Sammanfattning.
Att genomföra en studie av proinflammatoriska effekter av mephedrone och identifiering av dess etologiska egenskaper är ett obligatoriskt steg i forskningen om 4-MMC, som anses vara en av de mest populära psykoaktiva substanserna när det gäller rekreationsanvändning. Administrering, transport och koncentration av mephedrone i dess målvävnader beror inte bara på den administrerade dosen utan också på en mängd andra faktorer - distributionen av ämnet, graden och hastigheten på absorptionen, vägen för metabolism och utsöndring. Under hela studien är det viktigt att bestämma hur stor del av substansen som är fördelad i målvävnaderna eller i de biologiska vätskor som den transporteras med, så att man kan ta reda på vilken del av den administrerade substansen som genomgår biotransformation och vilken del som oförändrad kommer in i den systemiska blodcirkulationen. I det prekliniska teststadiet behövs, förutom studier av de viktigaste verkningsmekanismerna, också en omfattande fenotypisk screening, som är nödvändig för en djupgående förståelse av substansens farmakodynamik och biverkningar. En av de viktigaste aspekterna av sådan screening är studier av substansens psykoaktiva egenskaper.
Studiens målsättningar.
1. Att bestämma kognitiva motivations- och beteendemönster hos råttor som administrerats 4-metylmetkatinon.
2. Att studera endotelfunktion genom att utföra vaskulära farmakologiska tester med NO-syntesblockad under ultraljudskontroll av blodflödeshastighet i råttans femoralartär och laser Doppler-flödesmätning av allmän hemodynamik och mikrocirkulationshastighet i medialmuskeln.
3. Att identifiera och utvärdera proinflammatoriska och immunreglerande aktiviteter av 4-metylmetkatinon med hjälp av den formalininducerade tassödemmodellen och NBT-testet.
Material och metoder.
Studien genomfördes på 40 manliga Wistar-råttor som vägde 180-200 g. 4 grupper identifierades: 1) Kontrollgrupp (intakta råttor); 2) Råttor, som administrerades mefedron intraperitonealt var 48:e timme i en dos av 5 mg/kg upplöst i NaCl 0,9-lösning (0,5 ml). 3) Råttor som administrerades mefedron oralt (genom en slang) var 48:e timme i en dos av 5 mg/kg upplöst i NaCl 0,9-lösning (0,5 ml). 4) Råttor som administrerades mefedron intraperitonealt var 48:e timme i en dos av 5 mg/kg upplöst i NaCl 0,9-lösning (0,5 ml) före administrering av formalin för formalininducerad tassödemmodell.
Studiebeskrivning och diskussion.
Bestämning av kognitiva motivations- och beteendemönster hos råttor som administrerats 4-metylmetkatinon. För att uppnå detta mål formulerades följande mål: att bedöma 4-metylmetkatinonpåverkan på nivån av upphetsning, ångest och motståndskraft mot stress hos råttor. För att bestämma det psyko-emotionella tillståndet hos de studerade djuren använde vi ett uppgraderat Hall-testprotokoll, vilket innebär att man placerar ett objekt i en standardiserad arena och registrerar aktivitetsindikatorer med hjälp av mjukvaru- och hårdvarukomplexet PANLAB Harvard Apparatus. Diskreta beteendemässiga handlingar som registrerades med hjälp av mjuk- och hårdvarukomplexet valdes som utvärderingsenheter.
Studien utfördes på 30 råttor (grupp 1, 2 respektive 3). Före försöket hölls djuren i ett laboratorievivarium med 10 individer i en bur, med en okonverterad 12-timmarsregim, vid en rumstemperatur på 22-24 °C och en luftfuktighet på 60%, på en standarddiet. Experimenten utfördes på sommaren. De erhållna resultaten kontrollerades för distributionsnormalitet med hjälp av Shapiro-Wilk-kriteriet och bearbetades med metoder för variationsstatistik med hjälp av Student's t-test och STATISTICA datorprogramvarupaket. Figuren visar schematiskt utformningen av experimentet. Horisontell aktivitet, putsningsreaktion, sökaktivitet, lokomotorisk aktivitet, urinering och defekation registrerades för att bedöma det utforskande beteendet. Försöket utfördes i ett mörkt rum, isolerat från yttre buller och solljus, under perioden 10 till 14 timmar. Det öppna fältet var en kvadratisk yta på 150x150 cm i storlek med 30 cm höga sidor. Temperaturen i rummet hölls på 23 grader Celsius. Efter varje djur desinficerades det öppna fältet för deodorisering. Före studien av varje grupp släpptes ett djur noll ut på det öppna fältet.
På dag 21 togs råttorna bort från experimentet. Efter anestesi av råttor utfördes isolering av den högra halspulsådern på en fast plattform, den mediala lårmuskeln exponerades och den vänstra lårvenen kateteriserades. Multikomponentstudien av hemodynamiska parametrar undersöktes med metoden för specialiserade provokationstester som involverade administrering av acetylkolin och natriumnitroprussid (NO) i femoralkatetern. Parametrarna (systoliskt blodtryck, diastoliskt blodtryck, hjärtfrekvens) registrerades med hjälp av en TDS-sensor. Sensorn installerades över den mellersta tredjedelen av höger lårbensartär och följande indikatorer registrerades: maximal systolisk (VS) och diastolisk (VD) hastighet, genomsnittlig (QAs) och volymetrisk (QAM) blodflödeshastighet, pulsationsindex (PL, Gosling-index) och resistivitetsindex (RI, Pourcelot-index). För att mäta blodkropparnas hastighet i kärlen i mikrocirkulationsbädden användes en nålformad probesensor som placerades i den nedre tredjedelen av den mediala breda lårmuskeln. Vasoaktiva medel (acetylkolin - 40 mcg/kg, natriumnitroprussid - 30 mcg/kg) injicerades genom en kateter som sattes in i vänster femoralven sekventiellt med 15 minuters intervall. Således fanns det en möjlighet till parallell övervakning av hemodynamiska och mikrocirkulationsparametrar i ett system med tre nivåer (central cirkulation - elastiskt kärlsystem - perifert kärlsystem). Statistisk bearbetning av resultaten utfördes med hjälp av programvaran STATISTICA 10. Därefter beräknades koefficienten för endotelial dysfunktion (QED). Den statistiska analysen utfördes med Spearmans rangtest, tillförlitlighetsberäkningen mellan grupperna utfördes med hjälp av Students parametriska t-test.
Diagrammen som presenteras visar att mefedronpåverkan på djurbeteende motsvarar dess huvudeffekter, associerade med dess kända verkningsmekanism. Så diagram 1 illustrerar en signifikant ökning av horisontell motorisk aktivitet jämfört med kontrollgruppen. Diagram 2 visar att grooming-handlingar minskas avsevärt. Detta fenomen orsakas av en minskning av motivationsinflytandet med avseende på det nuvarande behovet. Diagram 3 visar tydligt en ökning av defekations- och urineringshandlingar, vilket är en av de vanligaste effekterna av intag av 4-mmc. En ökning av horisontell aktivitet kan tyda på ångestdämpande, anxiogena eller agiterande effekter eller en ökning av motorisk aktivitet utan känslomässig komponent (motorisk upphetsning). Grooming-reaktioner kan också tolkas tvetydigt, eftersom frekvensen av grooming-handlingar ökar både i en stressande och i en gynnsam miljö. Manifestationerna av utforskande aktivitet, liksom frekvensen av urineringar och defekationer, kan tolkas mest entydigt. Med hjälp av denna algoritm kan man dra slutsatsen att den farmakodynamiska effekten avseende högre nervaktivitet kan tolkas som motorisk upphetsning med en känslomässig komponent.
Kontrollgruppen uppvisade samma typ av svar på införandet av ACH och NO, vilket manifesterades som en minskning av systoliskt, diastoliskt och medelblodtryck, en minskning av den linjära hastigheten för mikrocirkulationen, liksom den diastoliska hastigheten för blodets rörelse i lårbensartären (nedan FA), (dataindikatorer - Vd, Vad); 2) en ökning av den systoliska hastigheten för blodets rörelse i FA (VS, Vas), Purcello och Gosling index. Parametrarna återgick till sina ursprungliga värden inom 2 minuter.
Ytterligare statistisk bearbetning utfördes vid bestämning av ett antal värden över tiden för varje prov, vilka uttrycktes i procent. Spearmans kriterium, som användes för statistisk analys, visade det bästa uttrycket för den nödvändiga skillnaden i statistiskt viktiga parametrar. Den högsta graden av korrelation (p<0,05) fastställdes mellan indexet för medelartärtrycket (nedan kallat MAD), mikrocirkulationens linjära hastighet, systolisk hastighet och systolisk-diastolisk hastighetsskillnad i lårbensartären. Andra sonografiska parametrar uppvisade en låg och mindre tillförlitlig korrelation med dynamiken i blodtryck och mikrocirkulationshastighet. En studie av oralt administrerad 4-mmc visade en statistiskt signifikant ökning av indikatorerna för SAD, DAD och koefficienten för endotelial dysfunktion (QED) jämfört med kontrollgruppen. Indikatorerna för maximal systolisk (VS) och maximal diastolisk hastighet (VD) reduceras signifikant under provokationstester hos råttor i grupp 3, där mefedron administrerades oralt.
Effekten av endotelberoende relaxationsfaktorer som frigörs och aktiveras genom administrering av acetylkolin reduceras kvantitativt och kvalitativt. Den NO-medierade effekten som svar på ACH-provokationstestet minskar på grund av den negativa effekten av 4-mmc på produktionen och uttrycket av både denna faktor och aktiviteten hos guanylatcyklas. ACH-inducerad endotelberoende relaxation av mikrocirkulationskärlen, medierad genom muskarinreceptorer, störs också på grund av degenerering av receptoraktiviteten och även på grund av en minskning av receptortätheten på endoteliocyternas yta. Det är troligt att mekanismen för att minska den ACH-medierade endotelberoende reaktionen som svar på mefedronanvändning orsakas av en betydande ökning av bildandet av fria radikaler (både superoxid och hydroxyl) i cellens hypoxiska tillstånd, som interagerar med NO2 och NO3.
Det fanns en statistiskt signifikant minskning av den metaboliska aktiviteten hos neutrofiler med 38,4% (Me = 13,1 med ett interkvartilområde från 10,3 till 15,9 med en skillnad på 5,3 vid p = 0,002; z = 3,008) jämfört med indikatorerna för kontrollgruppen. I studien av absorptionskapaciteten för fagocytos med tillsats av latex ökade indikatorerna från 13,1 Me till 16,5 Me, med en procentuell ökning på 18,2% för grupp 3 (intraperitoneal administrering), men den procentuella skillnaden jämfört med kontrollgruppen är 18,0%, vilket är ett signifikant och statistiskt tillförlitligt bevis på immunosuppressiv verkan. Dessutom konstaterades en statistiskt signifikant minskning av spontan fagocytos i grupp 3, som minskade med 25,3% (vid p>0,0001, z=2,84) jämfört med intakta djur.
Att genomföra en studie av proinflammatoriska effekter av mephedrone och identifiering av dess etologiska egenskaper är ett obligatoriskt steg i forskningen om 4-MMC, som anses vara en av de mest populära psykoaktiva substanserna när det gäller rekreationsanvändning. Administrering, transport och koncentration av mephedrone i dess målvävnader beror inte bara på den administrerade dosen utan också på en mängd andra faktorer - distributionen av ämnet, graden och hastigheten på absorptionen, vägen för metabolism och utsöndring. Under hela studien är det viktigt att bestämma hur stor del av substansen som är fördelad i målvävnaderna eller i de biologiska vätskor som den transporteras med, så att man kan ta reda på vilken del av den administrerade substansen som genomgår biotransformation och vilken del som oförändrad kommer in i den systemiska blodcirkulationen. I det prekliniska teststadiet behövs, förutom studier av de viktigaste verkningsmekanismerna, också en omfattande fenotypisk screening, som är nödvändig för en djupgående förståelse av substansens farmakodynamik och biverkningar. En av de viktigaste aspekterna av sådan screening är studier av substansens psykoaktiva egenskaper.
Studiens målsättningar.
1. Att bestämma kognitiva motivations- och beteendemönster hos råttor som administrerats 4-metylmetkatinon.
2. Att studera endotelfunktion genom att utföra vaskulära farmakologiska tester med NO-syntesblockad under ultraljudskontroll av blodflödeshastighet i råttans femoralartär och laser Doppler-flödesmätning av allmän hemodynamik och mikrocirkulationshastighet i medialmuskeln.
3. Att identifiera och utvärdera proinflammatoriska och immunreglerande aktiviteter av 4-metylmetkatinon med hjälp av den formalininducerade tassödemmodellen och NBT-testet.
Material och metoder.
Studien genomfördes på 40 manliga Wistar-råttor som vägde 180-200 g. 4 grupper identifierades: 1) Kontrollgrupp (intakta råttor); 2) Råttor, som administrerades mefedron intraperitonealt var 48:e timme i en dos av 5 mg/kg upplöst i NaCl 0,9-lösning (0,5 ml). 3) Råttor som administrerades mefedron oralt (genom en slang) var 48:e timme i en dos av 5 mg/kg upplöst i NaCl 0,9-lösning (0,5 ml). 4) Råttor som administrerades mefedron intraperitonealt var 48:e timme i en dos av 5 mg/kg upplöst i NaCl 0,9-lösning (0,5 ml) före administrering av formalin för formalininducerad tassödemmodell.
Studiebeskrivning och diskussion.
Bestämning av kognitiva motivations- och beteendemönster hos råttor som administrerats 4-metylmetkatinon. För att uppnå detta mål formulerades följande mål: att bedöma 4-metylmetkatinonpåverkan på nivån av upphetsning, ångest och motståndskraft mot stress hos råttor. För att bestämma det psyko-emotionella tillståndet hos de studerade djuren använde vi ett uppgraderat Hall-testprotokoll, vilket innebär att man placerar ett objekt i en standardiserad arena och registrerar aktivitetsindikatorer med hjälp av mjukvaru- och hårdvarukomplexet PANLAB Harvard Apparatus. Diskreta beteendemässiga handlingar som registrerades med hjälp av mjuk- och hårdvarukomplexet valdes som utvärderingsenheter.
Studien utfördes på 30 råttor (grupp 1, 2 respektive 3). Före försöket hölls djuren i ett laboratorievivarium med 10 individer i en bur, med en okonverterad 12-timmarsregim, vid en rumstemperatur på 22-24 °C och en luftfuktighet på 60%, på en standarddiet. Experimenten utfördes på sommaren. De erhållna resultaten kontrollerades för distributionsnormalitet med hjälp av Shapiro-Wilk-kriteriet och bearbetades med metoder för variationsstatistik med hjälp av Student's t-test och STATISTICA datorprogramvarupaket. Figuren visar schematiskt utformningen av experimentet. Horisontell aktivitet, putsningsreaktion, sökaktivitet, lokomotorisk aktivitet, urinering och defekation registrerades för att bedöma det utforskande beteendet. Försöket utfördes i ett mörkt rum, isolerat från yttre buller och solljus, under perioden 10 till 14 timmar. Det öppna fältet var en kvadratisk yta på 150x150 cm i storlek med 30 cm höga sidor. Temperaturen i rummet hölls på 23 grader Celsius. Efter varje djur desinficerades det öppna fältet för deodorisering. Före studien av varje grupp släpptes ett djur noll ut på det öppna fältet.
På dag 21 togs råttorna bort från experimentet. Efter anestesi av råttor utfördes isolering av den högra halspulsådern på en fast plattform, den mediala lårmuskeln exponerades och den vänstra lårvenen kateteriserades. Multikomponentstudien av hemodynamiska parametrar undersöktes med metoden för specialiserade provokationstester som involverade administrering av acetylkolin och natriumnitroprussid (NO) i femoralkatetern. Parametrarna (systoliskt blodtryck, diastoliskt blodtryck, hjärtfrekvens) registrerades med hjälp av en TDS-sensor. Sensorn installerades över den mellersta tredjedelen av höger lårbensartär och följande indikatorer registrerades: maximal systolisk (VS) och diastolisk (VD) hastighet, genomsnittlig (QAs) och volymetrisk (QAM) blodflödeshastighet, pulsationsindex (PL, Gosling-index) och resistivitetsindex (RI, Pourcelot-index). För att mäta blodkropparnas hastighet i kärlen i mikrocirkulationsbädden användes en nålformad probesensor som placerades i den nedre tredjedelen av den mediala breda lårmuskeln. Vasoaktiva medel (acetylkolin - 40 mcg/kg, natriumnitroprussid - 30 mcg/kg) injicerades genom en kateter som sattes in i vänster femoralven sekventiellt med 15 minuters intervall. Således fanns det en möjlighet till parallell övervakning av hemodynamiska och mikrocirkulationsparametrar i ett system med tre nivåer (central cirkulation - elastiskt kärlsystem - perifert kärlsystem). Statistisk bearbetning av resultaten utfördes med hjälp av programvaran STATISTICA 10. Därefter beräknades koefficienten för endotelial dysfunktion (QED). Den statistiska analysen utfördes med Spearmans rangtest, tillförlitlighetsberäkningen mellan grupperna utfördes med hjälp av Students parametriska t-test.
Diagrammen som presenteras visar att mefedronpåverkan på djurbeteende motsvarar dess huvudeffekter, associerade med dess kända verkningsmekanism. Så diagram 1 illustrerar en signifikant ökning av horisontell motorisk aktivitet jämfört med kontrollgruppen. Diagram 2 visar att grooming-handlingar minskas avsevärt. Detta fenomen orsakas av en minskning av motivationsinflytandet med avseende på det nuvarande behovet. Diagram 3 visar tydligt en ökning av defekations- och urineringshandlingar, vilket är en av de vanligaste effekterna av intag av 4-mmc. En ökning av horisontell aktivitet kan tyda på ångestdämpande, anxiogena eller agiterande effekter eller en ökning av motorisk aktivitet utan känslomässig komponent (motorisk upphetsning). Grooming-reaktioner kan också tolkas tvetydigt, eftersom frekvensen av grooming-handlingar ökar både i en stressande och i en gynnsam miljö. Manifestationerna av utforskande aktivitet, liksom frekvensen av urineringar och defekationer, kan tolkas mest entydigt. Med hjälp av denna algoritm kan man dra slutsatsen att den farmakodynamiska effekten avseende högre nervaktivitet kan tolkas som motorisk upphetsning med en känslomässig komponent.
Kontrollgruppen uppvisade samma typ av svar på införandet av ACH och NO, vilket manifesterades som en minskning av systoliskt, diastoliskt och medelblodtryck, en minskning av den linjära hastigheten för mikrocirkulationen, liksom den diastoliska hastigheten för blodets rörelse i lårbensartären (nedan FA), (dataindikatorer - Vd, Vad); 2) en ökning av den systoliska hastigheten för blodets rörelse i FA (VS, Vas), Purcello och Gosling index. Parametrarna återgick till sina ursprungliga värden inom 2 minuter.
Ytterligare statistisk bearbetning utfördes vid bestämning av ett antal värden över tiden för varje prov, vilka uttrycktes i procent. Spearmans kriterium, som användes för statistisk analys, visade det bästa uttrycket för den nödvändiga skillnaden i statistiskt viktiga parametrar. Den högsta graden av korrelation (p<0,05) fastställdes mellan indexet för medelartärtrycket (nedan kallat MAD), mikrocirkulationens linjära hastighet, systolisk hastighet och systolisk-diastolisk hastighetsskillnad i lårbensartären. Andra sonografiska parametrar uppvisade en låg och mindre tillförlitlig korrelation med dynamiken i blodtryck och mikrocirkulationshastighet. En studie av oralt administrerad 4-mmc visade en statistiskt signifikant ökning av indikatorerna för SAD, DAD och koefficienten för endotelial dysfunktion (QED) jämfört med kontrollgruppen. Indikatorerna för maximal systolisk (VS) och maximal diastolisk hastighet (VD) reduceras signifikant under provokationstester hos råttor i grupp 3, där mefedron administrerades oralt.
Effekten av endotelberoende relaxationsfaktorer som frigörs och aktiveras genom administrering av acetylkolin reduceras kvantitativt och kvalitativt. Den NO-medierade effekten som svar på ACH-provokationstestet minskar på grund av den negativa effekten av 4-mmc på produktionen och uttrycket av både denna faktor och aktiviteten hos guanylatcyklas. ACH-inducerad endotelberoende relaxation av mikrocirkulationskärlen, medierad genom muskarinreceptorer, störs också på grund av degenerering av receptoraktiviteten och även på grund av en minskning av receptortätheten på endoteliocyternas yta. Det är troligt att mekanismen för att minska den ACH-medierade endotelberoende reaktionen som svar på mefedronanvändning orsakas av en betydande ökning av bildandet av fria radikaler (både superoxid och hydroxyl) i cellens hypoxiska tillstånd, som interagerar med NO2 och NO3.
Det fanns en statistiskt signifikant minskning av den metaboliska aktiviteten hos neutrofiler med 38,4% (Me = 13,1 med ett interkvartilområde från 10,3 till 15,9 med en skillnad på 5,3 vid p = 0,002; z = 3,008) jämfört med indikatorerna för kontrollgruppen. I studien av absorptionskapaciteten för fagocytos med tillsats av latex ökade indikatorerna från 13,1 Me till 16,5 Me, med en procentuell ökning på 18,2% för grupp 3 (intraperitoneal administrering), men den procentuella skillnaden jämfört med kontrollgruppen är 18,0%, vilket är ett signifikant och statistiskt tillförlitligt bevis på immunosuppressiv verkan. Dessutom konstaterades en statistiskt signifikant minskning av spontan fagocytos i grupp 3, som minskade med 25,3% (vid p>0,0001, z=2,84) jämfört med intakta djur.
- När mephedrone administrerades till försöksdjur registrerades en statistiskt signifikant förändring av de analyserade beteendehandlingarna. Detta faktum indikerar förekomsten av specifik psykotropisk aktivitet av denna förening associerad med alltför förhöjda nivåer av upphetsning och ångest, dock med minskad motståndskraft mot stress. Således utvidgade studieresultaten i detta skede informationen om profilen för den sammansatta åtgärden. De observerade psykotropa effekterna av 4-mmc fördjupar förståelsen för dess farmakologiska aktivitet och bör vara föremål för ytterligare studier.
- Ihållande förhöjda blodtrycksparametrar i de ursprungliga tillstånden för råttor i grupp 3 (mephedrone), liksom deras relativa indikatorer efter provokationstester, orsakas av en störning inte bara i uttrycket av NO (en av de viktigaste vasodilaterande faktorerna som reglerar arbetet i mikrocirkulationskärl), utan också prostacykliner och endoteliala hyperpolariseringsfaktorer (EDHF). Studieresultaten i detta skede bekräftade det teoretiska antagandet om den överdrivna negativa effekten av mephedrone på både endotelet i mikrocirkulationskärlen och på livskraften i det kardiovaskulära systemet som helhet. De erhållna uppgifterna kan användas vid planering av prekliniska studier för att utöka spektrumet av komplikationer i samband med användning av 4-mmc, samt för att bygga en algoritm med kliniska rekommendationer för farmakologisk korrigering av dessa komplicerade tillstånd.
- Med hänsyn till att mefedron sannolikt minskar cellväggens perfusionspermeabilitet och proteinernas transportfunktion, påverkar både passiv och underlättad diffusion och aktiv transport, påverkar kognitiva mönster på ett visst sätt (inklusive fördröjda fenomen) och också har förmågan att påverka koagulationskomponenten i hemostasen positivt (hyperkoagulation), kan det antas att COX-2-aktivitet dominerar som det huvudsakliga enzym som spelar en roll vid induktionen av den alternativa inflammationsfasen. Således är användningen av selektiva COX-2-hämmare för behandling av inflammatoriska sjukdomar hos patienter som använder 4-mmc den mest föredragna och motiverade. För en exakt definition av den farmakologiska behandling som syftar till att lindra de inflammatoriska processer som är förknippade med användning av 4-mmc krävs dock ytterligare prekliniska studier.
- Resultaten från det tredje steget i studien visade en minskning av neutrofilernas metaboliska och absorptionsaktivitet hos råttor som tillhörde grupp 3 (intraperitoneal administrering av 4-mmc) jämfört med indikatorerna för djur i kontrollgruppen. Detta definierar mefedron som en substans som har immunsuppressiv effekt. Denna slutsats är grunden för ytterligare studier om patogenetisk korrigerande immunterapi.
Last edited by a moderator: