av våra humanoida släktingar som levde på den iberiska halvön (Sierra de Atapuerca) för cirka 430 tusen år sedan [9]. Det specifika mikroklimatet i vissa grottor med låg luftfuktighet och temperaturvärden ökar avsevärt det genetiska materialets livslängd. DNA i prover som hittas på brottsplatsen förekommer dock ofta i minimala mängder och är, precis som i arkeologiska prover, kraftigt nedbrutet.
I Europa och USA uppmärksammas en annan nackdel med genetiska fingeravtryck, nämligen intrång i och kränkning av den personliga integriteten.
Människorättsaktivister befarar att brottslingars och brottsmisstänktas genetiska information kan hamna i händerna på tredje part och sedan missbrukas [10]. Det finns t.ex. redan kända fall där genetisk information använts för att kontrollera muslimska minoriteter i den kinesiska provinsen Xinjiang.
I USA planerar man också att systematiskt samla in DNA-profiler från invandrare i federalt förvar [11]. Det är uppenbart att människorättsaktivisternas farhågor inte är obefogade och att de har verklig grund.
De främsta fördelarna med genetiskt fingeravtryck är förmågan att arbeta även med små mängder biologiskt material och den höga noggrannheten som möjliggör identifiering av en individ - om alla krav för analys är uppfyllda överstiger tillförlitligheten 99%. Detta tillvägagångssätt har blivit ett av de viktigaste i utredningen av brott [7].
Det är viktigt att notera att klassiska DNA-daktyloskopimetoder inte gör det möjligt att identifiera enäggstvillingar vars genetiska profil är densamma, eftersom de bildas från samma befruktade ägg.
För DNA-analys behövs först och främst DnA i sig, men det är långt ifrån alltid möjligt att extrahera genetiskt material av hög kvalitet från biologiska prover som har utsatts för kemiska och termiska faktorer. Väl i miljön ingår denna molekyl i kemiska reaktioner, förstörs (fragmenteras) och modifieras, även om den under gynnsamma förhållanden kan bestå i tusentals år [8].
Det är känt att det äldsta genetiska materialet från mänskliga förfäder extraherades från benresterna av våra humanoida släktingar som levde på den iberiska halvön (Sierra de Atapuerca) för cirka 430 tusen år sedan [9]. Det specifika mikroklimatet i vissa grottor med låg luftfuktighet och temperaturvärden ökar avsevärt det genetiska materialets livslängd. DNA i prover som hittas på brottsplatsen förekommer dock ofta i minimala mängder och är, precis som i arkeologiska prover, kraftigt nedbrutet.
I Europa och USA uppmärksammas en annan nackdel med genetiska fingeravtryck, nämligen intrång i och kränkning av den personliga integriteten.
Människorättsaktivister befarar att brottslingars och brottsmisstänktas genetiska information kan hamna i händerna på tredje part och sedan missbrukas [10]. Det finns t.ex. redan kända fall där genetisk information använts för att kontrollera muslimska minoriteter i den kinesiska provinsen Xinjiang.
I USA planerar man också att systematiskt samla in DNA-profiler från invandrare i federalt förvar [11]. Det är uppenbart att människorättsaktivisternas farhågor inte är obefogade och att de har verklig grund.
Så här fungerar det
DNA-daktyloskopimetoder baseras på mänsklig genetisk variabilitet. Nukleotidsubstitutioner i DNA (beroende på frekvensen i befolkningen kallas de också DNA-polymorfismer eller mutationer) gör oss individuellt olika. Och dessa skillnader finns i både kärn- och mitokondriegenom, små cirkulära DNA-molekyler som reglerar mitokondriernas funktion, cellernas "energifabriker".
Det bör noteras att DNA-polymorfismer kan hittas i genomet hos var och en av oss - de blir vår unika DNA-streckkod. Vissa av dem kan orsaka allvarliga sjukdomar [12], men i de flesta fall har de ingen effekt på våra vitala funktioner.
Moderna DNA-daktyloskopimetoder använder en mängd olika genetiska varianter i olika regioner av genomet. Genom att analysera tandemrepetitioner - korta repetitiva genomsekvenser vars antal skiljer sig åt mellan två slumpmässigt utvalda individer [13] - kan man t.ex. göra ett tydligt faderskapstest eller hitta ytterligare bevis mot en misstänkt brottsling.
Y-kromosomala DNA-markörer kan användas för att bestämma en persons kön. Genetiska markörer ger information om en individs släktingars etniska tillhörighet, ögonfärg eller hårfärg.
Dessutom gör epigenetisk information (t.ex. DNA-metylering) det möjligt att uppskatta den biologiska åldern för enskilda celler, vävnader och organismen som helhet [14]. I den här artikeln kommer jag att prata mer om ovanstående metoder för genetisk analys. Och användningen av epigenetiska metoder inom läkemedelsbranschen kommer att vara ämnet för min nästa publikation.
Y-kromosomala DNA-markörer kan användas för att bestämma en persons kön. Genetiska markörer ger information om en individs släktingars etniska tillhörighet, ögonfärg eller hårfärg.
Dessutom gör epigenetisk information (t.ex. DNA-metylering) det möjligt att uppskatta den biologiska åldern för enskilda celler, vävnader och organismen som helhet [14]. I den här artikeln kommer jag att prata mer om ovanstående metoder för genetisk analys. Och användningen av epigenetiska metoder inom läkemedelsbranschen kommer att vara ämnet för min nästa publikation.
Insamling och isolering av DNA från biologiskt material
DNA-extraktion och analys från rättsmedicinska prover är vid första anblicken jämförbart med konst. Ibland är det omöjligt att föreställa sig att några droppar blod eller en bit hud under ett offers naglar kan bli det viktigaste beviset i en brottsutredning.
I själva verket är de åtgärder som kriminaltekniker vid brottsplatser vidtar finjusterade och följer ett enda scenario, där ett av huvudmålen är att hitta biologiskt material som lämpar sig för DNA-extraktion. Alla biologiska vävnader och mänskliga utsöndringar kan användas för detta ändamål .
- Benrester
- tänder
- Hårfolliklar
- blod
- Epiteliala celler
- Svett
- Saliv
- Spermaprov
- Exkrementer, etc.
Biomaterial i bevislagret kan hålla i årtionden. Ofta tar undersökaren bara en del av materialet för undersökning, så mycket som han behöver för DNA-extraktion. Om det t.ex. finns blodspår på kniven tvättar experten inte bort allt blod, utan gör en liten sköljning strax före DNA-extraktionen. På så sätt lämnas spår på kniven som kan användas för att göra en ny undersökning flera decennier senare.
I cellkärnan är DNA i nära kontakt med många organiska molekyler som är nödvändiga för att det ska fungera effektivt. För genetisk analys måste dock kolhydrater, lipider och proteiner avlägsnas från provet, vilket kan minska effektiviteten hos de metoder som används och därmed påverka uppklarandet av brott.DNA-extraktion tar kort tid tack vare en mängd kommersiella kit och system som är särskilt utformade för nukleinsyraextraktion (t.ex. AutoMate Express DNA Extraction System från Thermo Fisher Scientific). I stora rättsmedicinska centra med tusentals analyser per dag är denna process dessutom helt automatiserad och utförs med hjälp av robotar under överinseende av en operatör.
Robotsystem används för övrigt inte bara i rättsmedicinska laboratorier utan också i många medicinska och biotekniska centra, vilket gör det möjligt att påskynda processen, minska arbetskostnaderna och avsevärt minska risken för fel.
Efter extraktionen löses DNA:t upp i en speciell förening, där det vid behov kan förvaras i flera år (vid -20 °C eller -80 °C).
Genetisk analys
Omedelbart efter extraktionen av DNA ställs en specialist inför frågan om ytterligare sätt att analysera det. Sedan DNA-identifiering började användas inom kriminaltekniken har de molekylärbiologiska teknikerna förändrats så mycket att det finns flera möjliga varianter. Vår ytterligare berättelse kommer att belysa de olika teknikerna för DNA-analys som kriminaltekniska experter använder i sin praxis.
Polymorfism av restriktionsfragmentlängd (RFLP-analys)
RFLP-analys är historiskt sett en av de första metoderna för DNA-identifiering. Den baseras på användningen av speciella cellulära enzymer, restriktaser. Restriktionsenzymer kan känna igen vissa ställen på en nukleinsyramolekyl och klippa den genom dessa ställen. Flera tusen sådana enzymer har hittills beskrivits. Efter att ha klippt DnA-molekylen med restriktionsenzymer utvärderas längden på de erhållna fragmenten med hjälp av gelelektrofores (figur 9).
Omedelbart efter extraktionen av DNA ställs en specialist inför frågan om ytterligare sätt att analysera det. Sedan DNA-identifiering började användas inom kriminaltekniken har de molekylärbiologiska teknikerna förändrats så mycket att det finns flera möjliga varianter. Vår ytterligare berättelse kommer att belysa de olika teknikerna för DNA-analys som kriminaltekniska experter använder i sin praxis.
Polymorfism av restriktionsfragmentlängd (RFLP-analys)
RFLP-analys är historiskt sett en av de första metoderna för DNA-identifiering. Den baseras på användningen av speciella cellulära enzymer, restriktaser. Restriktionsenzymer kan känna igen vissa ställen på en nukleinsyramolekyl och klippa den genom dessa ställen. Flera tusen sådana enzymer har hittills beskrivits. Efter att ha klippt DnA-molekylen med restriktionsenzymer utvärderas längden på de erhållna fragmenten med hjälp av gelelektrofores (figur 9).
Eftersom det inte finns några helt identiska mänskliga genom (med undantag för enäggstvillingar) kan skillnaden eller likheten i de resulterande DNA-fragmentens längdprofiler vara en bra markör för både personlig identifiering och släktskapsbestämning.
Den här metoden innebär dock DNA-fragmentering och är därför känslig för kvaliteten och kvantiteten på det ursprungliga genetiska materialet. Det är därför RFLP-analysen inte används i praktiken för närvarande - till skillnad från andra metoder, som kommer att diskuteras nedan.
Analys av antalet tandemrepetitioner i genomet
Tandemrepetitioner är kopior av samma korta DnA-sekvens som upprepas efter varandra [15]. Upprepningar som är av intresse för kriminaltekniker är bland annat loci med ett varierande antal tandemrepetitioner (VNTR) och korta tandemrepetitioner (STR). De kallas också minisatelliter respektive mikrosatelliter.
Kärnan i denna metod är PCR-amplifiering av DNA-fragment som innehåller dessa korta repetitiva sekvenser vars längd är olika hos två slumpmässigt utvalda individer. Efter amplifieringen utvärderas längden på de erhållna fragmenten med hjälp av gelelektrofores eller kapillärelektrofores.
Quantifiler DNA Quantification Kit och QuantStudio-systemet från Termo Fisher Scientific kan användas för detta ändamål. QuantStudio är ett kompakt bänkinstrument med ett brett utbud av funktioner.
Precis som med den tidigare metoden är den viktigaste identifierande faktorn för STR-analysen längden på de erhållna fragmenten, som är unik för varje individ och beror på antalet upprepningar i det analyserade området. STR-analys kännetecknas av hög noggrannhet och hastighet samt låg kostnad. Kvaliteten på det genetiska materialet är ett viktigt villkor för analysen.
Den här metoden innebär dock DNA-fragmentering och är därför känslig för kvaliteten och kvantiteten på det ursprungliga genetiska materialet. Det är därför RFLP-analysen inte används i praktiken för närvarande - till skillnad från andra metoder, som kommer att diskuteras nedan.
Analys av antalet tandemrepetitioner i genomet
Tandemrepetitioner är kopior av samma korta DnA-sekvens som upprepas efter varandra [15]. Upprepningar som är av intresse för kriminaltekniker är bland annat loci med ett varierande antal tandemrepetitioner (VNTR) och korta tandemrepetitioner (STR). De kallas också minisatelliter respektive mikrosatelliter.
Kärnan i denna metod är PCR-amplifiering av DNA-fragment som innehåller dessa korta repetitiva sekvenser vars längd är olika hos två slumpmässigt utvalda individer. Efter amplifieringen utvärderas längden på de erhållna fragmenten med hjälp av gelelektrofores eller kapillärelektrofores.
Quantifiler DNA Quantification Kit och QuantStudio-systemet från Termo Fisher Scientific kan användas för detta ändamål. QuantStudio är ett kompakt bänkinstrument med ett brett utbud av funktioner.
Precis som med den tidigare metoden är den viktigaste identifierande faktorn för STR-analysen längden på de erhållna fragmenten, som är unik för varje individ och beror på antalet upprepningar i det analyserade området. STR-analys kännetecknas av hög noggrannhet och hastighet samt låg kostnad. Kvaliteten på det genetiska materialet är ett viktigt villkor för analysen.
STR-analys dök upp i praktisk rättsmedicin för nästan tjugo år sedan, men är än idag den viktigaste metoden för att identifiera individer. Resultaten av DNA-analyser av misstänkta och brottslingar - genetiska profiler - registreras av kriminologer i särskilda databaser.
När biologiska spår hittas på brottsplatser från vilka DNA kan isoleras har det därför blivit möjligt att identifiera alla personer som redan har uppmärksammats av brottsbekämpande myndigheter. Samma markörer används för att söka efter försvunna personer och för att fastställa faderskap.
När biologiska spår hittas på brottsplatser från vilka DNA kan isoleras har det därför blivit möjligt att identifiera alla personer som redan har uppmärksammats av brottsbekämpande myndigheter. Samma markörer används för att söka efter försvunna personer och för att fastställa faderskap.
I regel tillåter system som är utformade för att identifiera individer analys av flera genomloci (10-24) samtidigt, inklusive amelogeninproteingenen, genom vilken kön bestäms. Amelogeningenen finns på både X- och Y-kromosomen, men skiljer sig i storlek, vilket gör att en persons kön kan bestämmas.
Tack vare användningen av sekvenseringsteknik med hög genomströmning har kriminaltekniken fått ett effektivt verktyg som har öppnat nya möjligheter för samtidig analys av flera platser (loci) i kärn- och mitokondriegenomerna.
En viktig fördel med dessa metoder är möjligheten att särskilja även enäggstvillingar (genom somatiska mutationer), vilket är omöjligt med RFLP- eller STR-analys.
Tack vare användningen av sekvenseringsteknik med hög genomströmning har kriminaltekniken fått ett effektivt verktyg som har öppnat nya möjligheter för samtidig analys av flera platser (loci) i kärn- och mitokondriegenomerna.
En viktig fördel med dessa metoder är möjligheten att särskilja även enäggstvillingar (genom somatiska mutationer), vilket är omöjligt med RFLP- eller STR-analys.
I den andra delen av denna publikation beskrivs hur de ovan beskrivna metoderna kan användas för att identifiera narkotikalaboratorier och narkotikahandlare, och hur du kan förvirra kriminaltekniker genom att sopa igen dina spår.
Läs DEL II
